文摘

黄芪mongholicus邦基集团长期以来一直用于治疗心血管疾病的中药。然而,它的机制尚未完全了解。在这项研究中,我们探讨了黄芪的潜在机制和总类黄酮的保护作用(组织)使用体外实验和食源性动脉粥样硬化性心血管疾病上的兔子。我们确定了六个组件及其组织的比例。动物实验表明,组织显著降低血浆总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇(0.01),增加高密度脂蛋白胆固醇水平(),减少面积由43.6 - 63.6%(主动脉脂质条纹)。我们还发现,组织回收超氧化物和羟基自由基效果增加更高的组织浓度。在体内实验中,组织有效地抑制缺血再灌注中的自由基光谱模块。总之,组织的活性成分黄芪mongholicusBunge,有利于心血管疾病将强力的抗氧化活性,改善动脉粥样硬化。

1。介绍

中药(TCM)拥有超过五千年的历史。它对人类健康做出了出色的贡献不仅因为它是用于治疗许多疾病,而且对其好处在健康维护。黄芪mongholicusBunge是中医的气补充药物和起重等有许多影响沉阳,增强防御能量和表面的阻力,促进脓液排出和组织再生,诱导利尿治疗水肿(1]。有很多用这种草药在现代医学研究。结果表明,某些提取了影响如改善免疫功能,降低血压2- - - - - -5]。许多生物活性研究与特定组件的草本植物,如皂苷和多糖,也已发表(6,7]。然而,很少有报道黄芪黄酮类化合物的生物活性。

黄酮类化合物被发现在大多数地区的植物和被认为与多个生物活动,如抗癌、抗炎、抗菌、抗病毒和提高免疫力的影响(8- - - - - -10]。最近,类黄酮的抗氧化活性引发了关注。许多黄酮类化合物抗氧化活性大于抗氧化维生素,维生素C,维生素E,,β胡萝卜素(11,12]。本研究的目的是确定黄芪总类黄酮(组织)可以抑制动脉粥样硬化的形成和潜在机制的一系列实验。

2。结果

2.1。组织的化学成分

目前的研究表明,组织包含6个化学成分包括β谷甾醇、芒柄花黄素calycosin、胡萝卜甙formononetin-7 -O- - - - - -β-D-glucopyranoside, calycosin-7 -O- - - - - -β-D-glucopyranoside。所有这些组件与先前的报道是一致的(13- - - - - -15]。他们的化学结构被显示在图1。

2.2。组织对动脉粥样硬化形成的影响

2.2.1。体重

体重是一个重要的参数监控的一般健康状况。我们的研究显示,兔子的体重平均增加了0.52公斤的普通食物组在实验期间。然而,平均体重减少0.30公斤的动物喂高胆固醇的饮食。净体重治疗兔子没有明显不同与高cholesterol-fed单独组()。

2.2.2。血浆血脂

表1总结了在五组动物血浆脂质形象。总胆固醇在接触实验饮食所有组没有明显不同。的总胆固醇水平组在12周期间保持不变,但也有显著增加在4周后所有high-cholesterol-fed组与A组相比在4和12周,组织(和维生素E + C)预防食源性增加脂质,所以他们对待动物的血浆总胆固醇水平明显低于动物高脂肪饮食没有组织(来)。然而,总胆固醇的水平没有显著差异在所有动物收到8周高胆固醇的饮食。

每饮食血浆高密度脂蛋白胆固醇水平在所有兔子没有不同。高密度脂蛋白胆固醇值也没有显著改变在A和b的值组高密度脂蛋白胆固醇增加时间的方式治疗组()。组C, D, E,尽管高密度脂蛋白胆固醇水平数值增加与B组在12周相比,只有更高水平的高剂量治疗组组织()(表1)。

每饮食水平的低密度脂蛋白胆固醇在所有实验兔子没有不同。低密度脂蛋白胆固醇正常的食物组的值没有改变期间的观察,但所有组的水平显著增加,逐步接受高胆固醇饮食()。数据还显示,低密度脂蛋白胆固醇的水平显著降低了组织(E组)4和8周(和、职责)和维生素E + C (在4周)。然而,低密度脂蛋白胆固醇的水平没有显著差异与B组相比,治疗组在12周(表1)。

表1还显示在所有组血浆甘油三酯的水平0,4、8、12周。该集团在实验期间甘油三酸酯水平正常。甘油三酸酯的水平均呈增长趋势在时间的方式(在所有的动物收到1%的高胆固醇食物。甘油三酸酯的水平在动物治疗维生素E + C与B组相比均有显著降低12周()。虽然bycompared TFA-treated动物中甘油三酯含量下降了13%,B组,不具有统计学意义。

