文摘

氧化应激参与高血压的发病机理和/或维护的高血压。本研究调查的影响蜂蜜高收缩压(SBP)在自发性高血压大鼠(月)。也评估的影响蜂蜜的改善肾脏的氧化应激月作为其抗高血压作用的可能机制。月和纯种京都(WKY)的老鼠被随机分为两组,使用蒸馏水或蜂蜜口服填喂法为12周每天一次。控制月显著更高的SBP和肾丙二醛(MDA)水平比控制WKY。信使rna表达水平的核因子红细胞两个相关因子2 (Nrf2)及谷胱甘肽S-transferase(销售税)明显下调而总抗氧化状态(助教)和活动的销售税和过氧化氢酶(CAT)更高的肾萎缩的控制。蜂蜜补充月SBP和MDA水平显著降低。蜂蜜显著减少销售税和猫的活动虽然适度但无关紧要的调节Nrf2 mRNA表达水平的肾萎缩。这些结果表明,Nrf2表达式受损的肾脏萎缩。蜂蜜补充大大降低升高SBP通过改善氧化应激的肾萎缩。

1。介绍

心血管疾病(CVD)是全球主要的死亡原因。心血管疾病的高发病率是归因于患病率的增加修改的心血管危险因素如高血压、糖尿病、肥胖、血脂异常、吸烟、久坐不动的生活方式(1]。流行病学研究表明,高血压是一个重要的公共卫生问题,不仅因为其高患病率也成为一个重要的风险因素对心血管疾病的发展,终末期肾病,中风和死亡2- - - - - -4]。在过去的十年中,活性氧(ROS)的作用和/或活性氮物种(RNS)的高血压一直是许多研究的主题的兴趣。ROS / RNS发挥重要作用在高血压的发病机制5和也与高血压有关6]。来自文献的证据表明,高浓度的活性氧/ RNS导致氧化应激之间的不平衡是一个重要的调停人血管收缩剂和血管舒张药机制在实验和人类高血压(5,7- - - - - -9]。为了应对各种氧化剂,抗氧化酶进行微分调节或调制(10- - - - - -12]。这些变化通常发生在upregulation的形式的差别,或者对这些活动和抗氧化酶的表达;主要目的是防止氧化损伤(10- - - - - -12]。

这些实验和临床研究结果表明氧化应激在高血压中的作用已经导致了一个巨大的治疗方法的兴趣或干预目标氧化应激在高血压的治疗13,14]。除了它的糖成分,蜂蜜是由许多具有生物活性的化合物,如酚类化合物,黄酮类化合物,carotenoid-like衍生品、有机酸、美拉德反应产品、过氧化氢酶、抗坏血酸,和其他化合物作为抗氧化剂(15]。一些治疗和药用效果如抗菌、抗诱变剂的,抗增殖,王亚南、降糖、抗氧化效果近年来被归因于蜂蜜(16- - - - - -21]。相比之下,有有限或没有可用数据有效性或补充蜂蜜在高血压的效果。最近,我们报道,STZ-induced糖尿病引起的减少SBP在月12]。这种低血压患者糖尿病对高血压的影响也报道了其他作者(22- - - - - -24]。此外,我们的研究表明,短期(3周)管理马来西亚tualang蜂蜜STZ-induced糖尿病萎缩导致进一步降低在SBP [12]。因为蜂蜜没有管理,非糖尿病的萎缩的研究(12),它是不确定的SBP补充蜂蜜后由于蜂蜜或继发性糖尿病的效果。因此,本研究进行了补充调查马来西亚tualang蜂蜜的效果在高架SBP在非糖尿病的萎缩。我们也评估这蜂蜜的效果在改善肾脏氧化应激作为其降血压药或抗高血压效应的可能机制。马来西亚tualang蜂蜜是由野生蜜蜂(亚洲api dorsata)。它得名于tualang树(Koompassia excelsa),房屋蜜蜂的蜂巢。这棵树可以生长在马来西亚半岛的东南亚热带雨林,泰国南部,东北部苏门答腊、婆罗洲、巴拉望。

2。结果

2.1。蜂蜜对血压的影响在WKY和萎缩

图1显示收缩压(SBP)控制和honey-treated WKY和萎缩。在治疗之前,SBP是显著()在月控制高于WKY控制(图1)。在治疗期间,SBP明显(或)高萎缩而WKY保持不变。相比之下,有一个重要的(或)抑制honey-treated SBP的萎缩而月控制。月控制、SBP的研究显著(SBP)高于毕业典礼前的研究(图1)。SBP是显著()降低honey-treated月比月控制。与控制WKY相比,honey-treated月仍高血压。蜂蜜补充并不影响SBP在WKY(图1)。

