文摘
本研究的目的是测量肌管的变化活性氧(ROS)和白介素6 (IL)生产的电刺激小鼠骨骼肌C2C12细胞。经过五天的分化、肌管是用一组电刺激器刺激45 V 5赫兹的频率,脉冲宽度为20毫秒。急性刺激进行45、60、75、90,或者120分钟每道菜。罗斯发现在使用荧光探针直接提取的细胞。il - 6 mRNA表达C2C12肌管和il - 6浓度在C2C12肌管上层清液使用实时PCR和ELISA测定,分别。与控制细胞相比,ROS生成在45分钟后显著增加刺激(),继续增加,达到最大值120分钟。il - 6 mRNA表达和il - 6浓度C2C12细胞显著增加在75分钟()和120分钟()的电刺激(ES)与控制细胞。我们的数据表明,一个特定的ES强度可以调节活性氧积累和影响承包骨骼肌细胞中il - 6基因表达。
1。介绍
白介素6 (IL)是一种细胞因子与不同的生物效应,是表达的间叶细胞,上皮细胞,和其他类型的细胞,不受监管的应对有害刺激,其他细胞因子和生长因子。大量研究表明,il - 6生产与肌肉收缩,sympathoadrenal应对运动只扮演一个次要角色运动增加血浆il - 6 (1]。提高稳态白介素mRNA水平在长跑后骨骼肌匀浆表明骨骼肌组织可能的循环运动锻炼释放的il - 6 (2]。锻炼不引起血浆TNF -增加α水平但诱发强烈的抗炎细胞因子反应的il - 6前循环尤其调节和其他细胞因子(3]。il - 6基因在肌肉休息不活跃,但正在迅速激活肌肉收缩。此外,il - 6作为能量传感器依靠肌肉中的糖原含量(4]。糖原含量低,诱导il - 6基因转录骨骼肌在运动。
最近的研究表明,il - 6从肌肉在运动中释放可能与自由基代谢,尤其是活性氧(ROS)生成(5]。ROS的生成是一个正常的发生在活的有机体内有氧过程(6,7]。锻炼是一种有效的刺激方法,也是伴随着增加自由基的生成,导致可衡量的氧化程度修改各种分子(8,9]。尽管增加循环的il - 6水平运动后良好的文档记录,和刺激细胞来源的版本仍然是难以捉摸的。这些研究的一个重要限制是没有生理实验模型。因此,在活的有机体内研究定义的角色至关重要il - 6在骨骼肌运动。
检查是否骨骼肌细胞产生il - 6和识别可能刺激释放相关的肌肉收缩,我们使用差异化C2C12骨骼肌细胞(肌管)作为骨骼细胞的电刺激模式模仿骨骼肌收缩,像之前报道10- - - - - -12]。之前的数据表明,这种模式的刺激会导致各种各样的功能和结构的改变肌管(13,14]。据报道,控制肌小管萎缩使用电脉冲刺激可以诱发大规模、快速的变化在mRNA的表达基因编码线粒体蛋白质。这些信使rna增加造成破坏的平衡之间存在基因转录和mRNA在非适应稳态条件下稳定。Irrcher罩表明,转录因子mRNA表达的收缩activity-mediated感应高度发散在C2C12肌管。这种可变性在mRNA转录因子诱导和营业额可能是重要的时间,gene-specific转录事件负责许多肌肉表型适应收缩活动的收缩蛋白和线粒体生物起源15]。
因此,本研究的目的是探讨ROS变化产生的il - 6水平和生产骨胳肌细胞收缩。我们假设ROS生成引起的骨骼肌收缩可能是其中一个因素调节肌源性生产和释放il - 6。
2。材料和方法
2.1。试剂和细胞培养
C2C12骨骼肌细胞获得基本医疗科学研究所,中国医学科学院。细胞培养在生长介质(杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM)含10%胎牛血清的边后卫,100国际单位/毫升青霉素,和100年μg / mL链霉素)在37°C湿润孵化器有限公司为5%2。成肌细胞文化达到融合时,他们转而DMEM含有2% heat-inactivated马血清补充用抗生素(分化培养基)五天,和C2C12骨骼肌细胞分化成肌管。