2.2.3。在主动脉脂质条纹

主动脉壁的内皮表面检测动脉粥样硬化斑块。脂肪条纹的变化区域,总胆固醇的含量在主动脉弓,和内膜比媒体平均厚度在所有的组列于表2。结果表明,高剂量的组织可以显著降低脂肪条纹区()和胆固醇减少主动脉弓的内容(),而内膜媒体平均厚度的比例也明显下降()两种剂量的组织相比,b组维生素E治疗+ C也减少脂肪条纹区()、主动脉弓的内容减少胆固醇(),减少内膜比媒体平均厚度()。

组织学的横向部分主动脉与苏木精伊红染色是图所示2。数据2(一个)和2 (b)显示内部弹性板的厚度显著增加在cholesterol-fed兔子相比正常的食物组。当主动脉被放大到100 x 400 x,与增殖的平滑肌细胞有丰富的变化,大量泡沫细胞2 (d)和2 (f)和脂质湖泊图2 (f)在脂肪斑块cholesterol-fed兔子。

表2还总结,主动脉弓的胆固醇含量的变化和内膜比媒体平均厚度在所有兔子。我们发现在主动脉弓胆固醇的浓度也显著大于在兔子收到高胆固醇食物(对于所有)。与B组相比,主动脉弓的胆固醇含量显著减少组织的高剂量()和维生素E + C ()。

此外,内膜的比值的变化对媒体平均厚度显示比例显著降低了组织和维生素E + C (对于这两个组织剂量,维生素,分别地。、表2)。

2.2.4。血糖

葡萄糖的浓度在所有实验组没有显著不同的周0。他们保持不变在4周组和没有不同。B组的血糖水平均呈增长趋势,但不显著。在组织(60毫克/天)治疗组,尽管血糖水平增加约20 - 25%在8周、12与B组相比,这不是重要的。

2.2.5。抗氧化活性

收紧和结果α生育酚总结在表3和4,分别。数据显示,维生素E + C可显著提高收紧的水平α8周后生育酚(),而没有明显变化,血浆抗坏血酸盐和SOD与b组相比,组织没有明显改变收紧的水平,α生育酚、抗坏血酸盐和草皮。此外,没有发现统计关系之间的区域(抗氧化指数和主动脉脂质条纹)。

2.3。体外组织超氧化物和氢氧自由基清除效果

超氧化物自由基的捕获由DMPO-OOH DMPO导致形成加合物由ESR测量。图3 显示控制的波形频谱分析,对应于DMPO-OOH加合物,第一个峰被用于分析。组织浓度的0.12 g / L和1.2 g / L DMPO-OOH加合物的水平降低了和分别(图3)。图4 显示控制试验的波形频谱对应DMPO-OH加合物当DMPO陷阱羟基自由基的产生,第二个峰值被用于分析。组织为0.12 g / L和1.2 g / L DMPO-OH加合物的水平降低了和,分别。

2.4。组织对缺血性再灌注后体内自由基

在基线,自由基在孤立的心才确定生产Langendorff系统。然而,重头再来的氧灌注后1分钟10分钟缺血后使用Krebs-Hensleit方案,重要的自由基生产被确定(U / g wt,表5)。100 mg / L的引入组织显著降低自由基的水平的46.1,63.5,37.1%,1、5和10分钟再灌注,分别为()。

3所示。讨论

黄芪mongholicus邦基集团长期以来一直作为气中医的补充。实验和临床数据表明,黄芪有保护作用对心肌细胞损伤缺氧和病毒引起的炎症,可以改善动脉粥样硬化,引起血管舒张和降低血压16]。陆等人报道说一个黄芪当归混合物不仅能降低血清总胆固醇和甘油三酯的水平,而且还可以降低低密度脂蛋白胆固醇和载脂蛋白B水平()。光显微镜和免疫组织化学检查显示黄芪当归混合物可能导致减少肾小球硬化性指数()和减少脂肪条纹区()[17]。类似的结果也得到了其他实验动物(18和临床研究19]。

在目前的研究中,一个主要的发现是,组织,这是主要的活性成分黄芪mongholicusBunge,包含六个单黄酮化学成分。组织和维生素E + C可以显著降低血浆总胆固醇水平(表1),脂肪条纹,主动脉弓总胆固醇含量,斑块内膜/媒体厚度的比值(表2)。结果表明,组织,在高剂量,可以显著增加高密度脂蛋白胆固醇和降低低密度脂蛋白胆固醇,而维生素E + C可以在4周降低甘油三酯和低密度脂蛋白胆固醇水平与高胆固醇的饮食。此外,我们的数据还显示,组织具有良好的潜在影响在体外和体内自由基清除剂。