2.2。蜂蜜对体重的影响在WKY和萎缩

图2显示了在控制体重,honey-treated WKY和月之前和之后的治疗。在治疗开始之前,控制萎缩明显(低体重与WKY控制。在治疗期间,体重明显(或)增加WKY和萎缩。同样,体重增加WKY和月处理蜂蜜。补充蜂蜜显著()体重增加WKY但不是在月(图2)。

2.3。蜂蜜对肾脏的氧化应激标志物WKY和萎缩

图3显示了MDA含量控制和honey-treated WKY和萎缩。控制萎缩明显()MDA水平高于WKY控制。蜂蜜补充并不影响控制WKY组MDA水平但使MDA含量的增加萎缩。图4在控制和显示了助教honey-treated WKY和萎缩。助教显著(在控制萎缩而控制WKY)更高。用蜂蜜治疗,助教是减少但不显著萎缩。表1显示的水平减少谷胱甘肽(GSH)、氧化谷胱甘肽(GSSG)、谷胱甘肽(GSSG比例控制和honey-treated WKY和萎缩。谷胱甘肽的水平,GSSG,谷胱甘肽(GSSG比类似的控制和honey-treated WKY和月(表1)。

2.4。蜂蜜对肾脏抗氧化酶的活动WKY和萎缩

图5显示肾脏的猫活动控制和honey-treated WKY和萎缩。控制萎缩明显()高猫活动与WKY控制。和补充蜂蜜、猫活动显著()低honey-supplemented月与月控制。此外,蜂蜜治疗导致显著()降低猫活动WKY与WKY控制。图6显示肾脏的销售税活动控制和honey-treated WKY和萎缩。控制萎缩明显()提高销售税WKY活动与控制。用蜂蜜治疗,销售税活动显著()低月与月控制。表1显示了活动的超氧化物歧化酶(SOD),谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)及谷胱甘肽还原酶(GR)的控制和honey-treated WKY和萎缩。活动SOD、GPx和GR是相似的在所有的组(表中1)。

2.5。影响蜂蜜的mRNA的表达Nrf2和WKY肾脏抗氧化酶和萎缩

图7显示肾脏的mRNA表达Nrf2控制和honey-treated WKY和萎缩。控制萎缩明显()降低mRNA的表达Nrf2 WKY与控制。蜂蜜的政府没有产生显著高于mRNA的表达Nrf2在月与月控制。图8显示了猫的mRNA表达在肾脏的控制和honey-treated WKY和萎缩。猫没有差别的mRNA表达控制和honey-treated WKY和萎缩。图9描述了mRNA的表达GST -α在控制和肾脏honey-treated WKY和萎缩。的mRNA表达GST -α明显()在控制萎缩而控制WKY表达下调。蜂蜜补充月没有显著增加mRNA的表达GST -α。图10显示肾脏的mRNA表达GST-Π控制和honey-treated WKY和萎缩。控制月表现出显著()表达下调的mRNA表达GST-ΠWKY与控制。亲爱的,在WKY补充显著()下调GST-Π的mRNA表达。政府的蜂蜜萎缩不明显上调GST-Π的mRNA表达。表2表明CuZnSOD的mRNA表达,MnSOD, GPx肾脏的控制和honey-treated WKY和月没有差别。

3所示。讨论

结果表明,SBP显著升高控制月之前报道(13,14]。氧化应激参与高血压的发病机理和/或维护在高血压5- - - - - -9]。我们的数据表明,SBP显著低于honey-treated月控制相比萎缩。相比之下,没有区别在观察SBP honey-treated WKY大鼠相比,控制WKY大鼠。鉴于这种蜂蜜的抗氧化作用报道(20.,21),发表我们的研究结果是一致的数据证明抗氧化剂的有益作用在萎缩但不是在高血压血压正常的WKY大鼠(13,14]。除了肾脏氧化应激在高血压的病理生理学中的作用,其他因素,如血管的因果作用氧化应激(25],内皮功能障碍[26),交感神经系统(27),肾素-血管紧张素系统(28是有目共睹。此外,胰岛素抵抗的作用和其他糖尿病资料如增强蛋白水解活性和胰岛素受体乳沟一直在萎缩与高血压的发病机制(29日,30.]。补充抗氧化剂(蜂蜜),尽管改善肾脏氧化应激,没有有效地恢复SBP进一步让人们相信,肾脏氧化应激并不是唯一的原因,高血压在萎缩,也许在人类高血压。

