文摘
恶性黑色素瘤的chemotherapeutical治疗是非常有限的,全球高致命性疾病发生。天然产品来源于中药甘草的吸引力在探索新的治疗方法由于其抗肿瘤的活动。一个新的饮食类黄酮isoliquiritigenin (ISL)因此调查鉴定其anti-melanoma活动在本研究小鼠黑色素瘤B16F0细胞。使用体外生化和自由基生物学实验,我们发现pro-differentiated ISL的概要文件和评估的作用活性氧(ROS)在B16F0细胞分化。数据显示一个强大和ISL暴露剂量反应关系的特点B16F0分化的形态变化和杀菌作用。积累的细胞间ROS在接触是必要的支持ISL-induced分化,这是证明额外的氧化还原调节器。进一步证实了调制杀菌作用的酶和基因的相对活动ISL-treatments有或没有ROS调节器。ISL-treated细胞的致瘤性明显是有限的使用集落形成试验分别在体外和体内动物模型试验。我们的研究表明,isoliquiritigenin differentiation-inducing剂,包括活性氧积累促进黑素原生成及其机制。
1。介绍
黑色素瘤是最激进的皮肤癌(1]。鼠标黑色素瘤细胞系,B16转椅,隔绝C57BL / 6小鼠,通常是用作细胞分化模型。upregulation黑色素生物合成和诱导树突扩展是典型的黑色素瘤细胞分化特征。一些研究表明B16转椅细胞的分化为成熟melanocyte-like细胞通过感应α-melanocytestimulating激素(2),信号转导通路抑制剂(3,4),mannosylerythritol脂质(5),和维甲酸治疗(6]。黑色素瘤细胞的分化成一个终端分化阶段将是一个有效的策略在预防死亡引起的黑色素瘤。
活性氧(ROS)在细胞分化[发挥至关重要的作用7]。活性氧对细胞在高浓度有毒,但作为细胞内第二信使在亚致死浓度,导致各种基因的转录激活,包括细胞增殖和分化。(reduction-oxidation)氧化还原状态也起着重要的作用在调节细胞分化[8]。一些证据有效的氧化剂和抗氧化剂的作用建立了化疗药物(9,10]。
Isoliquiritigenin (ISL),饮食在甘草黄酮类,展示各种各样的生物活性,包括抗氧化,抗炎,chemopreventive和抗肿瘤活动11- - - - - -14]。ISL抑制细胞增殖和诱导海拉细胞凋亡增加细胞内ROS水平(15]。它还诱导细胞分化和减少ROS水平HL-60细胞(16]。然而,ROS在ISL-induced细胞分化中的作用尚未完全了解。
本研究旨在调查ISL的影响B16F0细胞的增殖和分化。活性氧的作用形成也探讨在B16F0 ISL-induced分化细胞。此外,抗氧化剂的prooxidative方面强调为临床治疗提供理论依据。
2。方法
2.1。试剂
Isoliquiritigenin (ISL,纯度≥98%)从江西购买草药天宫科技有限公司有限公司(江西,中国)。培养基(RPMI 1640), 2, 7-dichlorodihydro-fluorescein二乙酸(DCFH-DA)、二甲亚砜(DMSO), 3 - (4 5-dimethylthiazol-2-yl) 2, 5-diphenyl溴化四唑(MTT),左旋多巴(左旋多巴)Phenylmethanesulfonyl氟化物(PMSF) N-acetyl-L-cysteine (NAC)和L-buthionine——(S, R) sulfoximine (BSO)从西格玛化工有限公司购买(圣路易斯,密苏里州,美国)。胎牛血清(的边后卫)是购自天津郝阳生物制造有限公司,有限公司(天津)。布拉德福德蛋白质定量工具和RNA提取工具包是购自上海Sangong有限公司有限公司(上海,中国)。合成第一链cdna工具包和互补脱氧核糖核酸扩增设备买来Formentas有限公司有限公司(立陶宛维尔纽斯)。青霉素和链霉素是来自山东日出药业有限公司,有限公司(淄博,中国)。所有其他化学物质的分析品位和商业应用。
2.2。细胞系,细胞培养
B16F0细胞从中国购买类型文化中心集合(CCTCC,武汉,中国)。这些细胞被维护在RPMI 1640中补充10%胎牛血清和100 U / mL青霉素,100μg / mL链霉素在37°C公司为5%2。每2天细胞分裂和每个实验之前稀释1天。