高胆固醇血症是动脉粥样硬化的重要危险因素。我们的数据表明,血浆总胆固醇水平在所有动物接收高胆固醇饮食明显增加,与一个强大的线性关系()。在动脉粥样硬化的早期阶段,组织和维生素E + C可以降低低密度脂蛋白胆固醇水平。组织的高剂量也导致增加高密度脂蛋白胆固醇值在高级阶段(12周)。维生素E + C的组合能显著降低血浆甘油三酯水平。支持我们的研究结果,双盲安慰剂对照的随机临床试验表明,长期补充nondepleted合理剂量的维生素E的男性单独或结合缓释维生素C减少脂质过氧化反应(20.]。然而,在此前的报告Kinlay et al。21和太阳等。22),他们没有说明一个重要保护作用在人类和动物油脂。的影响,因此,它是合理的组织和维生素E + C对脂质代谢的结合可能会参与其他机制除了抗氧化剂。

改性低密度脂蛋白在动脉粥样硬化的作用一直是一个相当大的兴趣和关注的话题。抗氧化剂在等离子体可能抑制动脉粥样硬化的形成有很大的好处。一些大型的流行病学研究表明,血浆维生素E水平是负相关的冠心病的发病率(23,24]。相当大的数据量的维生素E在预防动脉粥样硬化的作用已发表(22,25,26]。维生素E的主要潜在机制来防止动脉粥样硬化包括抑制低密度脂蛋白氧化(27),白细胞粘附抑制内皮细胞,改善血管内皮功能障碍(28]。Nagyova等人报道,血浆总抗氧化状态影响TBASR水平的低密度脂蛋白(29日]。我们的数据表明,收紧的水平α生育酚显著增加时间的方式与维生素E + C (,、职责)。收紧的水平α生育酚也显示良好的相关关系()。因此,收紧活动可能反映了维生素E摄入量。根据氧化改性假说,维生素E + C的保护作用与动脉粥样硬化的发展应该比组织,因为收紧水平显著提高。然而,结果表明,维生素E + C和组织的影响动脉粥样硬化指数(脂肪条纹,主动脉的拱门,总胆固醇含量和主动脉内膜比媒体平均厚度)没有明显不同。类似的结果已经被太阳et al .,报道的价值α生育酚明显高于血清和组织在服用维生素E和C cholesterol-fed兔子,但是没有面积显著减少主动脉脂质条纹(22]。一项研究报道,2%大蒜提取物可以显著减少动脉粥样硬化斑块,但抗氧化指标SOD没有改变(30.]。另一项研究表明,抗氧化剂如维生素E和航行对动脉粥样硬化的形成有不同的影响,认为这可能是由于不同的抗氧化性能31日]。此外,我们没有发现脂肪条纹面积之间的关系和等离子体水平的抗氧化指标,尽管他们中的一些人对待动物的显著增加。因此,抗氧化剂抑制动脉粥样硬化形成的机制可能与其他途径除了增加低密度脂蛋白的抗氧化。然而,这些指标的抗氧化活性的作用如收紧,抗坏血酸盐、胆红素、SOD,α生育酚作为标记的抗氧化剂抑制动脉粥样硬化仍需要进一步的证据。

越来越多的研究类黄酮。一些研究表明,黄酮类化合物似乎与降低心血管疾病的风险(32,33和制动动脉粥样硬化34]。多项研究表明,类黄酮的主要机制,抑制脂肪条纹在动脉粥样硬化病变的发展降低氧化低密度脂蛋白(35,36]。此外,Fuhrman等人报道,巨噬细胞浓缩与多酚类黄酮在体外或体内减少巨噬细胞氧化状态,随后细胞介导的氧化低密度脂蛋白(36]。茶类黄酮的影响的体外研究LDL氧化修饰的敏感性显著表明,茶类黄酮,支持长时间的滞后时间氧化低密度脂蛋白()。Macrophage-mediated也抑制低密度脂蛋白氧化通过添加这些茶类黄酮(37]。Yokozawa等人证明,红茶提取物抑制平滑肌细胞的增殖参与动脉粥样硬化的发展和进展和抑制氧化低密度脂蛋白的产生38]。伊斯梅尔等人认为,新鲜的大蒜降低胆固醇的影响可能主要归因于其黄酮类成分(30.]。

