植物化学的激活Nrf2保护人类冠状动脉内皮细胞对氧化的挑战

文摘

激活NF-E2-related因子2 (Nrf2)是一个潜在的治疗干预对内皮细胞氧化应激和血管疾病有关。我们假设专利中的植物化学物质治疗膳食补充剂Protandim诱导Nrf2核本地化和二期抗氧化酶蛋白在人类冠状动脉内皮细胞(HCAECs),防止一个氧化剂挑战Nrf2 -依赖的方式。Protandim治疗诱导Nrf2核本地化和HO-1(82.25±778%的控制),SOD1(6.05±125.9%的控制),NQO1(6.5±126%的控制)和GR(7.00±119.5%的控制在HCAEC)蛋白表达。治疗HCAEC与H₂O₂诱导细胞凋亡在34%的细胞在预处理Protandim导致只有6%凋亡细胞()。Nrf2沉默显著降低Protandim-induced HO-1增加蛋白()。Nrf2沉默也显著减少Protandim所提供的保护,对H₂O₂诱导细胞凋亡(相对于没有RNA,而控制RNA)。这些结果表明,Protandim诱发Nrf2核本地化和抗氧化酶的表达,从氧化和保护HCAEC挑战是Nrf2依赖。

1。介绍

氧化应激被牵涉进很多慢性疾病,包括阿尔茨海默氏症,糖尿病和冠状动脉疾病(CAD) (1- - - - - -4]。增加产量的活性氧(ROS)和氧化损伤的血管内皮为CAD起始和发展作出贡献。具体来说,增加血管过氧化物引起脂质氧化,减少一氧化氮可用性、粘附分子和炎症介质的表达增加,招聘的单核细胞内皮(5- - - - - -8]。Endothelium-bound超氧化物歧化酶也减少了在CAD患者与健康对照组相比,损害细胞反应过多的活性氧产量(9]。从人类分离出来的动脉粥样硬化冠状动脉显示增加超氧化物生产相比nonatherosclerotic人类冠状动脉和动脉粥样硬化小鼠模型,衰减的过氧化物生产降低NADPH氧化酶的表达(NOX)导致减少动脉粥样硬化病变的大小(10,11]。

初步研究减少氧化应激的影响在一些疾病,包括心血管疾病、使用外源性抗氧化剂如维生素C和e .然而,外源性抗氧化剂一直令人失望的保护作用,在某些情况下补充增加死亡率(12- - - - - -14]。一个新颖的方法来减少抵抗氧化应激包括增加内源性抗氧化防御系统而不是依靠外源性抗氧化剂补充。Protandim是商用植物化学物质组成的膳食补充剂来源于五广泛研究药用植物包括水飞蓟水飞蓟素、姜黄姜黄素,一种提取,ashwagandha和绿茶提取物。五Protandim有协同效应诱导的植物化学的组件二期抗氧化酶和保护细胞不受氧化应激激活的转录因子NF-E2-related因子2 (Nrf2) [15,16]。

Nrf2持续表达,但明显的泛素化与Kelch-like ECH-associated胞质蛋白1 (Keap1)。激活Nrf2发生时释放Keap1把原子核。在细胞核,Nrf2二聚化小加或小君蛋白质和结合抗氧化反应元素(是)在几百个基因的启动子区域包括许多二期抗氧化酶随后启动转录(17,18]。Protandim可能激活Nrf2通过与后续Nrf2磷酸化激活各种激酶(16,19]。