2.3。细胞生存能力分析
细胞生存能力是衡量使用3 - (4 5-dimethylthiazol-2-yl) 2, 5-diphenyl-tetrazolium溴化(MTT)试验17]。细胞被短暂使胰蛋白酶化,去籽96 -孔板细胞/好,proincubated 24 h治疗之前。此后,细胞暴露于不同浓度ISL作为显示在图1(一)24小时和48 h。媒介是孵化后,包含10和新鲜培养基μL(5毫克/毫升MTT补充道。中4 h后被删除,取而代之的是蓝色甲瓒晶体溶解在100年μL二甲亚砜。吸光度在570纳米测量使用标(3001年热Varioskan Flash,美国)。细胞抑制率计算×100%(对照组实验组值−值)/对照组的值。
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2.4。形态变化分析
形态变化B16F0相差显微镜下观察细胞配备数码相机48 h后孵化与不同ISL浓度作为显示在图1 (b)(Axio观察者、蔡司、德国)。数字图像在倒置显微镜下观察得到400 x放大。黑色素的原始积累ISL治疗记录通过传播在200 x光图像放大(图2(一个))。
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2.5。集落形成实验
B16F0细胞治疗或没有ISL被播种在低密度(100细胞/)在个别井标准6-well板和罗斯威尔公园里种植了10天纪念研究所1640年媒介。殖民地被结晶紫染色,计算可视化。数字图像6-well板,和集落形成效率计算。集落形成效率% =数量的殖民地/数量的种子细胞(18]。
2.6。黑色素含量评估
细胞外和细胞内黑色素含量测定根据先前描述的方法(19]。浓度与ISL孵化后表示,在图1 (c)48 h, B16F0细胞和上层清液单独收集。1毫升每0.4 mol / L 2 - [4 - (2-hydroxyethyl) piperazin-1-yl] ethanesulfonic酸缓冲(pH值6.8)和EtOH (9: 1, v / v)加入1毫升的媒介。光密度测量在405 nm量化细胞外使用校准曲线从黑色素合成黑色素的解决方案。收集的细胞被胰蛋白酶化,颗粒状,洗两次磷酸盐(PBS)和消化在1毫升1 N氢氧化钠溶液在80°C 1 h管。如上所述测量细胞内的黑色素。
2.7。酪氨酸酶测定(酪氨酸)活动
酪氨酸活动被测量的l - 3,化验4-dihydroxyphenylalanine(左旋多巴)氧化酶活动使用先前描述的方法(20.]。B16F0细胞,治疗ISL表示浓度和持续时间,如图2 (b)细胞溶解和冰冷的PBS洗两次,50 mM钠磷酸盐缓冲剂(pH值6.8)包含1% Triton x - 100和phenylmethylsulfonyl氟化物(0.1毫米),和冷冻30分钟的−80°C。随后分析了spectrophotometrically酪氨酸活动。dopachrome浓度在反应混合物以475海里(3001年热Varioskan Flash,美国)。包含140的反应混合物μ我刚做好的底物溶液(0.1%左旋多巴在0.1 M磷酸钠,pH值6.0)和70年μL酶解决方案是孵化在37°C。吸光度的变化测量第一2 h的反应(即。吸光度),在线性增加。修正了左旋多巴的自动氧化作用的控制。酪氨酸酶(酪氨酸)活动规范化对样品的蛋白质含量,确定使用商业布拉德福德分析工具包(Sangong有限公司中国上海)。
2.8。评价酪氨酸、Trp1 Trp2基因表达式
细胞总RNA被隔离使用商业套装(Sangong有限公司中国上海)。RNA质量测试使用A260 / A280比和1.5%琼脂糖凝胶电泳。互补脱氧核糖核酸的合成进行了使用Moloney小鼠白血病病毒逆转录酶合成第一链cDNA工具包(Formentas维尔纽斯,立陶宛)。互补脱氧核糖核酸合成系统是根据制造商的指示执行。放大了合成cDNA Olig (dT)18根据指令通过PCR扩增的工具包(Formentas维尔纽斯,立陶宛)。互补脱氧核糖核酸也用于逆转录PCR (RT)利用酪氨酸和TYR-related蛋白质和TRP-1 TRP-2, (21]。PCR引物的(由Sangon有限公司合成)和循环条件如(表示1)。12.5建立了反应条件μL 2×PCR大师(Sangong有限公司中国上海)3μL cDNA模板,和0.5μ每个引物L。rt - pcr产品量化通过测量每个乐队使用GelPro强度分析软件。结果表示为每个乐队的强度比GADPH带的强度。