2.2。电刺激协议
电刺激器的设计是派生通过修改现有的方法(16,17]。经过五天的分化,使用电刺激器刺激肌管,(TY-C类型),设定在45 V 5赫兹的频率。刺激进行强烈45、60、75、90和120分钟,分别。细胞提取物刺激后立即获得每道菜的准备。
2.3。ROS测量
荧光探针,2′,7′二乙酸-dichlorofluorescin (DCFH-DA),用于细胞内ROS的评估形成培养C2C12肌管(7]。这个试验是一个可靠的方法测量细胞内ROS如过氧化氢(H2O2)、羟基自由基(OH•)和氢过氧化物(ROOH) [11,16]。肌管装有探测器和孵化20分钟。加载后,准备电刺激的细胞被洗了,立即收集,然后放置在荧光谱仪确定ROS生产的激发和发射波长522 nm和488 nm,分别。发光的峰值之后,作为时间的函数的值减去空白信号(发光的发光介质)。
2.4。il - 6 mRNA的测量
总RNA分离试剂盒和反向转录Moloney小鼠白血病病毒(M-MLV)(美国Promega)。rt - pcr进行使用Taq DNA聚合酶(美国Promega)。引物的序列如下:β肌动蛋白cDNA: 5′cgt棉酚亚美大陆煤层气有限公司ATG ACC CAG ATC a - 3′, 5′cac AGC CTG手枪GGC TAC GT-3′;il - 6 mRNA: 5′太极拳AGC CAG TTG有条件现金援助TCT TGG-3′, 5′TCT广汽AGT GCA柠檬酸TCG CTG-3′。在94°C条件下用于1分钟,30秒94°C, 50°C 30秒,72°C 1分钟,重复总共39周期,最终在72°C扩展进行了10分钟。产品运行在1.5%琼脂糖凝胶和可视化在紫外灯下。的两个可视化乐队(200个基点的放大本机白介素cDNA和从竞争对手分子扩增400个基点)相同的强度被认为是反应的isopoint(等于起始浓度的il - 6的互补和竞争对手存在的PCR混合)。周期数大约为每一对引物选择,保持指数放大富集样品。
2.5。il - 6浓度测量
C2C12细胞生长在单层膜和允许区分在达到融合。他们然后治疗ES 45岁,60岁,75年,90年和120分钟,分别。ES治疗后,上层的收集和离心20分钟在1000克/分钟桌面微型离心机清除浮动的细胞。离心后,小球被丢弃和上层清液用于ELISA按照制造商的指示。C2C12细胞单层膜在多井板与1 N氢氧化钠溶解。布拉德福德每口井的蛋白质含量测定的方法和用于规范化获得细胞因子释放的值。
2.6。分析
电泳带紫外线透照下观察并立即拍照使用一个成像系统(美国SYNGENE)。Bandscan 5.0(美国)频带分析软件被用于分析电泳乐队来计算每个PCR扩增产品的亮度。
数据表示为平均值±标准偏差(SD)。方法使用双面学生的比较以及。显著差异用单向方差分析确定。借助SPSS13.0统计软件进行统计分析使用(SPSS Inc .)。差异被认为是重要的。
3所示。结果
3.1。细胞分化融合估计
单层组织,倒置相差显微镜直接观察,变化成肌细胞分化过程中肌管。在未分化的条件下,成肌细胞表现为梭形或星形细胞,大部分被夷为平地,紧密附着基质。在最初的分化阶段,细胞间隙消失,细胞逐渐调整,偶尔也会拉长。
bicinchoninic酸(BCA)的合成和分解分析方法被用来衡量C2C12肌小管细胞内蛋白质含量。图1显示了总蛋白质含量的变化,大大增加了未分化状态的最后阶段。总蛋白质含量的增加,在第三天达到极大值的区别,然后稳步增加,显示最小值在分化阶段。
3.2。ROS生成后急性电刺激