在许多疾病(如高血压)与氧化应激有关,主要的ROS生成超氧化物阴离子(O₂^•−)[5,7,8]。O₂^•−生成各种其他ROS的生理重要性(5,7]。然而,许多组织都具有抗氧化酶在活性氧的解毒发挥关键作用。SOD保护组织免受氧化应激和损伤的催化转换O₂^•−到H₂O₂,一个更加稳定的ROS (31日]。没有显著改变肾萎缩与WKY大鼠SOD酶的活性。虽然CuZnSOD略低的mRNA表达的肾萎缩与WKY大鼠相比,无显著的变化观察SOD同功酶的mRNA表达月WKY相比。同样,尽管略CuZnSOD mRNA表达降低,在mRNA的表达无显著差异CuZnSOD MnSOD在萎缩。我们的结果显示增加猫活动控制的肾脏萎缩。猫催化降低H₂O₂水(H₂O)和氧(O₂)。因此,这种酶高活性氢氧自由基保护组织(^•哦),来自H₂O₂(32]。在实验研究中,增加了H₂O₂伴随着浓度升高猫和/或GPx活性(33,34]。因此,控制肾萎缩猫活动增强,可能是一种适应性反应代谢增加浓度的H₂O₂。虽然猫和GPx H代谢中发挥重要作用₂O₂,GPx效率比猫,因为它很容易抑制的水平的提高H₂O₂(35,36]。考虑到高H₂O₂一代报道在月37),猫活动增强,控制肾萎缩可能意味着增加H₂O₂生产和GPx解毒这衬底的不足。有趣的是,猫的mRNA表达的褶皱变化的肾萎缩WKY大鼠的没有什么区别。差异在猫活动(减少活动)和猫mRNA表达(增加表达式)据报道在老鼠的脑组织38]。缺乏显著变化的活动和mRNA表达GPx可能进一步表明GPx相比少猫扮演一个重要角色在高浓度的H的解毒₂O₂。月用蜂蜜治疗显著降低猫的活动。这可能是由于降低了身体的需求增强内源性抗氧化防御(CAT)由于蜂蜜补充。因此,这证实了猫活动增加的肾萎缩是增加氧化应激诱导的反应。

我们的研究结果表明,MDA浓度,一个杰出的标记评估的脂质过氧化反应(39,40),在控制的肾萎缩明显升高。这些数据证实了其他研究人员报告中MDA含量的升高肾萎缩(41]。肾脏的MDA水平升高控制月显示增加的脂质过氧化作用。在我们之前的研究12),我们报道了MDA的水平低得多的肾萎缩WKY比。我们建议降低MDA含量月可能是因为猫活动增加和增强助教(12]。然而,在这项研究中,我们发现,MDA含量升高的肾萎缩尽管增强猫活动和助教。数据在当前的研究中表明,增强猫活动和助教的肾萎缩不预防氧化损伤。蜂蜜在月补充适度恢复助教和显著降低MDA的水平升高,表明减少氧化损伤。这些honey-treated萎缩也不太严重的高血压是一致的与其他研究报告增加高血压的MDA含量(41,42]。

数据显示一个增强的活动控制肾萎缩的销售税。销售税保护细胞或组织免受氧化应激和损伤通过排毒各种不良基板,包括脂质过氧化的终端产品,如MDA和4-HNE (4-hydroxynonenal),来源于细胞氧化过程(43]。GST活性增加可能是由于酶诱导为了解毒MDA的水平升高和其他脂质过氧化的产品。这通常是一种自适应或代偿机制来增强细胞电阻和保护组织免受这些有毒的有害影响醛(44]。在增加销售税活动相比,mRNA的表达GST -和销售税,肾脏的控制月明显下调。四类GST同功酶(GST -α销售税,μ、GST-Π和销售税θ)已确定45]。然而,mRNA的表达GST -α和GST-Π调查,因为他们是主要的销售税同功酶主要表达在大鼠肾脏46]。大量的化合物,如外源性物质,据报道,铅以及活性氧诱导活动和表达GST同功酶(46,47]。据报道,增加销售税活动和调节GST-Π表达与增加氧化应激和细胞凋亡在乳腺癌(48]。表达下调mRNA表达GST -α和GST-Π肾萎缩证实其他作者也报道减少销售税mRNA表达的肾萎缩(49]。蜂蜜显著降低消费税管理月活动类似于血压正常的WKY大鼠。这可能是由于需求下降的诱导肾销售税的抗氧化剂(蜂蜜)补充。

