文摘
使用四氯化碳(CCl4)在大鼠肝组织损伤的实验模型;导致纤维化,长远来看,肝硬化。肝硬化是进步的持续的肝损伤的结果,它可能是可逆的,当损害noxae撤回。本研究的目的是评估肝硬化引起的变化在肺和肝脏,通过腹腔内CCI的实验模型4管理。我们使用18雄性Wistar鼠分为三组:控制(CO)和两组肝硬化感应的CCI除以时间4:G1(11周),G2(16周)。我们发现转氨酶水平显著增加,脂质过氧化(TBARS)在肝脏和肺组织也增加抗氧化酶SOD和CAT, TNF的表达α和il - 1β在肝硬化动物的肺。我们观察到的变化在气体交换在肝硬化组。我们可以得出结论,我们的模型再现了肝硬化模型,导致肺系统的改变导致肺部血管的气体交换和大小的变化。
1。介绍
肝硬化被认为是最先进的纤维化和阶段与隔膜的外观和纤维结节,肝血流量的变化,以及肝功能衰竭的风险(1]。肝硬化发生的结果对肝损伤的多种炎症后,毒性,代谢,或充血性赔偿。尽管肝硬化的病理生理学和组织病理学变化独立病原体,最后组织模式是相似的,特点是弥漫性纤维化和普通建筑结构的畸变肝脏结节。肝硬化由于结构变形可能导致肝细胞的功能和门静脉高压的变化。这两个变化产生,在其进化,肝硬化的临床表现,这不仅表现在肝脏,在整个有机体(2,3]。门脉高压,通过血流动力学改变,血容量的变化分布,释放血管活性的物质,可能会导致心肺症状称为hepatopulmonary综合征(HPS) portopulmonary高血压(PPH)和肝硬化心肌病。
肝脏疾病和肺部疾病之间的关联在慢性肝病患者中很常见。在过去的15年里,特定的肺血管变化与肝脏疾病和/或门静脉高压遭受进一步的调查(1]。
呼吸道引起的氧化损伤是一个主要的目标内生和外生过程(4,5]。吞噬细胞产生的活性物种的主要原因是组织损伤与慢性炎症性肺疾病有关。氧化应激参与肺损伤导致肺损伤的标志和促炎细胞因子水平上升(即。,il - 1β、il - 6和TNF -α)[6]。肝硬化的发展通常与氧化应激有关(7]。
研究分析三地的急性效应4在肝脏还发现早期肿瘤坏死因子的生产α肝损伤后可以产生一个增加ICAM-1表达式和减少PECAM-1表达,这可能是至关重要的,炎症细胞进入实质的轮回8]。
CCl四氯化碳(4),一个强有力的肝毒素,能够复制肝硬化通过自由基的生成和通过酶活性物种产生代谢变化的复杂细胞色素p - 450 (9]。多年来,人们一直认为CCl自由基产生4三氯甲基(CCl3)和三氯甲基过氧化氢(●OOCCl3),影响肝细胞,导致形态变化包括内质网、高尔基体、质膜,影响线粒体的细胞(9]。
本研究的目的是探讨肝和肺的实验性四氯化碳引起的肝硬化模型与两种不同期限的政府。
2。材料和方法
2.1。动物模型
我们使用18雄性Wistar鼠体重介于200到250克获得FEPPS(国家卫生研究的基础和生产)。动物被随机分为三组:实验组(CO)和两个对照组。实验组划分根据CCl的时间管理4;在组1 (G1)三地的政府4持续了11周,而在组2 (G2),持续时间是16周。在实验过程中,动物一直住在单位实验动物研究中心医院的丹尼·德·阿雷格里港使用12小时光/暗周期从7 - 19小时(光)°C。饲料的访问控制,镇静安眠剂添加到饮用水的动物(0.3 g / L)作为一种酶诱导物加强创新领导力的作用4(10]。对照组(CO)收到了0.5毫升腹腔内注射(ip)的矿物油,而实验组收到CCl(0.5毫升/公斤ip)4稀释在矿物油的比率1:6;应用程序是由以下协议:10的应用5 5天,10的应用4 4天,3天3和7的应用;这些动物牺牲CCl的最后剂量后2天4(11]。