确保准确量化ROS的生成,我们应用荧光探针DCFH-DA ES后标记细胞,随后测量光密度(OD)使用荧光分光荧光计值。表1表明,活性氧生成在45分钟后显著增加刺激(),继续增加,达到最大值120分钟,而控制细胞。
3.3。il - 6 mRNA表达和il - 6浓度在不同电刺激时间
il - 6 mRNA表达C2C12肌管ES(表后改变了2)。图2il - 6的照片显示了凝胶mRNA表达从C2C12肌小管后。结果表明,il - 6信使rna浓度C2C12肌管浮在表面的改变与不同时期的胚胎。
il - 6 mRNA表达C2C12肌管电刺激后改变了。il - 6 mRNA表达C2C12肌小管后显著增加75分钟()和120分钟()与对照组相比。与90分钟ES组相比,il - 6 mRNA表达在75和120分钟ES组显著增加()。
il - 6蛋白浓度从C2C12肌管浮层后被改变了。il - 6浓度增加C2C12肌管上层清液与增加ES时间与对照组相比,高峰值出现在75和120分钟()。与90分钟ES组相比,il - 6浓度在75和120分钟ES组显著增加()(表3)。
4所示。讨论
收缩活动是一个有力的刺激,众多在骨骼肌细胞适应性的感应18]。评估改变以应对收缩活动,我们使用了一个孤立的细胞系统在神经和体液因素的缺失。结果表明,电刺激(45 V, 5赫兹,20 ms)调节活性氧积累和影响基因表达的il - 6水平。然而,这些变化并没有引起任何显著的细胞损伤,这意味着细胞内氧化还原平衡是维持。骨骼肌肌管显示一个大在ES ROS和快速增产。ROS不同收缩时间后释放在体外以前没有描述。然而,丰富的在活的有机体内证据表明,活性氧产量是骨骼肌的刺激适应运动训练(8,19]。先前的报告支持这一概念,锻炼ROS生成改变肌肉基因表达,导致运动性骨骼肌的适应性在活的有机体内(20.]。在许多这样的研究的一种常见方法是废除运动的信号影响ROS生产治疗动物骨骼肌的抗氧化剂。例如,两个独立的最近研究表明,抗氧化剂补充可以阻碍重要培训适应人类骨骼肌(21,22]。我们之前的研究也表明,ES的C2C12肌管可以诱导活性氧的快速增加,诱发细胞功能障碍,引起线粒体功能障碍(11,21]。这种变化与之前报道的结果不一致在活的有机体内(8,20.]。
ROS在肌肉细胞引起的生产ES有关电压、频率和持续时间。不同强度的ES可以引起不同的活性氧产量的变化(7]。对峙等人使用不同的ES强度肌肉细胞,发现强烈的ES (50 V,脉冲宽度1 ms,脉冲间隔0.01秒)的肌肉细胞内和细胞外的DCF荧光增加,一定程度的氧化,171%和105%,分别与控制nonstimulated细胞。相反,适度的刺激(50 V,脉冲宽度1 ms,脉冲间隔0.1秒)没有显著增加细胞外DCF荧光(7]。增加刺激频率增加骨骼肌收缩强度,从而导致增加骨骼肌线粒体和过氧化物生成活动。麦卡德尔等人使用ES (30 V, 1赫兹,脉冲宽度2 ms)分化鼠卫星细胞研究活性氧释放的时间进程。作者发现短(15分钟)收缩导致卫星细胞ROS(快速40倍23]。活性氧的增加会导致骨骼肌蛋白质巯基改性,降低瞬态超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶活性和热休克蛋白浓度的增加。然而,这些变化并没有引起任何显著的细胞损伤(24]。