尽管急性激活Nrf2发生在活的有机体内为了应对氧化磷脂信号,ROS增加生产、高血糖和剪切应力20.- - - - - -22),慢性疾病的抗氧化剂的反应通常是不足以保持氧化还原平衡,防止疾病进展(22- - - - - -24]。例如,Landmesser等人报告增加SOD活性在年轻hypercholesterolemic受试者相比年龄组(9]。相比之下,降低SOD活性在年龄组相比,从CAD患者冠状动脉(9]。数据显示,upregulation二期抗氧化酶可以防止氧化应激在体外和人类的16,25,26]。这也是最近报道,Protandim保护人类隐静脉体外文化从氧化应激增生和血管壁增厚27]。因此,phytochemical-induced Nrf2激活是一个潜在的治疗干预对内皮细胞氧化应激和血管疾病起始和进展有关。有限的研究出版物(8)检查是否存在Protandim治疗可以减少疾病和慢性疾病有关。Protandim Nrf2和氧化应激的影响在人类冠状血管细胞并没有被调查。

本研究的目的是确定(1)如果治疗Protandim-induces Nrf2核易位和二期抗氧化剂酶蛋白表达在人类冠状动脉内皮细胞(HCAEC),(2)如果Protandim保护HCAEC治疗从一个氧化剂诱导细胞凋亡的挑战,和(3)如果Nrf2介导Protandim诱导氧化的保护的挑战。我们假设Protandim治疗诱发Nrf2核本地化和二期抗氧化剂酶蛋白表达,和Protandim治疗前一个氧化剂挑战将承受细胞保护Nrf2依赖的方式。

2。材料和方法

2.1。材料

HCAEC和细胞培养试剂、小干扰rna转染试剂和PrimeFect PrimeFect稀释剂买来Lonza (Walkersville博士)。血红素oxygenase-1 (HO-1)抗体亲和力Bioreagents(黄金有限公司),nitroquinone氧化还原酶(NQO1)及谷胱甘肽还原酶(GR)的抗体,和适当的HRP-conjugated二级抗体购自AbCam, (Cambridge, MA)。Nrf2 Cu-Zn超氧化物歧化酶(SOD1)和肌动蛋白抗体,合- - - FITC -共轭适当的二次抗体,Nrf2 siRNA,控制RNA购自圣克鲁斯生物技术(圣克鲁斯,CA)。圣克鲁斯Nrf2 siRNA池3 19-25 nt siRNA工器。序列一5′,3′意义:GCAUGCUACGUGAUGAGAtt,反义:UCUUCAUCACGUAGCAUGCtt,序列两个5′,3′意义:CUCCUACUGUGAUGUGAAAtt,反义:UUUCACAUCACAGUAGGAGtt,序列三5′,3′意义:GUGUCAGUAUGUUGAAUCtt,反义:UGAUUCAACAUACUGACACtt。皮尔斯BCA分析工具包,用于确定蛋白浓度,蛋白酶和磷酸酶抑制剂,SuperSignal西方硬脑膜衬底来自热科学(罗克福德,IL)。TUNEL分析工具来自罗氏(印第安纳波利斯,)。

2.2。HCAEC文化

主要HCAECs是生长在内皮细胞生长培养基(EBM-2)含有5%的边后卫和manufacturer-recommended补充生长因子,抗生素,抗真菌的。所有化验进行细胞融合在80 - 100%,通道3和12之间,至少重复三次重复或一式三份。

2.3。Protandim和H₂O₂准备和治疗

Protandim植物化学的成分包含w . somnifera,b . monnierabacosides (45%),美国marianum,会于长滩举行sinesis(98%多酚和45% (−)-epigallocatechin-3-gallate),从姜黄,姜黄素(95%)(铜。巴隆)(LifeVantage Corp .)、盐湖城、UT)。Protandim提取制备混合500毫克Protandim 5毫升95%乙醇。混合物在室温下是一夜之间发生,然后离心15分钟在3000×g。得到的上层清液中含有乙醇提取Protandim 100毫克/毫升的浓度。Protandim提取物稀释到20μg / mL完整细胞培养基对所有治疗后初始浓度响应的实验,表明20μg / mL的最低浓度,大大刺激了二期抗氧化剂酶蛋白表达。细胞不接受Protandim治疗以95%的乙醇为汽车控制的最大生长介质中乙醇浓度(2 0.02%μL在10毫升)。H₂O₂(30% W / W)在完整细胞生长培养基稀释最终浓度为1.25μ所有的治疗。Protandim治疗范围从1小时到12小时表示,和H₂O₂治疗4小时。