黄酮类化合物是天然植物性自由基食腐动物,许多黄酮类化合物被报道具有更好的抗氧化性能α生育酚在体外氧自由基吸收能力能力评估的方法(39]。黄酮类化合物清除自由基的充当一个氢原子捐赠者中自由基氧化还原反应(40]。组织,其中包含几种类型的类黄酮,具有的主要活性成分黄芪mongholicus邦吉。类黄酮提取的黄芪mongholicusBunge已报告含有不同数量的酚羟基(41]。我们的数据表明,组织有效地减少过氧化物的含量和羟基自由基剂量依赖性的方式也显著降低自由基水平后缺血/再灌注的孤立的老鼠的心脏。

总之,所带来的好处黄芪mongholicusBunge在动脉粥样硬化等心血管疾病可能是由于组织。的潜在机制组织抗氧化作用可能有助于抑制动脉粥样硬化。

4所示。材料和方法

4.1。组织的提取和纯化

的根源黄芪mongholicusBunge,来自内蒙古,中国,切片,在95%的乙醇浸渍,然后提取出来。乙醇提取的固体材料重复了四次,然后集中提取浓缩蒸发比重为1.35。集中解决方案与乙酸乙酯提取。集中的乙酸乙酯提取是通过不同类型的硅胶柱进一步分离。组织包含6个主要化学成分被紫外光谱、核磁共振和质谱。

4.2。药品和试剂

维生素E(横幅明胶产品Corp .)、钙、美国)是获得青睐香港有限公司。维生素C(罗氏公司)在沃森的超市购买。5,5-Dimethyl-1-pyrroline-1-oxide (DMPO),α-phenyl-N-tert-butylnitrone (PBN) diethyltriamine五乙酸(DETAPAC),次黄嘌呤(HX)、黄嘌呤氧化酶(XO),硫酸亚铁,过氧化氢从西格玛化学品购买(σ化学品,圣路易斯,密苏里州,美国),可用的最高等级。在使用前DMPO与活性炭纯化。组织准备在我们的实验室。

4.3。动物治疗动脉粥样硬化的形成模型

共有七十四个雄性新西兰白兔重2.7 - -3.5公斤的实验动物服务中心提供的香港中文大学。动物被安置分别与12小时光周期,空气的相对湿度,和房间的温度°C,美联储标准商业chow(格伦·福勒斯特Stockfeeds澳大利亚西部、澳大利亚)和水随意。兔子被随机分配到5组。A组(chow)接收正常。B组()收到高胆固醇饮食(1%胆固醇饮食、格伦·福勒斯特Stockfeeds公司,澳大利亚)。C组()有高胆固醇饮食+维生素(400 IU /天,500毫克/天,职责)。D组和E(兔子每15日)有高胆固醇饮食+组织(60或120毫克/天,职责)。所有的药品都由填喂法。空腹血来自所有的动物在周0,4、8和12对血浆脂质含量和抗氧化能力分析。12周后,兔子被公司牺牲₂。主动脉分离从心脏主动脉瓣。第一个5毫米从心脏在10%福尔马林固定缓冲溶液为后续组织病理学分析。主动脉的另一部分用于主动脉脂质条纹区域分析和总胆固醇含量的决心。这个实验动物研究伦理委员会批准的协议是香港中文大学。

4.4。血浆脂质分析和主动脉弓胆固醇测量

总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇,甘油三酯测定使用酶方法(瑞士巴塞尔罗氏诊断系统)在Cobas法拉离心分析器(罗氏、巴塞尔、瑞士)。

主动脉弓胆固醇含量测定的方法描述了卡尔等人与一些修改(42]。主动脉弓单一化50毫克的硫酸钠和8毫升的萃取溶液含氯仿/甲醇(2:1),转移到另一个管和第二次组织单一化紧随其后的3毫升的提取方案。混合后,3毫升的解决方案包含1.25%的氯化钾和0.05%的H₂所以₄添加和离心机在400 g在室温下10分钟。底层传输和上层清液reextracted 3毫升的萃取溶液在室温下和离心机在400 g 10分钟。底层与前一步转移和集中。解决方案主要集中在40°C变暖浴和置于N₂气体。大约一半的溶液蒸发时,1毫升氯仿triton - 100年增加了1%,混合,蒸发干燥。然后,500年μL蒸馏水是添加到样品,在37°C都摇动了30分钟溶解脂质。肝组织总胆固醇浓度决定使用一个酶方法模型KC4标仪(美国Bio-Tek仪器,Inc .)在490 nm波长。

