文摘

Water-filtered infrared-A (wIRA)辐射被认为是支持组织再生。我们试图调查详细wIRA效应在不同的温度下与乙二醛3 t3成纤维细胞治疗诱导形成先进的糖化终端产品(年龄)。未照射和nonglyoxal-treated细胞作为控制。实验进行了一系列37^∘-45年^∘C的温度监测温度和wIRA区分效果。代谢活动被刃天青试验评估。线粒体膜电位是评估JC-1活体染色。凋亡的变化测定活体染色膜联蛋白V和YO-PRO-1 subG1 DNA含量测定。温度有一个显性效应覆盖wIRA或乙二醛治疗效果。凋亡细胞的数量明显高于45^∘C,在健康细胞的百分比显著低于45^∘c . WIRA辐照本身或与乙二醛结合治疗没有表露出任何破坏性影响的成纤维细胞的生理(37^∘-40年^∘C)或更高(42^∘-45年^∘C)温度比未经处理的控制。温度45^∘C,它可以发生在不恰当的应用红外辐射,破坏细胞即使没有wIRA或乙二醛应用程序。

1。介绍

Water-filtered infrared-A (wIRA)辐射被成功应用于临床,尤其是在支持伤口愈合和组织修复,最近审查(1]。WIRA对应的很大一部分太阳的热量辐射,后到达地球表面被大气中的水蒸气过滤。水吸收红外辐射在0.75和2.4之间μm 4离散波长的范围,两个被infrared-A内,一个被从infrared-A过渡到- b,和一个在infrared-B(图1(一)蓝盒子)。这些吸收带出现的色彩地伸展自由水分子的振动。过滤infrared-A会导致一个不受欢迎的热负荷暴露组织。WIRA人为可以由散热器辐射的卤素灯通过试管装满水。典型wIRA散热器不发出紫外线辐射和几乎没有infrared-B - c辐射。图1(一)显示相对强度的红外线辐射器配有水试管过滤器。光谱与光谱比率的散热器没有水试管。激烈的吸水乐队约0.96μ1.19米,μ1.4 m,之间μm和1.55μm以及超过1.8μm是清晰可见。由于水的强烈吸收,没有光在1.4和2.4之间μ通过水的试管。

尽管大量的出版物展示的有利影响wIRA辐照体内受伤组织和体外细胞培养(2- - - - - -5),其他的研究表明,wIRA辐照是有害的细胞培养(6]。然而,这些研究没有充分解决的影响仅仅是温度上升可能诱发的wIRA和可能造成损害健康或亚致死的强调细胞。这样temperature-evoked损害可能增加甚至乘wIRA可能带来的不利影响,例如,当应用不当。结合代谢压力,这些潜在的不利影响可能加剧任何有害影响wIRA和/或温度上升的细胞或组织。体外代谢压力可以由乙二醛。乙二醛是糖化反应的中间产品和原因的形成改变了蛋白质和DNA损伤产品,从而模仿强调糖尿病细胞代谢状态的情况。我们曾表明,乙二醛会导致加速生产先进的糖化终端产品(年龄),诱导细胞损伤和凋亡7]。乙二醛治疗也已被证明能够诱导衰老在人工培养的成纤维细胞8]。

在目前的研究中,wIRA辐射对健康的影响成纤维细胞或成纤维细胞损坏由乙二醛是评估在不同的温度下。使用乙二醛曝光以诱导糖尿病代谢状态的细胞。用亚致死的乙二醛的浓度,这强调了细胞,但不引起细胞死亡,我们能够区分损失由乙二醛诱发wIRA,温度,或这些方法的组合。这项研究表明,wIRA细胞本身并不产生任何有害的影响,而高温甚至覆盖的破坏性影响乙二醛。

2。材料和方法

2.1。辐照设置

细胞培养是配备一个外部wIRA散热器(Hydrosun Hydrosun 750年,Mullheim,德国;大约600 - 1400 nm)与光纤主要辐射进入孵化器(图1 (b))。散热器是配备一个过滤器阻塞波长780纳米以下排除影响由于可见光。发射器是细胞培养板上方放置4厘米。板块不断被放置在一个恒温控制的水浴(6升),因为水比空气更好的热传导。底部的温度变化的文化板块和一个温度传感器监控覆盖着一块9毫米²的铝箔不碰它从wIRA保护传感器。辐照强度是衡量radiophotometer(模型HBM1 Hydrosun)和设置交付30 mW /厘米²底部的盘子,对应于临床应用wIRA辐射60 - 120 mW / cm²[9]。WIRA辐照温度控制条件下应用在37°C, 40°C, 42°C, 45°C。未照射控制细胞在相同的孵化器在黑盒排除任何辐照否则同等条件下(图1 (b))。wIRA辐照前后,所有细胞都在第二个细胞培养孵化器孵化37°C(5%股份有限公司₂,96%的湿度)。