数据显示Nrf2的mRNA表达明显下调的肾萎缩与WKY大鼠相比,类似于最近报告发现(50]。Nrf2,一个重要的转录因子,检测外源性物质和氧化还原状态失衡和协调各种cytoprotective基因的转录51]。在生理条件下,Nrf2仍然绑定到Keap1 (Kelch-like ECH-associating 1)蛋白在胞质(51]。然而,在氧化或异型生物质压力,Nrf2摆脱阻遏,Keap1,把从细胞质细胞核(51,52]。它形成异质二聚体和小加器(肌肉筋膜纤维肉瘤)蛋白质结合抗氧化反应的元素(是)在启动子区域的一系列排毒和cytoprotective基因,导致他们的转录51,52]。这些基因的转录导致不同二期代谢的感应,自由基清除,和其他迅速中和解毒酶,解毒,消除氧化剂或外源性物质(51,52]。Nrf2 mRNA表达的差别,对这些平行的差别明显对这些基因的mRNA的表达GST -α和GST-Π肾萎缩。此外,减少mRNA的表达在honey-treated GST-ΠWKY大鼠可能是由于Nrf2下调表达的这些老鼠。一项研究报道,Nrf2-null老鼠几个GST同功酶的表达明显下降(53]。这表明,减少销售税mRNA表达可能减少或受损的结果表达式Nrf2的萎缩。我们的结果也在协议与瑞斯曼等人报道,cytoprotective基因的mRNA表达,解毒亲电试剂,如销售税,更受到Nrf2 keap1-kd老鼠比消除活性氧,如草地、猫,GPx [54]。在我们之前的研究中,猫和助教活动增加,但MDA降低在萎缩(12]。在这项研究中,除了猫活动增加和助教,销售税活动也增加,MDA的水平升高。考虑瑞斯曼等人的结果。54),我们建议从氧化应激可能有进展亲电压力随着氧化应激水平增加。

目前尚不清楚是否减少mRNA的表达Nrf2是氧化应激的结果。暴露大鼠肺微血管内皮细胞低和适量的H₂O₂已被证明导致核Nrf2积累,增强Nrf2-ARE-binding活动,和调节调控基因的表达55]。相比之下,这些作者也报道了细胞暴露于H₂O₂在高剂量的特点是H₂O₂浓度的易位Nrf2核细胞溶质,Nrf2-ARE-binding活动下降,下调表达的基因。研究进一步表明,细胞损伤的水平相当高的细胞暴露于H₂O₂在高剂量而水平细胞损伤的细胞暴露于H₂O₂在低和适量类似正常条件下(55]。同样,红色的等人发现,长期接触H₂O₂Akt的差别导致对这些激活糖原合成酶激酶3β(GSK-3β),核易位Nrf2细胞质中,从而影响细胞的抗氧化反应(56]。总的来说,这些发现证实了我们的ROS增加/氧化应激和损伤的肾脏萎缩与Nrf2的表达下调表达。这些数据表明,低和适量的H₂O₂或者低水平的氧化应激可能诱发Nrf2活性和表达,从而保护细胞细胞器免受氧化损伤(12,55]。另一方面,高浓度的H₂O₂或高浓度的活性氧氧化应激导致减少Nrf2活性和表达,从而增加细胞成分氧化损伤的敏感性降低的结果/抗氧化反应的细胞受损[55,56]。肾的显著降低活动的猫honey-treated月建议减少H₂O₂由于蜂蜜浓度补充。这可能导致增加易位Nrf2从胞质核就是明证的适度调节表达Nrf2萎缩。因此,这些结果表明,抗氧化剂(自由基拾荒者),H₂O₂代谢酶(CAT和/或GPx)以及其他ROS-scavenging酶可能引起Nrf2保护作用,有助于维护/ Nrf2增强生理功能。

此外,尽管增加氧化应激诱导的关键Nrf2 [50,51),肾萎缩降低了Nrf2 mRNA的表达。这表明,Nrf2潜在renoprotective转录因子,可能受损或缺乏肾萎缩,导致萎缩无力上调Nrf2以应对氧化或亲电的侮辱。蜂蜜政府,而适度虽然没有显著上调Nrf2 mRNA表达,大大减毒抗氧化酶的活动和减少脂质氧化损伤的肾脏萎缩相似水平在血压正常的WKY大鼠。针对中等upregulation Nrf2 honey-treated萎缩,人会预期类似的结果honey-treated WKY大鼠。令人惊讶的是,我们的研究结果表明,蜂蜜补充在血压正常的WKY大鼠与减少Nrf2 mRNA表达。原因尚不清楚。然而,一项研究报告类似的发现在Keap1-kd老鼠54]。研究表明,Nrf2 mRNA表达适度减少Keap1-kd小鼠与野生型相比。认为这可能是由于一个似是而非的负面反馈通路Nrf2 mRNA表达由于Nrf2 overactivation [54]。因此,减少Nrf2 mRNA表达在肾脏honey-treated WKY大鼠可能会带来负面的结果反馈机制增加Nrf2刺激和易位后每日补充蜂蜜WKY大鼠。