2.9。致瘤性实验
雄性C57BL / 6小鼠(6周,8周大,重18 g 22 g)是来自新疆医科大学实验动物中心(新疆乌鲁木齐)。后B16F0黑色素瘤细胞治疗15μg / mL ISL 48 h,200年可行B16F0细胞μL培养基接种南卡罗来纳州的老鼠。老鼠被颈椎脱位牺牲后10天ISL-treated B16F0细胞由注入。在实验结束时,老鼠牺牲动物福利机构的指导方针。肿瘤被孤立,体重,和图片。肿瘤抑制率计算如下。肿瘤抑制率(%)=(未经处理的重量B16F0−形成肿瘤的重量ISL-treated B16F0肿瘤形成)/未经处理的重量B16F0肿瘤形成×100%22]。
2.10。活性氧的检测
如前所述(发现了活性氧23]。细胞(细胞/)被播种在96孔板和孵化24小时在37°C。适当的药物浓度增加孵化后一式四份。细胞培养进一步为2 h。2, 7-Dichlorodihydrofluorescein二乙酸(DCFH-DA)然后添加在最后30的浓度μM和孵化了40分钟。荧光在485 nm激发阅读,使用荧光板535海里排放读者(3001年热Varioskan Flash,美国)。ISL-induced活性氧积累在细胞也记录了使用荧光显微镜(Axio观察者、蔡司、德国)400 x放大。每个治疗组获得了超过10000的单个细胞。
3所示。结果
3.1。ISL抑制B16F0细胞的增殖
ISL的影响细胞增殖测定使用MTT测定24 h或48 h后曝光。显著的浓度——时间减少细胞增殖观察(图1(一))。细胞抑制率范围从18%到79%和35%到91%在24和48 h (ISL)治疗(5、10、15、20、25μ分别g / mL)。
3.2。ISL诱导树突B16F0细胞形态学变化
在图的图像1 (b)显示浓度降低细胞密度ISL-treated组。此外,一个明确的形态变化是观察到ISL-treated细胞。ISL治疗诱导dendrite-like预测产生的星形细胞的形成与圆形的未经处理的细胞的形态。这些影响与ISL浓度增加更明显。
3.3。ISL刺激黑色素的生物合成
黑色素细胞的内容在每个治疗测量探讨脱色ISL B16转椅细胞的活性。细胞外(图1 (c))和胞内(图1 (d))经过15 B16F0细胞的黑色素含量大大增加μg / mL ISL刺激。此外,ISL-stimulated杀菌作用浓度依赖性。细胞外的黑色素增加从13.699μ克/ 10619.567细胞μ克/ 106细胞黑素瘤细胞培养48 h ISL-containing媒介。5μg / mL和10μg / mL ISL治疗轻微增加黑色素细胞外的内容。然而,没有发现显著差异比较与控制(图1 (c))。然而,细胞内黑色素含量显著增加了双重的比控制48 h后孵化15μg / mL ISL(图1 (d))。
促进黑色素生产是显而易见的图像如图2(一个)。黑色素颗粒数量的增加在ISL治疗。此外,形态ISL-treated B16F0细胞表现出epithelial-like结构。
3.4。ISL增加酪氨酸活动
酪氨酸活性显著增加48 h后治疗15μg / mL ISL相比与控制(图2 (b))。最大增强酪氨酸活动观察48 h后治疗15μ14.1 g / mL ISL(单位/毫克蛋白控制,25.2户/毫克蛋白治疗组,)。
3.5。ISL对Melanin-Biosynthetic基因的mRNA表达的影响
melanogenesis-related蛋白质的mRNA水平包括酪氨酸,TRP-1, TRP-2 B16F0细胞测定酪氨酸ISL接触进一步澄清后激活机制引起ISL(图2 (c))。酪氨酸的mRNA表达增加10μ克/毫升()和15μ克/毫升(职责)。ISL组,如图2 (d)。然而,所有治疗组的血压TRP-1和TRP-2表情略有下降但没有显著差异()。
3.6。ISL抑制集落形成
B16F0细胞的克隆形成后检查15μg / mL ISL治疗。6-well板的照片从一个代表性的实验图所示3(一个)。未经处理的B16F0细胞生成的数量意味着较高的肿瘤球镀时的密度比15 100细胞/好μg / mL ISL-treated组(图3 (b))。