在这项研究中,我们使用ES (45 V, 5赫兹)来模拟C2C12肌管。我们发现活性氧产量显著增加与ES与控制nonstimulated细胞相比,ROS生成的变化遵循了一个三相的曲线模式,高峰出现在75和120分钟ES组。这类似于我们之前的结果ES(使用相同的模式11,12]。我们之前的结果表明,运动性线粒体ROS变化相关的耗氧量和抗氧化系统的规定。许多在活的有机体内研究也表明,氧化应激在骨骼肌是病理生理状态的一个特点19]。活性氧产量明显的跨膜电位的生理范围和相对不敏感膜电位的变化(25]。异常高水平的活性氧和抗氧化防御机制的同步下降可能导致损害的细胞细胞器和酶。我们假设罗斯被主要由细胞抗氧化系统,包括抗氧化维生素、蛋白质和非蛋白的硫醇,在生理条件下抗氧化酶。然而,当活性氧产量过多,在长时间的有氧运动,如细胞抗氧化系统可能会不堪重负,导致广泛的细胞和组织损伤。锻炼生产和分泌il - 6在骨骼肌纤维表明il - 6可能在能源供应中发挥作用和储存在肌肉和运动后。这个角色很可能短期内,生理、和本地活跃的几分钟或几个小时26]。在目前的研究中,我们观察了il - 6的变化mRNA表达和il - 6蛋白含量C2C12肌管在不同ES倍(0、45、60、75、90和120分钟)。这是不同于以往的研究,表明il - 6在运动时骨骼肌mRNA水平显著增加(27- - - - - -29日]。il - 6蛋白已被证明会积聚在肌肉纤维收缩和释放大量的等离子体。此外,il - 6基因的转录激活骨骼肌的人类是高高架在长时间运动5,30.]。其他研究已经表明,所需的时间和强度的锻炼积累内il - 6蛋白收缩肌肉不是很好。然而,运动持续时间已被证明是最重要的因素,决定了系统性il - 6的大小反应(29日]。我们的研究结果表明,il - 6 mRNA表达C2C12肌管改变不同ES。il - 6 mRNA表达在C2C12肌管和上层的75和120分钟ES组显著增加,与对照组相比。
很少有研究解决运动后肌原性的ROS和il - 6之间的关系在活的有机体内。一些研究表明,补充维生素C和E减毒的系统性il - 6对等离子体和骨骼肌的练习28,31日]。抗氧化剂,例如维生素C和E,可以减弱氧化应激在休息和锻炼,从而减少ROS的生成(32]。使用C2C12肌管孵化与H2O2在不同的浓度,Kosmidou等人发现,il - 6含量的培养24小时后上层清液增加非独立。作者得出的结论是,罗斯刺激il - 6生产从骨胳肌管通过增加通过NF - il - 6基因的转录激活κB-dependent通路(33]。在人类支气管上皮细胞,ROS-stimulated il - 6生产之前增加il - 6稳态mRNA水平(34]。凯勒等人表明,诱导il - 6表达肌纤维萎缩可能主要负责循环上升的il - 6浓度在长时间运动(30.]。因此,我们推测,类似的机制可能会活跃在骨骼肌萎缩,ROS生成信号过程中可能发挥作用的C2C12肌管适应变化的模式或收缩活动的持续时间。
众所周知,各种各样的压力可以诱导il - 6 upregulation。然而,研究il - 6对电刺激的反应是稀缺的。我们所知,这是第一个报告解决il - 6的反应。在目前的研究中,我们已经表明,ES可以导致il - 6的变化mRNA表达,il - 6,蛋白质含量和变量增加活性氧生成。我们推测,肌原性的ROS可能调解肌原性的il - 6代。然而,在这项研究中,我们只研究了肌原性的il - 6和ROS ES之间可能的联系,不是肌肉血管收缩和随后的il - 6产生的活性氧释放骨胳肌管。因此,我们不能排除这种可能性,其他肌肉的代谢变化诱导肌原性的ROS生产和后续释放il - 6在运动。还需要进一步的研究来调查这种可能性。
我们的研究结果表明,电刺激(45 V, 5赫兹,20 ms)可以调节活性氧积累和影响基因表达的il - 6水平。此外,刺激的变化趋势是一致的。我们推测,ROS产生的骨骼肌细胞收缩可能是其中一个因素调节肌源性生产和释放il - 6。
确认
这项工作是支持的研究创业资金从中山大学“百人才计划”。x徐监督的研究设计和cofirst这项研究的作者。