肾脏的血压正常的WKY大鼠,类似于我们的先前的研究20.,57),蜂蜜补充并不影响肾脏氧化应激的大部分参数研究。令人惊讶的是,我们的数据显示,猫活动显著降低在honey-supplemented WKY大鼠相比,控制WKY大鼠。除此之外,我们发现一个轻微的趋势(但统计微不足道)对降低MDA含量honey-treated WKY与WKY大鼠的控制。这些发现都在与我们发现在我们以前的研究表明,猫的活动和MDA的水平可比的肾脏和胰腺honey-treated Sprague-Dawley (SD)和未经处理的SD大鼠(20.,57]。这些差异可能源于不同的老鼠菌株。类似的差异在SD和WKY大鼠氧化应激的标记也被报道在另一项研究[58]。WKY大鼠的猫活动下降可能是由于下调表达Nrf2在这些老鼠54]。此外,有证据表明氧化应激和老化过程之间的关联59),这可能会为这种差异提供另一种可能的解释。在所有的研究中,SD的年龄和WKY大鼠治疗开始前是一样的(12 - 14周)。然而,治疗12周的时间在目前的研究中,而这是4周(20.,57)或3周(12在先前的研究。此外,肾生产H₂O₂和尿排泄MDA的报道明显高于老年WKY大鼠比年轻的同行(60]。因此,明显高于猫活动和MDA水平略高控制WKY大鼠的肾脏相比honey-treated WKY大鼠可能意味着增加H₂O₂生成和也许低水平的氧化应激的发生在血压正常的WKY大鼠。

总之,猫和助教活动的增加肾脏萎缩的研究中观察到和我们之前的研究12)可能代表一种自适应机制来响应增加氧化应激。在先前的研究中,这种自适应机制似乎防止氧化损伤就是明证的MDA水平显著降低肾萎缩与WKY大鼠(12]。在目前的研究中,增强的助教和猫活动并不像明显预防氧化损伤肾脏的MDA含量严重超标的控制月相比控制WKY大鼠。自适应的不足或代偿机制来防止氧化损伤可能是由于本研究的长期允许无情的ROS生成,导致增加氧化应激和损伤。高浓度的活性氧(也许H₂O₂)和MDA的萎缩可能导致感应猫和销售税活动,分别。结果中的差异基因表达和活性的抗氧化酶与之前报道的发现表明,改变mRNA抗氧化酶的表达并不一定与他们的蛋白质表达和/或活动(32,61年- - - - - -67年]。这些矛盾在mRNA表达和氧化应激的影响抗氧化酶蛋白/活动是由于各种因素包括RNA拼接,信使RNA的降解,增加蛋白质的修改,如营业额和退化,影响激酶/磷酸酶信号转导通路在转录后的调控,转录和翻译之间的差异,诱导抗氧化酶活性/合成和细胞氧化还原状态的变化32,61年- - - - - -67年]。我们的研究结果也证实了先前的研究结果显示,Nrf2扮演一个更重要的转录作用比其他ROS-scavenging销售税酶的表达(53,54]。这项研究还显示,高血压与氧化损伤增加,表达下调mRNA的表达Nrf2肾萎缩。我们的数据表明,抗氧化酶的衰减(和/或清除的H₂O₂补充/ ROS)由于蜂蜜可能导致的适度调节表达Nrf2肾脏萎缩。降低高血压,对氧化损伤保护肾脏,销售税的衰减和猫活动由于蜂蜜补充证实tualang蜂蜜的有利影响高血压和氧化应激在萎缩。

4所示。材料和方法

4.1。材料

以下4.4.1。化学物质

硫代巴比土酸(稍后通知)、谷胱甘肽和GSSG买来Sigma-Aldrich(圣路易斯,密苏里州,美国)。谷胱甘肽:GSSG化验设备购买从Calbiochem(美国CA)。SOD、GPx化验用品购买从开曼群岛(美国MI)。从Bio-Rad Bio-Rad蛋白质化验设备购买(美国)。RNA后解决方案和RNeasy迷你包购买试剂盒(希尔登,德国)。互补脱氧核糖核酸合成装备购买从Bioline(美国伦道夫)。引物是购自1日基地(新加坡)。由于“快速上手”项目普遍SYBR绿色大师(火箭)购买的罗氏诊断(美国的)。所有其他化学物质均为分析纯商业来源获得。

4.1.2。动物

所有实验协议是马来西亚理科大学动物伦理委员会批准,马来西亚[子结构/动物伦理批准/ 2009 / (46)(145)]。雄性自发性高血压(月)和Wistar-Kyoto WKY大鼠,12 - 14周大,得到从马来西亚理科大学的实验动物研究中心,健康校园,吉兰丹、马来西亚。老鼠适应于动物的房间条件前至少一个星期的实验。处理的动物是在遵守制度动物保健和使用指南用于科学目的。聚丙烯的笼子里的动物被关在笼子里单独在通风良好的动物房间黑暗12 h / 12 h-light周期(灯7.00点。,灯光从7.00点)和控制温度(25±2°C)。所有的老鼠都免费标准饮食和饮水随意。

