文摘
细胞色素P450 NADPH-reductase (P450R),诱导合成酶(间接宾语)和黄嘌呤氧化酶antracycline-related发挥重要作用的毒性。P450R和伊诺的表达是受三碘甲状腺氨酸。本研究的目的是评估的影响methimazole-induced hypothyreosis在氧化应激继发于阿霉素。甲硫咪唑后48小时给戒烟,老鼠被暴露于阿霉素(2.0,5.0和15毫克/公斤)。血液和心脏收集4、48和96 h后药物管理局。动物将完全暴露在阿霉素或未经处理的也被评估。甲硫咪唑hypothyreosis(0.025%)显著增加阿霉素对心脏的影响羰基,他们可能会增加谷胱甘肽的水平。一个微不足道的影响甲巯基咪唑是注意到心脏的脂质过氧化作用的产品,大量的DNA氧化损伤,伊诺和黄嘌呤oxidase-enzymes负责red-ox阿霉素的激活。然而,P450R的浓度是影响低剂量甲巯基咪唑的老鼠注射阿霉素。因为在老鼠接受阿霉素引起的氧化压力的变化甲巯基咪唑并没有伴随着海拔bioreductive酶,它可能会得出结论,这些变化相关的氧化应激没有酶测试。
1。介绍
阿霉素广泛用作化学治疗剂,但其实用性受到毒性(1]。毒性表现为无法治愈的充血性心力衰竭,可能会出现几个月或几年化疗完成后(2]。自由基在阿霉素合成氧化还原循环被认为是起点负责生化、形态和临床症状(3- - - - - -8]。
阿霉素是酶降低一个电子传输到O2(图1)。这个周期可能被重复多次,导致生产过剩的超氧化物阴离子自由基()。意味着合成更多的有毒的氧(H2O2何*)和氮(ONOO−)的物种9]。在这些条件下,氧化脂质、蛋白质、氨基酸的酶和DNA或硝化可能出现(10]。在酶受到硝化的影响,超氧化物歧化酶,抗氧化防御的关键酶(11]。
心肌细胞的氧化应激引发的阿霉素是由单电子还原、催化主要是由微粒体细胞色素P450 NADPH-reductase (p - 450 r) [12,13),一氧化氮合成酶(NOS) [14),胞质黄嘌呤氧化酶(XO) [15,16),而线粒体NADH脱氢酶(17]。
有趣的是,动物和人类的数据表明三碘甲状腺氨酸(T3)——活性代谢物的甲状腺素(T4) -upregulates P450R合成(18- - - - - -20.]。类似的机制提出了甲状腺素在伊诺(21]。此外,甲状腺素调节的关键酶负责合成NADPH-a代数余子式P450R和伊诺和看似矛盾的是细胞氧化还原平衡的关键因素(图1)。
这项研究的目的是评估的影响hypothyreosis阿霉素诱导的氧化应激和估计的影响hypothyreosis和药物对P450和伊诺蛋白质水平。
2。材料和方法
2.1。动物和治疗
这项研究是由当地伦理委员会批准在卢布林的医科大学。雄性Wistar鼠(180 - 220克)是在传统的实验室条件下(温度22°C,湿度60 - 70%,12小时光/暗周期)和美联储与标准啮齿动物颗粒饲料LSM (AGROPOL、波兰)。食物和水是免费提供的。老鼠被随机分成组,每组包含七个科目。老鼠收到thyreostatic drug-methimazole (methizole;ICN、波兰)饮用水中的三个星期在两个浓度(0.001或0.025%;组了l或遇到H、职责)。剩余时间的实验中,只有滤液市政水管理。48小时内完成甲巯基咪唑政府之后,老鼠接受阿霉素(EBEWE Arzneimittel Ges.m.b.H。、奥地利)浓度的2.0、5.0和15毫克/公斤的体重(组2阿霉素+l5阿霉素+了l15阿霉素+了l和2阿霉素+了H5阿霉素+了H15阿霉素+了H)。阿霉素盐酸溶解(1:1;v / v)在盐溶液(Cefarm、波兰)。另一组完全暴露在阿霉素但没有诱导hypothyreosis(15组2阿霉素、5阿霉素和强力霉素)。生物材料(血液和心脏)收集4、48、96小时后阿霉素。在团体遇到l和满足H停止甲巯基咪唑后48小时,老鼠注射生理盐水,,接下来的96小时后,生物材料收集进一步的生化分析。类似的过程应用于对照组,96小时后的盐水注入老鼠牺牲。