研究进行的所有程序根据参数建立医院伦理研究的丹尼·德·阿雷格里港和随后的动物保健的建议,“实验动物保健原则”指导方针的国家医学研究协会以及“指导护理和使用实验动物”发表的美国国立卫生研究院(12]。引起死亡,动物麻醉与甲苯噻嗪(50毫克/公斤体重)和氯胺酮(100毫克/公斤体重的身体),这两个是腹腔内注射。死亡的那天,对肝脏血液样本收集功能测试通过retroorbital丛(13]。
之后,腹部是剃,中线剖腹手术进行收集血液从腹主动脉动脉血气分析。
2.2。血清生化分析
血液样本取自retroorbital丛被用来评估水平的天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)和碱性磷酸酶(美联社)表达IU / L。这些水准测量根据常规实验室技术使用在医院丹尼·德·阿雷格里港(HCPA)。
2.3。器官重量比率(器官重量/体重×100)
器官重量,肝脏的重量被用来确定hepatosomatic比率。肺重量被用来确定pneumosomatic比率。
3所示。组织学分析
组织学检查,一块从所有的动物肝脏和肺是修剪和固定缓冲福尔马林浸泡在10%的24小时。块在一系列分级脱水乙醇和嵌入石蜡。连续3毫米部分被苏木精和伊红染色。五个部分从每个样本分析两个独立的病理学家没有先验知识的动物群体。
3.1。样品制备和分析氧化应激
肺和肝匀浆是由添加9毫升的磷酸盐缓冲剂(140毫米氯化钾、磷酸20毫米pH值7.4)每克组织。组织匀浆在冷冻离心机离心(SORVALL RC-5B冷藏超离心机)10分钟3000 rpm (1110×g)。沉淀是丢弃,上层是储存在−为后续测试80°C。
3.2。Lipoperoxidation
氧化应激是由测量的浓度aldehydic产品使用硫代巴比土酸活性物质(TBARS)。上层清液在535 nm的光谱吸光度测定(13],nmol /毫克蛋白表达的价值观。
3.3。超氧化物歧化酶
胞质超氧化物歧化酶(SOD) (EC 1.5.1.1)化验30°C的方法Misra和Fridovich14]。肾上腺素的自氧化速率,逐渐被越来越多的匀浆SOD, spectrophotometrically监控在560 nm和表达为U /毫克/蛋白质。的酶抑制肾上腺素的50%自动氧化作用被定义为1 U的SOD活性。
3.4。过氧化氢酶
过氧化氢酶活性是由测量吸收的减少在240 nm包含50 mM的反应介质磷酸缓冲盐(pH值7.2)和过氧化氢(0.3米15]。酶活性是spectrophotometrically化验在240 nm,和表达的价值观pmol /毫克的蛋白质。
3.5。动脉血气分析
我们收集的血液从腹主动脉测量动脉血液的气体交换(PaO2局部动脉压力氧气,帕科2局部动脉二氧化碳压力,压力和圣2血红蛋白/ Hb-oxygen饱和);在医院实验室检测进行了丹尼·德·阿雷格里港(HCPA)。
3.6。肿瘤坏死因子α
肿瘤坏死因子-的浓度α(肿瘤坏死因子α)肺组织是由西方墨点法。电泳协议执行根据Laemmli et al。(1970)16],描述的印迹技术进行Towbin et al。(1979)17]。结果监测使用组成蛋白质标记(β肌动蛋白,σ)。结果量化使用这个程序1 d LabImage (Loccus生物技术)和在任意单位表示。
3.7。白介素- 1β