4.1.3。Tualang蜂蜜

Tualang蜂蜜(AgroMas、马来西亚)是由联邦农业营销权威(法玛),吉打州,马来西亚。蜂蜜有以下成分:总还原糖(67.5%)(果糖(29.6%)、葡萄糖(30.0%)、麦芽糖(7.9%)、果糖/葡萄糖比值(0.99)],蔗糖(0.6%)和水(20.0%)。蜂蜜与蒸馏水稀释之前(1:1)管理。剂量(1.0 g / kg)选择基于我们之前的研究(21]。

4.2。方法

4.2.1。准备治疗

WKY和月老鼠被随机分为四组组成的六到七个老鼠。动物一旦每天通过口服填喂法治疗12周如下:组1:WKY大鼠收到蒸馏水(0.5毫升)。组2:WKY大鼠收到tualang蜂蜜(1.0克/公斤体重)。组3:月接种蒸馏水(0.5毫升)。第四组:月接种tualang蜂蜜(1.0克/公斤体重)。

4.2.2。测量收缩压(SBP)

SBP是测量在有意识的老鼠tail-cuff plethysmographic无创性方法(美国生命科学179)每两周如前所述[12]。简而言之,有意识的老鼠放在加热板温度控制的空间。他们被允许平静与尾部放置约15分钟内尾巴袖口。袖口膨胀,释放几次条件下动物的过程。连续四个测量然后采取一个尖尾血压监测,记录下学生示波器(美国哈佛大学仪器有限公司)。每个SBP平均4个人获得的读数。

4.2.3。处理组织

治疗12周后,动物被牺牲了。左侧肾脏迅速切除,洗在冰冷的磷酸盐,涂抹并立即存放在−80°C到处理。冰冻的左肾被允许在冰解冻。匀浆10% (w / v)准备在Tris-HCl (0.1 M, pH值7.4)的援助组织研磨机配备了一个电机驱动的磨砂玻璃杵(美国Glas-Col)每分钟900年革命(rpm)。匀浆在1000×g离心10分钟在4°C冷冻离心机清除组织质膜碎片的碎片没有降水。得到的上层清液用于测定总蛋白,抗氧化酶的活动,以及氧化应激的标记。

4.2.4。脂质过氧化(法律流程外包)测定

法律流程外包被确定为MDA的浓度根据Ohkawa等的方法。68年]。简单地说,100年μL(肾匀浆MDA标准10% (w / v)或用移液器吸取到试管含1.5毫升的20% (v / v)冰醋酸(pH值3.5),200年μL 8.1% (w / v)钠十二烷基硫酸盐(SDS), 1.5毫升的0.8% (w / v)稍后通知,和700年μL的蒸馏水。试管是在95°C的环境为60分钟每个试管的大理石上。孵化后,试管被冷却,然后在3000×g离心10分钟。MDA的含量测定形成spectrophotometrically 532海里。1,1,3,3-Tetraethoxypropane (TEP), MDA的一种形式,被用来在这个试验标准。MDA浓度被表示为nmol MDA /毫克的蛋白质。

4.2.5。总谷胱甘肽氧化减少,化验

总谷胱甘肽和GSSG估计使用谷胱甘肽:GSSG比率分析工具包(美国CA Calbiochem)根据制造商的指示。谷胱甘肽被计算。简而言之,肾脏匀浆10% (w / v)在偏磷酸脱去蛋白质的5% (w / v)离心机,上层清液用于谷胱甘肽的估计。GSSG化验,肾脏匀浆立即与thiol-scavenging混合试剂,1-methy-2-vinylpyridinium trifluoromethanesulfonate derivatize谷胱甘肽。样本顺序混合色原5、5′-dithiobis-2-nitrobenzoic酸、谷胱甘肽还原酶和NADPH。每个样品的吸光度被记录在412 nm,反应速率决定。一个标准曲线构造使用一个已知数量的谷胱甘肽标准。谷胱甘肽和GSSG浓度的计算是通过对标准曲线线性回归。GSH / GSSG比率计算公式[比率=(谷胱甘肽−2 GSSG) / GSSG]。谷胱甘肽和GSSG浓度表示为纳米每毫克谷胱甘肽的蛋白质。