血液从左心室吸气戊巴比妥麻醉期间,并获得等离子体保持在−75°C。之后很快,心脏被解剖,用20毫升生理盐水洗净,切片室间和冠林。左心室的壁是放置在一个液氮并存储在−75°C到生化和分子分析。右心室壁在缓冲10%福尔马林固定,常规组织学方法加工石蜡块。
2.2。生化参数的确定
2.2.1。血清三碘甲状腺氨酸和Tetraiodothyronine
三碘甲状腺氨酸(英国《金融时报》3)和tetraiodothyronine(英国《金融时报》4)在大鼠血浆浓度测定使用商业试剂(AxSYM;美国雅培)。样品和antibody-coated微粒添加试剂形成一个antibody-antigen复杂。T3和T4碱性磷酸酶anti-T共轭结合可用的网站3(anti-T4涂层微粒子。最后,4-methylumbelliferyl磷酸盐添加的荧光intensiveness获得产品测量。
2.2.2。测定组织标记为氧化还原不平衡
所有测量进行匀浆从~ 200毫克的冰冻的心脏样品使用提取每个商业设备的制造商提供的缓冲和匀浆器聚四氟乙烯雌蕊(美国Glas-Col)。板读者PowerWave XS(美国Bio-tek),被用来评估氧化脂类产品(如丙二醛和4-hydroxyalkenals),蛋白质羰基(组),DNA(基本网站),总谷胱甘肽。
2.2.3。脂质过氧化作用的产品
在心脏匀浆脂质过氧化的评价是基于丙二醛和4-hydroxyalkenals浓度(MDA + 4)。商业为MDA工具包生物技术法律外包- 586 + 4有(Oxis美国研究)是用于评估。方法的概念是基于MDA和4有N-methyl-2-phenylindol之间的反应。N-methyl-2-phenylindole和甲醇混合后上层清液从均质化,获得的甲磺酸加,所有试剂都放置在温度45°C为60分钟。接下来,包含产品的解决方案是离心机和上层清液被转移到使用的塑胶板光谱光度测量的读者PowerWave XS (BioTek美国)在586海里。随后,根据制造商的过程进行了描述,和MDA的浓度+ 4 hne测试样品从校准曲线的公式计算。获得日期计算考虑的建议中所描述的过程。结果在nm / g心脏样本的表达。
2.2.4。蛋白质羰基化合物
测定蛋白质羰基化合物进行了使用商业套装(开曼的蛋白质羰基试验;开曼群岛、美国)。获得的上层清液吸光度是在260和280海里检查来确定污染样本中核酸存在。均化缓冲被用作空白。吸光度比例超过280/260 1.0;因此,进一步去除核酸并不是必要的。方法利用蛋白质羰基化合物的反应与2,4-dinitrofenylhydrazyne。反应的产物为360 nm。羰基的浓度在蛋白质标准化单元(nmol羰基/毫克蛋白)。蛋白质的数量计算的牛血清白蛋白溶解在盐酸胍和阅读在280海里。
2.2.5。DNA氧化损伤
基因组DNA的孤立的商品化试剂盒(Fermentas,立陶宛)是用于隔离的心脏DNA根据制造商的手册。冰冻的心脏样品在液氮粉碎,悬浮在TRIS-EDTA缓冲区。然后,样本在裂解缓冲孵化65°C。释放DNA提取使用氯仿,然后沉淀,沉淀的因素。DNA氧化损伤的心脏肌肉被测量的量评估基本的网站(所谓的美联社)商业工具(Dojindo、日本)。孤立的DNA标记的ARP试剂可以识别在美联社网站开环的醛基与生物素结合。然后,biotin-avidin特定连接和辣根过氧化物酶在650 nm用于比色检测。
2.2.6款。总谷胱甘肽
谷胱甘肽测定进行了使用商业套装Bioxytech谷胱甘肽(gssg - 412(美国OxisResearch)。总谷胱甘肽(;谷胱甘肽(减少谷胱甘肽)+ GSSG(氧化谷胱甘肽)决定在酶反应,在Ellman试剂(5、5′-dithio-bis-2-nitrobenzoic酸)与谷胱甘肽反应形成颜色产品的最大吸光度在412海里。GSSG浓度的谷胱甘肽,谷胱甘肽(GSSG比率进行评估后测量的速度反应,建立校准曲线。谷胱甘肽的浓度和GSSG决定基于描述的校准曲线由以下公式:和,分别。获得的数据被用来计算谷胱甘肽(GSSG比率。