2.2。光谱测量

光谱的“Hydrosun 750散热器”记录与传统的傅里叶变换近红外光谱仪(向量22 / N,力量Optik GmbH, Ettlingen,德国)。辐射耦合进入光谱仪通过使用外部光源的港口。所有光谱测量4厘米⁻¹100年的分辨率和扫描氘triglycine硫酸(壳体)检测器。Hydrosun 750水箱没有水电池的光谱被用来作为参考。比光谱归一化最大强度。

2.3。温度调节和监控

实验前24小时,散热器是开启的。文化与介质板放在水浴和wIRA辐照。一个传感器被放置在底部的哦,和温度连续监测精度为±0.02°C使用电子测量装置(ALMEMO模型MA2590-4S, Ahlborn,德国)。孵化温度设定wIRA-induced温度上升的因素,通过温度调节平衡和短期可变性的水洗澡。在实验中,一个文化板块充满了媒介但没有细胞,并相应温度监控小传感器,允许区分热和wIRA辐射的影响。

2.4。细胞培养

在MEM 3 t3细胞培养(最低基本培养基鹰,w /谷酰胺,潘生物技术,Aidenbach,德国)补充5% FCS(胎牛血清,Biochrom,柏林,德国)。细胞被播种在25000细胞/厘米²到6-well板24小时在孵化前乙二醛(见图1 (c)试验大纲)。控制细胞孵化没有(正常代谢状态)或1更易与L乙二醛(σ,Deisenhofen,德国)诱导亚致死的代谢压力(糖尿病代谢状态)。乙二醛3和20小时后,细胞被辐照1 h和30 mW /厘米²wIRA(总剂量216 J /厘米²在24 h),或仍未照射,导致四个不同的治疗组:(1)控制没有wIRA,(2)控制与wIRA,(3)没有wIRA乙二醛,并与wIRA(4)乙二醛。wIRA辐照期间,恒温箱的温度也将37°C, 40°C, 42°C,或45°C到模拟热应力,这可能发生在wIRA不恰当的临床应用。同样未照射控制细胞暴露于热应力。

2.5。细胞毒性/代谢活动分析

刃天青,由细胞内氧化还原系统,转化为resorufin被用来确定细胞的代谢活动。细胞被播种在25000细胞/厘米²到96 -孔板和乙二醛处理和/或wIRA相同条件下如前面描述的那样(图1 (c))。刃天青(σ,Deisenhofen,德国)添加20 h后添加乙二醛根据制造商的指示。井没有细胞,但包含介质和刃天青作为空白。吸光度测量在600 nm 4 h后使用板读者(模型日出、Tecan、奥地利)。结果给出了不同吸光度()。

2.6。测定线粒体膜电位

细胞被播种在25000细胞/厘米²成8-chamber幻灯片(Labtek盖玻片系统Nunc,纽约,美国)和治疗在相同条件下与乙二醛和/或wIRA如上所述(图1 (c))。活体染色进行JC-1 (20μg / mL介质;英杰公司)在37°C为20 - 30分钟。样本立即photodocumented使用IX81荧光显微镜配备了一个观察FV2T摄像头驱动R软件(奥林巴斯,德国汉堡)。红色J-aggregates记录使用nm /纳米过滤,和绿色JC-1单体和一个记录nm /纳米过滤。

2.7。坏死和凋亡测定

坏死和凋亡细胞检测同时通过与碘化propidium坏死细胞活体染色,和膜联蛋白V或YO-PRO-1凋亡细胞。10000个细胞流式细胞仪在流式细胞仪分析了石中剑(美国,正欲富兰克林湖)。坏死和凋亡细胞的比例与BD CellQuest计算软件。

FITC-conjugated膜联蛋白V (ImmunoTools、Friesoythe、德国)稀释绑定缓冲区包含10更易与L玫瑰(N-2-hydroxyethylpiperazine-N′2-ethanesulfonic酸),pH值7.4,2.5 140更易/ L氯化钠,更易与L CaCl₂。细胞收获和孵化50μL膜联蛋白V和1的解决方案μL propidium碘溶液(1毫克/毫升蒸馏水)5分钟在黑暗中在室温下。细胞被流式细胞术分析使用纳米过滤膜联蛋白V和纳米过滤propidium碘。

YO-PRO-1染色,细胞收获和孵化50μL PBS和1%的马血清包含1(品牌,韦特海姆,德国)μL YO-PRO-1 (100μmol / L在DMSO)和1μL propidium碘(1毫克/毫升蒸馏水)20分钟在黑暗中在室温下。流仪分析使用纳米过滤YO-PRO-1和纳米过滤propidium碘。