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最大或最小的殖民地在照片显示使用一个倒置显微镜放大200倍(图3 (c))。集落形成的一个明显变化ISL-treated B16F0细胞观察。细胞治疗组比未经处理的B16F0细胞小得多,不管在最大或最小的殖民地。此外,许多细胞不能形成15后殖民地μg / mL ISL治疗。
3.7。ISL预处理减少B16F0细胞体内致瘤性
无显著差异,观察肿瘤体积在荷瘤和空白的向量。ISL-treated组平均肿瘤直径和重量明显小于空白向量组()。ISL-treated组的肿瘤抑制率是29.6%,空白的向量组(图3 (d))。
3.8。ISL增加细胞内活性氧的形成
荧光探针DCFH-DA是用来测量ISL的影响细胞内ROS水平B16F0细胞。ISL治疗显著增加细胞内ROS水平B16F0细胞浓度的方式,如图4(一)。之间的一个显著差异是观察到10μ克/毫升()和15μ克/毫升()ISL-treated组和对照组。15μg / mL ISL-treated组比对照组增加约两个。荧光强度与ISL孵化后(15μg / mL 48 h)与基础水平显著高于未经处理的对照组(图4(一))。DCFH-DA染色清楚地说明在所有情况下都存在相同的细胞群。因此,荧光强度的ISL-mediated促销是显而易见的。
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3.9。角色的ROS ISL-Induced树突B16F0细胞的形态学变化
鉴于增加细胞内ROS水平与ISL-induced细胞分化、细胞氧化还原状态调节器被添加到确定ROS对ISL-induced分化的干扰的影响。ROS生产抑制抗氧化N-acetyl-cysteine预处理(南京,200年μ米),半胱氨酸的前兆,是提升prooxidant预处理L-buthionine - (S, R) sulfoximine (BSO), 200μ米)、谷胱甘肽(GSH)合成酶抑制剂。所有这些氧化还原调节器的方法被2 h ISL治疗之前,试剂都可以使用导致基底细胞生长水平无显著影响。
两个氧化还原状态调节器是用来检测活性氧的影响形成ISL-induced形态变化和理解ROS在ISL-induced细胞分化的作用。值得注意的是,并没有显著的效果在B16F0细胞形态学观察接受治疗与南汽和BSO孤单。然而,ISL-induced树突形态变化与南汽的预处理,但缓解与BSO增强预处理。增加黑色素颗粒也可以观察(图4 (b))。
3.10。ROS对黑色素生产ISL-Treated B16F0细胞
ROS可能与细胞外形成黑色素的分泌和细胞内黑色素的合成。南汽的影响或BSO对黑色素生产B16F0 ISL-induced细胞分化过程中细胞研究来验证这种可能性。中给出的结果数据4 (c)和4 (d)表明,细胞外和细胞内黑色素水平下ISL治疗调节的预处理BSO但耗尽与南汽的预处理。
3.11。ROS对黑色素生物合成基因的mRNA表达ISL-Treated B16F0细胞
南汽或BSO用于容纳氧化还原状态澄清ROS的影响形成黑色素生物合成基因表达在ISL-treated B16F0细胞。南汽的影响或独自BSO处理酪氨酸,TRP-1和TRP-2 mRNA内容显示与控制相比无显著差异(数据没有显示)。然而,酪氨酸mRNA的表达减少NAC + ISL-treated预处理组,但增加在BSO进行预处理,再加上ISL相比治疗组与ISL-treated只有集团()。TRP-1 mRNA表达被预处理与南汽或BSO调节(),而TRP-2 mRNA表达略有减少BSO——ISL-treated预处理组。然而,观察无显著差异()(数据5(一个)和5 (b))。
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4所示。讨论
连续分裂和常数乘法是恶性肿瘤的基本特征。因此,增殖的抑制作用和体外或体内致瘤性的一个重要评价诱导分化。形态变化与树突分枝和杀菌作用被认为是特定分化标记B16F0细胞(24]。酪氨酸活性和黑色素含量是众所周知的黑色素瘤细胞分化的分子标记25,26]。酪氨酸在控制杀菌作用是非常重要的。黑色素含量与酪氨酸活性与蛋白质水平(但不27]。