2.3。黄嘌呤氧化酶活性
黄嘌呤氧化酶活性的测定(XO, EC 1.1.3.22)在心脏匀浆的基础上进行的动力学反应转换黄嘌呤尿酸(西格玛奥德里奇,美国)22]。吸光度的增加单位时间在290纳米测量使用光谱光度测量的读者PowerWave XT(美国BioTek)光路1厘米,25°C和pH值7.5。吸光度是记录每一分钟在5分钟。磷酸自助餐(pH值7.5)添加到空白而不是浮在表面的。计算酶活性表达的质量单位样本的心。
2.4。分子分析
2.4.1。细胞色素P450 NADPH-Reductase
细胞色素P450的内容NADPH-reductase(提到过1.6.2.4)蛋白质测定使用WesternBreeze显色免疫印迹immunodetection工具包(美国表达载体)。左心室样本中均质磷酸盐与蛋白酶抑制剂鸡尾酒(σ)。经过30分钟的阻断特异性的结合位点,硝化纤维膜是孵化1 h和一只兔子anti-rat细胞色素P450还原酶多克隆抗体(QED Bioscencie)(1: 1000),后跟一个30分钟孵化与碱性phosphatase-conjugated anti-rabbit免疫球蛋白二级抗体。免疫印迹是用显色底物10分钟,一夜之间,膜风干。显色底物是BCIP的混合物(5-bromo-4-chloro-3-indolyl磷酸盐)和nitro-blue四唑盐。
2.4.2。Immunoexpression伊诺的
免疫组织化学反应诱导一氧化氮合酶(间接宾语;提到过1.14.13.39)进行4从石蜡块获得m幻灯片。脱蜡和补液后,三个周期的幻灯片被放置在微波炉加热5分钟(750 W)的柠檬酸缓冲(0.01 M, pH值6.0)抗原检索。然后,内源性过氧化物酶活性被3%的过氧化氢为5分钟,和幻灯片孵化与主多克隆抗体兔子anti-mouse 60分钟(美国LabVision)对伊诺(克隆Ab-1,稀释1:50)。下一步是孵化+ /合、鼠标套件(DakoCytomation;斯特鲁普、丹麦)根据制造商的指示。特异性免疫反应是可视化的3′,3-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) (DakoCytomation;斯特鲁普、丹麦),最后的部分和迈耶的苏木精复染色。TBS缓冲区使用清洗后每一个步骤。整个过程在室温下进行。在所有情况下,适当的进行积极的和消极的控制。部分以同样的方式治疗,但用鼠标preimmune血清除了检查主要抗体作为消极的控制。积极控制,河鼠肺示例应用。所有幻灯片进行评估,没有治疗的知识组织,在光学显微镜(奥林巴斯BX45; Tokyo, Japan).
2.5。统计分析
获得的数据进行分析使用STATISTICA 5.0。(美国Statsoft Inc .)。统计学意义是评价UMann-Witney测试(与盐水控制)和单向方差分析(方差分析Kruskala-Wallisa)。事后考验(Newmana-Keulsa)被用来验证零假设,根据降低甲状腺激素状态影响评估参数。所有的数据表示为平均数±标准差。的价值P< 0.05被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
动物获得的平均血浆FT4和发生浓度在较低剂量甲巯基咪唑对照组相比显著降低(表1)。组中暴露于较高的药物浓度,这两个参数是检测的水平以下。
比较控制,更高水平的MDA + 4 hne观察组15阿霉素/ 96 h, 15阿霉素+H15 / 48 h,阿霉素+H/ 96 h(表2)。出乎意料地,组l减少MDA + 4 hne浓度96 h后阿霉素政府(2毫克/公斤)比较合适的群阿霉素。阿霉素作为单药应用于最高剂量显著增加动物的羰基化合物浓度后4、48和96小时(表3)。之间的显著差异也发现euthyroid的羰基化合物的浓度和甲状腺老鼠收到阿霉素。各自的强力霉素组比较,明显高于值观察阿霉素在早些时候给老鼠接受高剂量的甲硫咪唑。类似的变量还指出中产和最高剂量的阿霉素时,药物的管理动物之前,使用低剂量的甲硫咪唑。然而,显著降低浓度的羰基化合物发生在15阿霉素+了l。