凋亡细胞也被检测到核染色固定细胞的量化与DNA含量小于细胞的数量在细胞周期G1期(subG1-DNA内容)。细胞收获和固定在70%乙醇室温5分钟。50μ包含1 L磷酸盐(PBS)μL propidium碘溶液(1毫克/毫升蒸馏水)和1μL核糖核酸酶(> 7 U /μL,罗斯,卡尔斯鲁厄的德国)被添加到细胞,样本孵化为30分钟在黑暗中在室温下。细胞凋亡细胞核被流式细胞术检测使用纳米过滤器,产生一个广泛subdiploid峰值,可以很容易地区别nonapoptotic的窄峰,二倍体细胞。凋亡细胞的比例计算直方图。

2.8。统计分析

所有化验进行至少6次。值作为。统计分析是由多因子的单变量方差分析(多路方差分析)(Bonferroni-test)其次是事后分析。α错误是适当调整,和意义被接受。使用SPSS 17.0统计分析(美国芝加哥)。

3所示。结果

3.1。代谢活性和线粒体膜电位

代谢活动决心使用刃天青转换试验。刃天青衬底,发生颜色变化响应减少作为细胞代谢活动的指标。使用这个试验,观察到细胞的代谢活动是大大降低在45°C统计显著性高相比,细胞的代谢活动培养另一温度(图2条形图)。细胞的代谢活动在42°C也显著高于在37°C。

重要的染料JC-1渗透细胞膜和线粒体基质中选择性地积累。它形成红色荧光J-aggregates在存在高度负线粒体膜电位,但存在去极化的条件下绿色的单体。染色活细胞JC-1透露,wIRA辐照,与乙二醛孵化,或两者结合对细胞没有明显的影响(图37°C2显微摄影小组)。当温度上升到45°C,线粒体去极化的出现无论wIRA辐照或乙二醛治疗,表明温度对线粒体膜电位(图上的显性效应2显微摄影小组)。

3.2。坏死和凋亡

Propidium碘膜impermeant,只能进入细胞,破坏了膜。积累在细胞核和插入核酸,从而发出红色荧光特征。因此,与碘化propidium允许活体染色,确定坏死细胞的数量。的数量propidium iodide-positive坏死细胞明显高于文化中保持在45°C比在其他温度下的培养(图3(一个)),确认结果刃天青转换和JC-1染色。乙二醛的影响和/或wIRA相比可忽略不计的温度和没有显著影响细胞,表明温度对显性效应。

磷脂酰丝氨酸,发现专门的内部传单健康细胞的细胞膜,是转移到外层细胞膜传单在细胞凋亡的早期阶段。膜联蛋白V结合专门磷脂酰丝氨酸,可以用来确定凋亡细胞的显微镜和流式细胞术。因为膜联蛋白V还可以进入坏死细胞,然后绑定到磷脂酰丝氨酸在内心的传单,坏死细胞必须从凋亡细胞同时歧视与碘化propidium标签。图3 (b)显示膜联蛋白V荧光强度在propidium iodide-negative细胞,这是在45°C显著高于其他温度下。这个敏感的方法进一步透露,wIRA对细胞没有明显影响。

核细胞膜健康细胞YO-PRO-1不透水,但这种染料容易穿透凋亡和坏死细胞的核膜。然后插入DNA和发出绿色荧光特征,从而允许精确和可再生的细胞死亡的量化。碘化双标签和YO-PRO-1 propidium至关重要的条件下显示绿色荧光细胞凋亡和坏死细胞由红色和绿色荧光,而可行的细胞保持nonfluorescent。YO-PRO-1-positive的比例,propidium iodide-negative细胞明显不同细胞治疗37°C和细胞治疗45°C但是其他温度相比不显著。WIRA辐照显著减少凋亡的比例,YO-PRO-1阳性细胞无论温度,而乙二醛产生(图没有显著影响3 (c))。

标签与碘化propidium允许固定细胞,以确定每个细胞的DNA含量与荧光强度相关,可以用来执行细胞周期分析。凋亡细胞DNA片段subG1-DNA内容可以被识别。细胞的百分比sub-G1-DNA 45°C含量明显高于在其他温度和显著降低42°C比37°C(图3 (d))。温度施加的影响占主导地位,这样,无论温度,任何重大的影响乙二醛和/或wIRA没有观察到。

4所示。讨论

Infrared-A辐射显示加速体内细胞和组织修复(10),提高康复感染,缺血、缺氧,有毒伤害(11- - - - - -15),并减少受伤的视神经变性或创伤性脑损伤(16,17]。先前的研究和评论报道成功的临床应用wIRA辐射患者急性和慢性伤口,sclerodermia,当地脂肪减少,或光化性角化病1,4,18- - - - - -20.]。也表明,辐照与红灯(630海里)可能有助于治疗糖尿病伤口的11];因此,它也可能认为治疗受损等wIRA施加有益的影响伤口愈合。