4.5。生产总值(gdp)和主动脉壁组织学外观

主动脉被浸沾在苏丹III 2小时。腔的表面被数字成像扫描(扫描喷射5100 c,惠普)和fatty-streak表面积的百分比由数字化彩色图像使用MetaMorph成像系统(美国通用成像Corp .)。在主动脉的第一部分固定在10%福尔马林缓冲溶液48 h,它是嵌入在石蜡。石蜡的4μ米厚度的主动脉被削减和沾标准hematoxylin-eosin污渍。从每一块四个部分被削减。

4.6。抗氧化能力的参数

等离子体的总抗氧化能力测定使用等离子体的铁还原能力(收紧)试验43]。α生育酚测定的荧光的micromethod [44),使用纯DL - (> 98%)α生育酚(默克公司,达姆施塔特,德国)校准器。抗坏血酸盐是衡量Cobas法拉离心分析仪(巴塞尔瑞士罗氏诊断有限公司)45]。血浆超氧化物歧化酶(SOD)水平测定使用luminolchemiluminescence [46]。

4.7。组织的体外自由基清除效果

超氧化物自由基生成从hypoxanthine-xanthine氧化酶反应系统,由DMPO困,自旋加合物(DMPO-OOH)分析使用ESR谱仪(力量esp - 300光谱仪,Ettlingen,德国)(47]。反应溶液的过程如下:25μL包含0.43更易/ L HX 160更易与L DMPO 1更易/ L DETPAC, 70 U / L XO, 25岁μL 0.05 mol / L的pH值7.4 PBS或组织(最终浓度0.12或1.2 g / L)不一。50μL立即被转移到一个石英ESR细胞分析DMPO-OOH的自旋加合物。每个样本重复4次。

芬顿方法论的羟基自由基生成包含0.6更易/ L H管₂O₂,80年5更易/ L EDTA更易与L DMPO,和0.2 L更易与硫酸亚铁。25μ这个解决方案的L和25μL 0.05 mol / L的pH值7.4 PBS或组织(最终浓度0.12或1.2 g / L)涨跌互现,立即转移到一个石英ESR细胞(47]。分析了自旋加合物(DMPO-OH)进行了ESR谱仪。每个样本重复4次。

谱仪设置如下:X乐队25千赫的调制频率;调制振幅1 G;扫描宽度100克;微波功率10兆瓦;时间常数20 ms;中心磁场3470克;磁频率9.7 GHz。清除速率计算基于peak-trough高度(,数据1和2)。第一和第二光谱的峰值是用于超氧化物和羟基自由基,分别为对照组相比。扫气率(%)=[(平均对照组peak-trough高度−测试组peak-trough高度)/平均对照组peak-trough高度]×100。

4.8。自由基清除效果的组织包括心脏

总共20威斯特老鼠,220 - 250克,50%的男性,在实验动物服务中心提供的中国人民解放军总医院,北京,中国。老鼠被随机分为对照组和组织(100 mg / L)治疗组。老鼠犀牛有1%戊巴比妥(i.p。40毫克/公斤),然后200 IU肝素。无意识的老鼠的箱子打开了,心中孤立和引入Langendorff系统。37°C, pH值7.2 - -7.4灌注方案由Krebs-Henseleit解决方案,包含3更易PBN [48),和95%氧气和5%二氧化碳饱和之前使用。灌注的气体应用解决方案在1.5升/分钟7.09 kPa的压力。条件相同的两组TFA-treated集团除了灌注液含有100 mg / L组织。孤立的心被灌注了15分钟,然后10分钟的系统被关闭导致局部贫血的心。系统随后reperfused 10分钟。灌流液收集在基线和1、5、10分钟后再灌注测量的自由基。这个实验协议是医学伦理委员会批准的研究在中国人民解放军总医院的练习。

灌注的解决方案(3毫升/样本),0.5毫升甲苯是补充道。上层清液,在800转离心5分钟后,被自由基浓度的测定使用ESR谱仪(49]。自由基信号PBN的加成物的浓度成正比。peak-trough高度中心的峰值测量(毫米)和自由radical-PBN加合物的浓度表示为单位发布的每分钟每克湿心脏肌肉组织(U / min.g)。

4.9。统计分析

给出的值。Bonferroni测试被用来找到组和药物之间的统计学意义。一个概率值小于0.05被认为是显著的。所有的分析都使用SPSS软件进行(版本10.0,1999)。

确认

这项工作得到了国家自然科学基金委的基金(没有:30572349)。作者要感谢所有部门的同事输血和临床生物化学、中国人民解放军总医院。