ISL显著抑制B16F0细胞系的增殖。ISL治疗后观察形态学变化,诱导树突的形成预测,给了星状细胞与圆形的未经处理的细胞的形态。ISL治疗黑色素生产和调节酪氨酸活动增加和mRNA的表达。ISL的大小和数目显著减少殖民地形成体外,体内细胞的致瘤性。所有结果表明降低恶性特征与ISL B16F0细胞治疗和增加细胞normalization-related属性。所有这些变化表明B16F0细胞趋于正常化并确认ISL诱发再分化和刺激降级B16F0细胞的恶性表型。
的细胞内ROS水平B16F0细胞ISL曝光后显著增加。细胞内ROS水平的调制BSO NAC促进和抑制B16F0细胞分化,分别。BSO促进活性氧含量高,消耗减少谷胱甘肽(28]。然而,NAC提高谷胱甘肽水平,进行细胞内ROS,防止细胞凋亡的起始29日]。进一步的实验表明,ISL结合南汽减少ROS和抑制细胞分化,而ISL结合BSO ROS增加,促进了细胞分化。ISL治疗不仅诱导活性氧生成,也验证了ROS水平和ISL-induced细胞分化之间的紧密关系。
ROS作为信号分子调节各种生理反应,包括细胞生长和基因表达30.,扮演了一个重要的角色在黑素细胞增殖的调控和杀菌作用。ROS拾荒者可能下调杀菌作用(31日]。黑素瘤,就像许多其他癌症亚型,展品可逆细胞分化[缺陷32]。此外,氧化还原状态在调节细胞分化中起着重要的作用。NADPH氧化酶的抑制活动促进黑色素瘤B16转椅细胞分化。细胞中的细胞ROS生产和NADPH氧化酶是密切相关的。NADPH氧化酶的主要来源是活性氧诱导的膜通道。恶性肿瘤细胞通常在自己造成的(和/或host-inflicted)氧化应激,因此,导致了恶性肿瘤(7]。ISL被发现显著增加细胞内ROS B16F0细胞,引起细胞分化。一个可能的肿瘤治疗方法是压力这些细胞进一步通过提供ROS-generating代理。这一步应该限制ROS对正常细胞的影响并提供ROS水平没有上升太高了。然而,这种情况下会发生然而,鉴于已经升高活性氧的生成,它把恶性肿瘤细胞的细胞不再能应付日益增多的氧化损伤。
氧化应激已经涉及癌症发展。氧化剂的超表达酶降低肿瘤发生在几个人类癌症细胞系小鼠模型和致癌作用。很多(可能)抗肿瘤药物可能会导致氧化应激通过增加活性氧的形成,增强其抗癌效果(33]。另一方面,干扰ROS-antioxidant平衡在癌症的风险。例如,三氧化二砷(2O3)对急性早幼粒细胞白血病的可能导致氧化应激(34),但2O3也可以致癌,ROS是最有可能参与癌症的发展机制。直接损害DNA被认为是一个关键,尽管不够,事件引发癌症,表明活性氧的能力抑制细胞凋亡,促进增殖,侵袭性和转移(可能,血管生成)也很重要。一些报道表明氧化还原细胞分化的动态平衡的重要作用。细胞的氧化还原内稳态的改变意味着ROS生成或代谢的变化。
我们的数据表明,ISL-induced B16F0细胞分化伴随着增加活性氧的形成。进一步的研究探索ISL-induced分化的机制是必要的,特别是,探索ISL-induced分化和细胞内活性氧的形成之间的关系,以及关键分子参与细胞内的表达ROS-mediated癌症分化。
缩写
| BSO: | D, L-buthionine sulfoximide (S, R) |
| DCFH-DA: | 2,7-Dichlorodihydrofluoresceindiacetate |
| GAPDH: | Glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase |
| ISL: | Isoliquiritigenin |
| 麻省理工: | Methylthiazolyltetrazolium |
| 南京: | N-acetyl-L-cysteine |
| ROS: | Reactiveoxygenspecies |
| 酪氨酸: | 酪氨酸酶。 |
作者的贡献
x陈和张同样贡献了这个工作。
确认
这项研究得到了国家自然科学基金(没有。30960451),主要的国家基础研究发展计划(2010 cb535003),杰出青年研究项目的新疆生产建设兵团(2011 cd006),国际科技合作项目(2012 bc001),和石河子大学的重大基础研究项目(ZRKX2009ZD01)。