中等剂量的阿霉素的管理后,在DNA氧化损伤的数量明显上升,控制(表4和48小时比较4)。测试最高剂量的阿霉素引起的DNA损伤显著增加测试时间。几乎在每一个被观察到了类似变化比较控制可比hypothyroid-like与阿霉素组管理。然而,重大的改变并没有透露任何阿霉素+之间和阿霉素对会面。
总谷胱甘肽浓度没有影响在任何组织暴露于只控制相比(表阿霉素5)。然而,大幅增加的参数在48小时前观察到的动物使用甲巯基咪唑时中间的管理和最高剂量的阿霉素。有趣的是,谷胱甘肽的变化T在大鼠接受阿霉素相关hypothyreosis阶段。5增加阿霉素+了l/ 96 h和减少5阿霉素+H/ 96相比观察与控制。重要的是,这谷胱甘肽T水平在老鼠hypothyreosis接收阿霉素(5、15阿霉素+/ 48)也是重要的阿霉素组相比。
黄嘌呤氧化酶的活性心肌的老鼠接受阿霉素与对照组相比没有影响(表6)。然而,在组15阿霉素+l/ 4 h和阿霉素+ 15H/ 4 h,分别研究了酶的低和高活动被发现与强力霉素组中观察到的值。缺乏蛋白质的差异P450R表达式用免疫印迹技术观察心肌在动物中接收阿霉素与对照组相比(图2)。相反,高蛋白质的表达与低剂量组大鼠服用甲巯基咪唑的所有测试剂量的阿霉素与控制和强力霉素组。然而,在所有接受高剂量的阿霉素组甲巯基咪唑,微不足道的变化被观察到比较控制和强力霉素组。
伊诺的细胞质疣状扩散和更高的伊诺心肌基因表达被发现,尤其是在团队研究了96小时,完全暴露在最低的和中等剂量的阿霉素(数字3和4)。动物的暴露与先前阿霉素诱导hypothyreosis,伊诺信使rna和蛋白质水平较低和与控制。
(一)
(b)
4所示。讨论
进行的研究显示,hypothyreosis有重要影响的心肌氧化应激大鼠暴露于阿霉素。这些变化的方向依赖iodothyronine激素的浓度,抑制细胞生长的剂量。hypothyreosis, doxorubicin-dependent氧化应激的强度不是P450R相关,进气阀打开,牛的水平。
心肌细胞的氧化应激引发的阿霉素是一种被广泛接受的假说在致命的毒性导致充血性心脏的失败。上面指出(图1),单电子降低阿霉素,氧化应激的关键过程的发展,是由微粒体(催化12,13),胞质(12,14,15),和线粒体酶(17]。在微粒体和细胞质酶,P450R [12,13],伊诺[23,24],XO (15,16)发挥重要的作用。在介绍中提到的,T3和T4通过基因组机制可能会改变各种酶的活动参与阿霉素氧化还原激活(18,20.,21和抗氧化防御19,25- - - - - -27]。
确认适当的剂量的甲硫咪唑,等离子体3和英国《金融时报》4决心和甲状腺组织学检查(数据未显示)。两英尺的减少明显的剂量依赖性3和英国《金融时报》4水平和减少大量的胶体在甲状腺滤泡证实甲巯基咪唑的正确选择团。
临床敏感性分析氧化应激的标记不同的顺序oxDNA > CG MDA + 4 hne > >谷胱甘肽T自氧化DNA损伤的增加在群中所有测试时间15阿霉素与中间剂量的阿霉素治疗后(5毫克)4和48 h。显著增加doxorubicin-dependent CG浓度也观察到4,48和96 h但只有在组织管理的最高剂量的阿霉素。一个重要的脂质过氧化增加了专门在96 h阿霉素剂量最高的管理。此外,缺乏谷胱甘肽T心脏水平变化被发现。
类似的数据之前在其他研究中找到。Palmeira et al。28)观察到一丸阿霉素(15毫克/公斤)引起的心脏水平显著增加8-hydroxydeoxyguanosine (8 ohdg),另一个标记的DNA氧化变化。加合物的丰度最高的最早时间点检查(24小时),两周内控制值下降。另一方面,心脏的水平大幅提高羰基10天从单一政府的阿霉素20毫克的剂量还指出[29日]。此外,单一剂量阿霉素在10 - 20毫克/公斤增加引起的脂质过氧化作用的产品,这是显示在几天后从药物注射29日- - - - - -32),而较低的单剂量阿霉素(2.5毫克/公斤)引起的MDA水平的增加在第一次四个小时,24小时内恢复正常(33]。看来2毫克的剂量,这是使用在目前的研究中,太低引起显著增加的单一注射后脂质过氧化作用。