4.2.6。总抗氧化状态(助教)测定

助教的方法测定Koracevic et al。69年]。简单地说,10μL(肾匀浆10% (w / v)是用移液器吸取在试管中含0.49毫升的100毫米磷酸钠缓冲区(100毫米)。其次是增加0.5毫升10毫米苯甲酸钠(10毫米)解决方案,0.2毫升Fe-EDTA混合物准备从2毫米EDTA溶液和Fe (NH 2毫米₄)₂(所以₄)₂解决方案,和0.2毫升的H₂O₂(10毫米)的解决方案。每个样本都有自己的控制(空白),1毫升的醋酸(20%)添加紧随其后的0.2毫升Fe-EDTA混合物和0.2毫升的H₂O₂(10毫米)。负控制(用磷酸盐缓冲代替肾脏匀浆)包含类似的试剂与样品试管也准备好了。这些试剂的添加后,试管在37°C涡和孵化60分钟。其次是增加1毫升的醋酸(20%)(仅样品试管)和稍后通知0.8% (w / v)。反应管在100°C孵化10分钟。冷却到室温后,混合物的吸光度测定spectrophotometrically对蒸馏水在532海里。肾脏匀浆助教水平计算使用尿酸作为标准。助教是表示为nmol尿酸相当于每毫克的蛋白质。

4.2.7。超氧化物歧化酶(SOD)的测定

美国SOD活性测定使用开曼群岛(MI)试验设备根据制造商的指示。这个分析工具使用的四唑盐检测超氧化物自由基生成黄嘌呤氧化酶和次黄嘌呤。一个单位的草皮被定义为所需的酶表现出50%的歧化作用啊₂^•−。SOD测定措施的所有三种类型的SOD(铜/锌、锰、和FeSOD)。

4.2.8。谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)测定

GPx活性测定使用开曼群岛(美国MI)试验设备根据制造商的指示。这个工具包措施GPx活性间接通过与GR。GSSG耦合反应,由GPx产生氢过氧化物的还原回收其国家减少了GR和NADPH。NADPH的氧化是伴随着吸光度下降在340海里。一个单位的GPx被定义为1的催化氧化的酶量nmol NADPH的每分钟25°C。

4.2.9。过氧化氢酶(CAT)测定

猫活动是根据测量的方法,哥特(70年]。简而言之,这个实验涉及的孵化样品试管包含0.5毫升的过氧化氢(65毫米)和0.1毫升的肾脏匀浆10% (w / v)。孵化后60秒37°C,酶反应是停止的0.5毫升的钼酸铵(32.4毫米)的解决方案。钼酸铵和过氧化氢的黄色复杂然后测量spectrophotometrically 405海里。一个单位的猫被定义为1的催化分解的酶量μ过氧化氢的摩尔每分钟。

4.2.10。谷胱甘肽还原酶(GR)测定

GR活性化验的方法Goldberg和斯普纳71年]。简单,1毫升的2.728毫米GSSG解决方案和40μL(肾匀浆10% (w / v)孵化5分钟37°C。孵化后,反应是由200年的μL(1.054毫米NADPH的解决方案。减少吸光度是使用分光光度计测量在340 nm和记录每30秒的时间5分钟。GR活动表示为单位每毫克蛋白基于摩尔消光系数L / mol /厘米。一个单位的GR被定义为1的催化氧化的酶量nmol NADPH每分钟。

4.2.11。Glutathione-S-Transferase(销售税)测定

GST活性化验的方法Habig et al。72年]。短暂的2毫升0.3磷酸钾缓冲(pH值6.35),75年μL(30毫米CDNB解决方案,725年μL(蒸馏水和0.1毫升的肾脏匀浆10% (w / v)被用移液器吸取进试管。试管是涡和孵化37°C 10分钟。孵化后,反应是由100年的μ30 L mM-reduced谷胱甘肽的解决方案。减少吸光度测量spectrophotometrically在340 nm和记录每30秒4分钟。销售税活动每毫克蛋白基于单元计算的摩尔消光系数L / mol /厘米。销售税的一个单位被定义为的酶催化每分钟1 nmol GSH-CDNB的接合。

4.2.12。蛋白质的测定

蛋白质浓度估计使用Bio-Rad化验设备基于布拉德福德的方法(73年]。使用牛血清白蛋白标准曲线生成作为标准。

4.2.13。即时逆转录-聚合酶链反应(rt - pcr)测定

切除肾脏被存储在RNA后解决方案(试剂盒、希尔登,德国)一夜之间在4°C转移到−80°C到隔离的RNA。总RNA分离使用RNeasy迷你包(试剂盒、希尔登,德国)根据制造商的指示。RNA在40筛选了μL RNase-free水。孤立的RNA是量化的浓度在260 nm使用无限200 NanoQuant(美国Tecan)。阅读材料的吸光度的比值在260 nm和280 nm (一个260 /一个280),从1.95到2.10,被用来估计纯度的孤立的RNA。提取RNA的完整性检查1%琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色。长串互补脱氧核糖核酸合成使用互补脱氧核糖核酸合成装备(Bioline、兰多夫、美国)根据制造商的指示。简而言之,长串互补脱氧核糖核酸的合成是由孵化PCR管包含1μ1 g的孤立的RNA, uL的低聚糖(dT)₁₈在65°C, 10毫米核苷酸10分钟。管是在冰上冷却2分钟。4 uL 5 x RT缓冲区,1 uL的核糖核酸酶抑制剂,0.25 uL逆转录酶和4.75 uL DEPC-treated水被添加到RNA。在37°C反应混合物是孵化15分钟,其次是孵化42°C为另一个15分钟,最后在45°C的环境30分钟。在70°C反应被终止孵化15分钟在冰上冷却紧随其后。