本研究调查的影响进行详细wIRA在成纤维细胞在正常和新陈代谢强调条件由于成纤维细胞发挥重要作用在结缔组织和伤口修复。最近,矛盾的研究发表的证明或正面wIRA对成纤维细胞的影响(21,22),或显示不良的包皮成纤维细胞的细胞反应wIRA辐照,作者认为红外辐射(6]。然而,无论是作者的分化之间的温度变化引起的热中性的wIRA和效果的影响。因此我们研究的一个重要目的是区分的影响wIRA仅和那些可能发生的由于温度升高wIRA辐照wIRA的因为不适当的应用程序或独立于wIRA [21,23]。在我们的实验中,温度是不断仔细监测和控制使用电子测量仪器和传感器位于底部的文化板块在中读。此外,细胞培养板被放置在一个大浴缸,因为水比空气温度变化反应慢,促进辐照期间保持一个恒定的温度。我们使用鼠标3 t3成纤维细胞,一个定义良好的特征明显,纤维母细胞细胞株与一个稳定的增长率。纤维母细胞的一些文化被暴露于乙二醛强调为了调查wIRA辐射对成纤维细胞发生氧化应激的影响类似于糖尿病的代谢状态。

可以观察到不良反应发生的独立wIRA辐照和未照射细胞也见过。实验表明,温度对细胞产生显性效应和被证明是唯一的显著影响因素。在生理温度37°C和40°C,没有破坏性影响成纤维细胞培养观察无论是否wIRA应用。在更高温度下的42°C和45°C,负面观察细胞反应发生在每一个治疗组,即独立于是否wIRA和/或乙二醛,仅仅归因于热影响。这是同意的一项研究结果显示,爱尔兰共和军的有益影响主要神经元细胞培养(12),而另一项研究显示没有wIRA人类的破坏性影响成纤维细胞即使在高辐照度,只要适当的温度不超过23]。此外,结果表明,人体皮肤表面的展品表面温度只有37°-39°C wIRA时适当即使在高辐照度[5,24]。在其他实验在高温下进行的,有害的影响被证明是独立,无论wIRA[的应用23]。皮下和其他结缔组织的温度不超过皮肤表面温度与wIRA辐照下,wIRA,当应用于适当的治疗辐照度和剂量,不会导致临界温度的增加(2]。

之前我们可以表明,乙二醛诱发的形成年龄,导致细胞损伤和凋亡细胞培养(7]。这里,年龄是由乙二醛的生产接触为了模仿成纤维细胞的条件下亚致死的氧化应激在糖尿病患者类似。细胞应激的影响乙二醛单独或结合wIRA辐射对培养的成纤维细胞在37°-45°C进行了关于细胞凋亡的关键特性。的主导作用的高温45°C是重要的比其他影响可能被乙二醛和/或wIRA引起,或被认为在较低的温度。事实上,高温诱导的损害是乙二醛-和/或wIRA-treated细胞以及未经处理的细胞在相当程度上。此外,似乎高温是压倒一切的负面影响,从而掩盖了乙二醛和wIRA的任何影响,表明缺乏之间的显著差异四个治疗组45°C。

轻微增加代谢活动在37°C到42°C的范围是按照一般反应速度规则有效的化学和生化反应,而在45°C,破坏热效应为主。这也是符合wIRA的热工作原理。这些包括更高的代谢率和更高的能源生产体外基于增加温度以及一个未指明的吸收电磁辐射的细胞内的水,这是大大降低wIRA比爱尔兰共和军(图1(一))[23,25]。体内,代谢率越高而且基于增加氧的分压、高灌注组织暴露在wIRA [2]。WIRA辐照本身不产生有害的影响,没有加剧glyoxal-induced损伤体外培养成纤维细胞。相反,一个积极的影响被认为与YO-PRO-1细胞染色时,表明wIRA照射可能会减少凋亡细胞的数量。然而,由于温度效应占主导地位,超越了任何其他可能影响在大部分的实验中,这样的积极作用wIRA仍有待进一步的研究证实。

披露的信息

作者表明没有经济利益。

确认

作者要感谢e . Kuhlisch研究所的医学信息学和生物统计学(IMB)医学院的涂德累斯顿,在统计分析的支持,和w·穆勒博士med. h.c。欧文布劳恩Stiftung,和h . Piazena医学光生物学,柏林夏洛蒂,技术支持。本研究支持格兰特博士从med. h.c。欧文布劳恩Stiftung,瑞士巴塞尔。