il - 1的浓度β(白介素- 1β)肺组织是由免疫组织化学分析。抗原的恢复进行了使用柠檬酸缓冲在100°C,和内源性过氧化物酶活性被孵化与无水甲醇含3%过氧化氢在室温下。片是顺序preincubated 10%兔血清在室温下阻止可能的二次抗体的非期望的反应。幻灯片和多克隆兔il - 1孵化β(圣克鲁斯生物技术、圣克鲁斯、钙、美国)一夜之间在4°C其次是孵化二级抗体(生物素化的antirabbit免疫球蛋白,向量实验室,伯林盖姆,CA,美国)一小时在室温下。60分钟后在室温下,幻灯片处理试剂的设想,然后用双氧水洗了三次(PBS)。核与苏木精复染色。主要包含牛血清白蛋白抗体在PBS稀释作为一个消极的控制。结果评估没有先验知识的组织使用显微镜配备数码相机捕捉图像使用Image-Plus软件(美国媒体控制论,马里兰州贝塞斯达)。
3.8。统计分析
收集到的数据被存储在Excel中,统计分析使用GraphPad InStat程序。结果表示为均值±SD。数据比较用方差分析(方差分析),当分析表明存在显著差异,意味着比较利用学生纽曼Keuls测试。的显著性水平是使用。
4所示。结果与讨论
在我们的研究中,我们使用两种不同的创新领导力的持续时间4归纳。我们组在其他的研究中,我们观察到三地4全身的动物从第十周肝硬化的治疗。CCl感应与4被用作模仿肝硬化模型由于其强大的肝毒素的效果,导致坏死和脂肪变性。长期的管理导致肝纤维化、肝硬化和肝细胞癌。CCl的4直接作用于肝细胞的线粒体膜透性的变化。这个模型被广泛用于阐明肝硬化的发病机制(18,19]。
在这项研究中,AST、ALT和高山是显著增加肝硬化组相对于公司集团(表1)。创新领导力4导致肝损伤,增加血清肝转氨酶水平,这是众所周知的肝损伤的标志。释放大量的肝酶在血液中与完整性的丧失与顺向组织细胞凋亡和坏死的肝细胞。因此,酶是最终释放到细胞损伤后的循环,因此导致更高的酶水平(19]。
高hepatosomatic pneumosomatic比率观察,尽管这些变化并不显著,几项研究已经报道的增加肝硬化动物,(表1)[20.- - - - - -22]。
根据TBARS评估肝脂质过氧化作用,G1和G2增加238%和262%,分别相对于公司集团。评价(TBARS)的肺,G1组显示增加了1423%,组2显示增加6452%对公司集团(数字1和2)。
的增加脂质过氧化TBARS产品评估,包括MDA和其他醛,演示了一个结构和细胞膜完整性的损失。TBARS增加导致的肝组织,如图所示在其他外源性物质引起的肝损伤实验模型(11,23- - - - - -25]。
CCl的急性效应研究4在不同的系统,包括肺系统,表明创新领导力4生成高活性自由基的细胞色素p - 450肺细胞酶;导致肺氧化压力的增加也会导致显著减少糖原肺取消一些氨基酸,蛋白质含量下降,CCl一腹腔内注射4(26]。
肝脏SOD检查显示在G2组显著增加203%,相对于公司集团。在G2观察SOD水平高出141%相对于G1。SOD的评价肺显示显著差异,高值与138%和144%在G2相对于公司和G1,分别为(数字3和4)。
猫的评价酶在肝脏,我们观察到381%和328%在G2高值与CO和G1组相比,分别。观察肺组织,同样的趋势,G2高出298%和386%,分别比CO和G1组(数字5和6)。
脂质过氧化作用的最终产品之一是丙二醛(MDA),激活胶原蛋白的生产,导致后续的纤维化。在我们的研究中,我们发现TBARS随海拔的增加自由基清除剂SOD和CAT等酶。这导致事实描述这些酶在生物系统的保护作用减少氧化应激(11]。