一系列的测试,以确保执行引物是具体的和有效的。不同浓度的引物进行了分析通过执行积极和消极控制PCR在几个退火温度,从54°C到68°C。PCR产物受到1.5%琼脂糖凝胶电泳检测引物特异性引物二聚体的存在与否。逆转录聚合酶链反应(rt - PCR)进行量化使用Mx3000P实时PCR仪(美国TX Stratagene)。每个PCR反应包含2μ12.5 L的cDNA、μL 2×由于“快速上手”项目普遍SYBR绿色大师(火箭)(美国在罗氏诊断),0.5μL 300海里的向前,和反向引物和14.5μL PCR-grade水。对于每一组引物,没有模板的控制聚合酶链反应混合物cDNA受到PCR并行排除潜在的DNA样品制备过程中遗留。反应进行的96孔板,和PCR扩增协议之后。放大了35周期在95°C的变性1分钟,退火55°C - 68°C(特定于每个基因)1分钟,在72°C和扩展了1分钟,其次是融化曲线阶段。融化曲线前阶段,孕育了PCR反应混合物在95°C 1分钟,然后增加到55°C,持续30秒。融化曲线分析然后进行通过增加温度从55°C到95°C仪器发生的违约率为0.2°C /秒。然后仪器上的荧光数据收集55 - 95°C匝道持续约15分钟。postamplification融化曲线确认单一PCR产物的存在。PCR产物的质量分析1.5%琼脂糖凝胶电泳。rt - pcr实验中使用的引物序列的基础上发表的序列,合成了一垒(新加坡)根据cDNA序列从GenBankTM数据库获得老鼠。 The quantitation of the each target gene in all the samples was normalized toβ肌动蛋白的表达。的引物序列β肌动蛋白(作为看家基因),CuZnSOD,猫和GPx [74年],MnSOD [75年),销售税,α(76年],GST-Π[77年],Nrf2 [78年)如表所示3。褶皱的变化目标基因表达计算使用方法(79年]。使用方法,连续稀释的cDNA进行验证每个目标基因的扩增效率和看家基因。C均值_T计算目标基因和看家基因。C之间的区别_T目标基因和C_Tβ肌动蛋白被用作。正常血压对照组WKY担任校准器。每组大鼠的信使rna表达水平呈现褶皱变化相对于信使rna表达水平的WKY大鼠的控制。

4.2.14。统计分析

使用SPSS 18.0.1进行了统计分析。使用独立的样本数据进行了分析以及识别的意义区别WKY和萎缩。重复测量方差分析是用来分析和比较收缩压和体重在时间进程。数据表示为±SEM。分析抗氧化酶活动和氧化应激标记,每组由六到七个老鼠。分析mRNA的表达抗氧化酶和Nrf2,每组由四到五大鼠。

5。结论

这些结果表明,细胞或组织可能增加组件的抗氧化防御系统以增加细胞抵抗和防止氧化应激的有害影响。然而,这种适应性反应可能并不总是预防氧化损伤。来自本研究的发现也表明Nrf2的表情,一个潜在的renoprotective转录因子,明显减少或受损的肾脏萎缩。此外,我们的研究结果显示,抗氧化酶的感应,也许作为补偿机制,尽管可能发生损害或者减少Nrf2的mRNA表达。蜂蜜的政府保护肾脏氧化损伤和变弱氧化应激在月抗氧化防御系统。这些honey-treated萎缩也表现出减少SBP。总之,蜂蜜补充抒发抗高血压效应通过改善肾脏的氧化应激萎缩。将来进一步的研究可能会帮助建立高血压的联系表达下调活动和表达Nrf2反之亦然的萎缩和/或人类高血压。与我们的结果,我们期待一个新的兴趣研究调查如何以及在多大程度上这种转录因子;Nrf2可能与其他机制引起或加重高血压。

确认

这项工作是支持的资助(1001 / PPSP / 81202020)从马来西亚理科大学()。第一作者是感谢超声电机奖学金的奖励。我们承认博士Teguh Haryo Sasongko,今天女士”协议,-阿里芬哈桑先生,先生Koh Chun山楂的援助在实验室程序。我们也表达我们的感谢联邦农业营销权威(法玛),吉打州,马来西亚提供tualang蜂蜜。