问题产生的原因不同灵敏度确定标记后阿霉素治疗。基于当前的知识,是不可能解释不兼容的各种生化指标的变化,以防阿霉素的博览会。然而,生物半衰期和敏感,应考虑不同的活性氧。羰基显得相对较早,小时时是稳定的,甚至是天(34,35),而主要的脂质过氧化反应产品的寿命估计几分钟(36]。脂质过氧化作用的产品(例如,MDA)形成DNA加合物,这或许可以解释观察到的不均衡和MDA水平之间oxDNA在这项研究[37- - - - - -40]。此外,脂类物质的氧化破坏,蛋白质和DNA取决于活性氧的类型,例如,HOCl,髓过氧物酶反应的产物催化了,轻松提升羰基的浓度,但很少或根本没有活动创建氧化脂质和DNA在细胞内环境的变化(41]。它应该还在进行的一项研究强调Fadillioglu et al。29日单剂量的阿霉素(20毫克/公斤)引起了心脏髓过氧物酶活动的显著增加。
人们以前认为hypothyreosis可能改变氧化还原状态的老鼠接受阿霉素,自三碘甲状腺氨酸调节P450R [18,20.和被怀疑调节伊诺的表达21),在阿霉素bioreductive激活中起着重要的作用。此外,激素上调的基因负责合成G6PDH、苹果酸脱氢酶,6-phosphogluconate脱氢酶(27,42]。这些酶是一种重要的细胞来源的NADPH通过P450和伊诺触发ROS合成,同时看似矛盾的是,是不可或缺的在细胞再生减少谷胱甘肽的抗氧化防御。
目前的研究表明甲状腺条件可能会增加阿霉素引起的心肌氧化应激。受影响最严重的氧化应激标记在大鼠阿霉素处理hypothyreosis CG。相似的结果也发现谷胱甘肽T影响的最低和中等剂量的阿霉素在48 h和最低剂量药物管理局后96 h。
的重大影响hypothyreosis与阿霉素在大鼠心肌脂质过氧化反应管理只出现一次,而且没有观察到这种变化对于oxDNA赔偿。因此,在评论将集中在羰基化合物的变化。
和中等剂量的阿霉素最低的治疗后,没有明显的变化CG在任何时间控制比较。然而,当提到剂量的药物都给老鼠hypothyreosis,显著增加氧化蛋白质的损失了。,甚至在适当的强力霉素组的2 - 3倍。当大鼠阿霉素处理的情况下,氧化蛋白质损失高比较控制在所有时间。最高的蛋白质氧化损伤大鼠服用剂量的药物根据hypothyreosis状态改变。当阿霉素注射大鼠暴露于低甲巯基咪唑浓度、羰基化合物的水平显著下降,但在动物更强烈hypothyreosis羰基化合物含量显著升高。
获得的发现指P450R蛋白质水平有点奇怪,因为指的假设基于Ram和维克斯曼的20.]结果,观察到T3上调基因表达这种酶,和他们的研究的基础上,这可能会抑制引起的T3合成甲硫咪唑应该减少酶的浓度。
考虑增加很高的蛋白质氧化损伤在所有团体接受高剂量的甲硫咪唑与阿霉素不是P450R伴随着任何变化的蛋白质含量比较阿霉素只有适当的组,它可能会得出结论,氧化应激与酶的表达。
同样,伊诺并不负责氧化蛋白质含量的增加,因为这些海拔在阿霉素+组H没有伴随着增加酶的浓度。此外,最低的和中等剂量的阿霉素,伊诺的immunoexpression降低阿霉素组+了H比较euthyroid老鼠(仅适当的群阿霉素)。
一般来说,没有影响iodothyronine激素状态对黄嘌呤氧化酶的活性大鼠阿霉素。此外,这种酶不能负责观察氧化蛋白质海拔在所有组阿霉素+了H。
集体,hypothyroid-like状态可能加强阿霉素引起的氧化应激,但P450R,进气阀打开,XO可能被排除在外是负责这些现象。还需要进一步的研究来解释其他的角色阿霉素biactivating酶,特别是线粒体的分数。
承认
作者要感谢女士Mariola Michalczuk技术支持。