如表所示2,PaO2价值观在G2 G1相比显著降低,公司(),虽然热点的变化2和PCO2值并不重要。
这些动脉血液气体组分的变化表明,这个模型改变气体交换。先前的研究已经报道,慢性肝脏疾病,尤其是肝硬化,可能与动脉低氧血症有关,其中包括ventilation-perfusion不匹配的改变和肺内的血管分流术的扩张(25]。
也知道肝硬化损害气体交换,允许出现肺内的分流,导致血氧不足和疲劳和呼吸困难等症状的出现27]。此外,病人PaO较低2水平氧化应激水平,可以观察到在我们的研究中。
的一些病理生理机制可以解释观察到的低效率的肺气体交换在肝硬化患者可能发生因为肝硬化患者肺血管低音调的特点是一个贫穷的或者没有缺氧反应,导致肺血管明显扩张。因此,这种不正常的肺血管张力独立于呼吸道疾病引起的变化通气/灌注(V / Q),导致轻度至中度低氧血症(28]。
的组织学显示脂肪变性,肝肝硬化动物气球样变性、纤维化和坏死;类似的特征没有集团有限公司(图中观察到的动物7),从而证实肝脏转氨酶的结果,发现在我们的模型中升高。
(一)
(b)
(c)
肺组织的组织学检查(图8)降低肺血管的腔,这表明血管壁变厚的厚度通过增加肺内的压力容器。
(一)
(b)
(c)
先前的研究已经提出了假设体液因素来自内脏循环,通常会在肝脏代谢,达到由于门体静脉的肺循环分流术和肝功能衰竭。这些物质修改内皮细胞功能,促进血管收缩,血栓形成,肺循环和促有丝分裂的活动(29日,30.]。
引发的炎症过程也可以mda活性细胞因子如TNF -α、interleukin-8和白细胞介素- 6 (31日]。肿瘤坏死因子的分析α在G2肺组织显示表达增加与股份有限公司相比,如图9。
一些作者表明,星状细胞与肝纤维化和纤维化细胞因子作用于通过转化生长因子β(TGF -β)、肿瘤坏死因子-α血小板源生长因子(PDGF),和其他因素。这些细胞分化成myofibroblasts和成纤维细胞,激活的合成矩阵的元素(如胶原蛋白、弹性蛋白、蛋白聚糖和蛋白质的结合)(32]。肿瘤坏死因子-α促炎细胞因子,参与肿瘤的免疫反应机制。肿瘤坏死因子-α也参与肝损害的所有阶段和直接诱发肝细胞的凋亡和参与星状细胞的激活,导致肝纤维化的发展(33,34]。
除了肿瘤坏死因子的贡献α肝纤维化的实验和临床研究报道,il - 1的变化,引发,TNF -α由于肺损伤和细胞凋亡水平由巨噬细胞在肺纤维化的发展起到了重要的作用(35,36]。我们还发现增加il - 1的表达β在我们肝硬化组,如图10。
众所周知,il - 1β在肺纤维化过程中发挥作用。il - 1的机制β绑定到纤维化在某些疾病不确定但涉及TGF -β/ smad3-dependent刺激。在我们的学习小组中,G2不同于另一组,表明负责纤维化的因素之一是呈现在这一组37]。
自由基的参与和行动的炎性细胞因子参与的反应的病因学的因素引发肝硬化的变化产生的模型。
我们没有执行测量动物的血清细胞因子水平,这可能会进一步导致结果的理解。
5。结论
CCl的两倍4管理在我们的研究中(G1和G2)复制肝硬化,尽管G2显示肝和肺,最大的变化就是,改变气体交换,进一步减少肺血管的腔,和更高水平的细胞因子表达。未来的研究应该试图阐明CCl参与的机制4模型来研究肺部并发症导致的肝硬化,包括portopulmonary高血压。
利益冲突
作者宣称没有利益冲突在他们的论文中。
确认
这项工作是支持医院诊所的阿雷格里港(HCPA)和基金研究激励医院诊所阿雷格里港的事件(FIPE / HCPA)。