2.4。免疫印迹分析

HCAEC被播种在65毫米聚苯乙烯细胞培养菜肴和增长到至少80%融合之前Protandim治疗。治疗后,细胞刮在缓冲区里帕(50毫米三,0.15 M氯化钠,1%钠脱氧胆酸,1毫米EGTA, 1% NP40)含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂和用近3×10秒。蛋白质浓度测定用BCA分析,样本与Laemmli样品稀释缓冲。样本分离10%聚丙烯酰胺凝胶在125 v和转移到硝化纤维素膜(BioRad大力神,CA)为1小时50 v。膜被封锁在超级块1小时(热科学,罗克福德,IL)然后孵化主要抗体HO-1 (1: 500), SOD1 (1: 500), NQO1 (1: 1000), GR (1: 5000)β肌动蛋白(1:1000)其次是适当的HRP-conjugated二级抗体。膜是由化学发光使用西方SuperSignal硬脑膜衬底(热科学,罗克福德,IL)与数字图像获得使用Biospectrum UVP系统。所有信号都是标准化的β肌动蛋白获得相同的污点和百分比表示为车辆的控制(没有Protandim)条件。

2.5。免疫细胞化学Nrf2核本地化

HCAECs渐渐融合在盖玻片在35毫米聚苯乙烯细胞培养板涂有2μ克/厘米²纤连蛋白之前Protandim治疗。细胞最初接受Protandim 1小时、2小时、4小时、8小时,12小时,以确定最佳的治疗时间可视化Nrf2核本地化。以下时间课程实验中,所有Protandim治疗是1小时。细胞被洗PBS, 30分钟在4%多聚甲醛固定,用PBS洗净,然后在冷丙酮permeabilized 30分钟。细胞被封锁的1小时5%牛血清白蛋白0.5%山羊血清,然后用Nrf2孵化主要抗体(1:100)在室温下1小时。细胞与PBS培养45分钟洗FITC-conjugated二级抗体在黑暗中在室温下。盖玻片是安装在幻灯片使用DAPI包含安装媒介识别用荧光显微镜观察细胞的细胞核和(尼康TE2000)使用Metamorph数据采集软件(分子器件、桑尼维尔CA)。

2.6。TUNEL分析评估细胞凋亡

一个TdT-mediated dUTP尼克结束标记(TUNEL)试验是用来评估HCAEC细胞凋亡在回应一个氧化的挑战。细胞生长融合在fibronectin-coated盖玻片Protandim之前和H₂O₂治疗。细胞被洗PBS, 30分钟在4%多聚甲醛固定,用PBS再洗,然后permeabilized 2分钟的0.1% Triton x - 100 0.1%柠檬酸钠。细胞被洗再次PBS和孵化TUNEL试剂为1.5小时。盖玻片被安装在幻灯片使用DAPI包含安装介质识别细胞核。信号可视化使用荧光显微镜(尼康TE2000)。

2.7。Nrf2沉默

在转染前,250年μL PrimeFect稀释剂混合了5μL PrimeFect转染试剂和孵化在室温下15分钟。Nrf2 RNA被添加到转染核或控制解决方案的最终浓度50 nM和孵化在室温下15分钟。转染的解决方案应用于细胞生长在无抗生素培养基70 - 80%融合,随着1.25毫升抗生素自由生长介质。转染试剂使用引起的体积最小的痛苦最小的细胞评估细胞形态学的变化。转染24小时后,解决方案被和PBS的细胞被冲洗,Protandim处理和化验。

2.8。统计分析

未配对t测试被用来比较控制和Protandim治疗。两三个治疗(Protandim和Protandim)条件(没有RNA, RNA控制和Nrf2 siRNA)方差分析先天的线性对比的方法被用来分析Nrf2沉默实验。使用单向方差分析百分比保护进行了分析。统计学意义是。

3所示。结果

3.1。抗氧化酶反应蛋白表达水平升高Protandim治疗

HCAEC服用Protandim浓度0到50μ在5 g / mLμg / mL的增量来确定一个概要文件的Nrf2激活以HO-1蛋白质含量。难以觉察的HO-1蛋白质从控制条件8-10-fold大细胞治疗20 - 30μ克/毫升(图1(一))。浓度高于30μg / mL诱导形态变化。所有后续治疗20μ使用g / mL Protandim。HO-1蛋白质1小时后可见Protandim治疗,成为重大和持续4小时的治疗期最长12小时(数据没有显示)。确认处理浓度和时间我们确定20多个抗氧化酶μg / mL Protandim 12小时诱导HO-1(778%的控制+82.25),SOD1(125.9%的控制+6.05),NQO1(126%的控制+6.5),和GR(119.5%的控制+7.00)(图1 (b))。所有后续治疗使用Protandim 20浓度μg / mL 12小时除非另有注明。

3.2。Protandim刺激Nrf2核本地化

HCAECs服用Protandim 12个小时,随后可视化通过免疫细胞化学确定Nrf2核本地化。尽快Nrf2内容和核本地化高架Protandim治疗开始后1小时。感应保持与治疗2、4、8和12小时(12小时检查治疗持续时间最长的)(图2)。

3.3。Protandim保护HCAEC免受氧化诱导细胞凋亡的挑战

与Protandim HCAECs治疗12小时或车辆控制4 hr暴露于1.25μM H₂O₂和诱导细胞凋亡被TUNEL分析测量。Protandim之前被H₂O₂、曝光。在车辆控制细胞凋亡诱导细胞的34%(数据3(一个)和3 (b)),而只有6%的细胞治疗前Protandim H₂O₂凋亡(而车辆控制)(数据3(一个)和3 (b))。

3.4。Nrf2沉默减少Protandim-Induced增加HO-1从氧化和保护的挑战

Nrf2沉默使用siRNA Protandim治疗之前确定Protandim诱导增加抗氧化酶的表达和保护通过Nrf2激活。之前Nrf2沉默Protandim治疗显著地抑制()Protandim-induced HO-1蛋白表达相比都没有RNA, RNA和控制条件。(数据4(一)和4 (b))。没有差异,没有有或没有Protandim RNA RNA和控制条件。

Nrf2当时沉默Protandim治疗前和氧化的挑战。在细胞接收没有收到控制RNA, RNA和细胞细胞进行了细胞凋亡的30 - 40%(数据5(一)和5小干扰rna治疗前(b)。Nrf2 H₂O₂导致细胞凋亡在80%的细胞()相比没有RNA RNA(数据和控制条件5(一)和5(b))。在没有RNA RNA和控制条件,之前Protandim治疗H₂O₂导致显著减少凋亡细胞()(图5(b))。凋亡细胞的数量状况没有RNA RNA控制条件相比没有明显不同的有或没有Protandim (没有Protandim,Protandim)。Protandim Nrf2 siRNA之前也显著保护细胞免于凋亡();然而提供的大量的保护Protandim在这种情况下显著低于没有RNA RNA和控制条件(和职责。)(图5(c))。

4所示。讨论

小说的研究发现是Protandim治疗HCAEC诱导Nrf2核本地化和二期抗氧化酶的表达,Protandim治疗前一个氧化的挑战是防止细胞凋亡,这依赖于Nrf2保护。我们的数据表明,植物化学的组件Protandim增加Nrf2 HCAEC的胞质及核后的一小时内治疗。在到达我们观察到在15分钟内增加Nrf2 Protandim治疗(未发表的数据)。Nrf2仍然通过治疗的持续时间提高到12个小时,最长的时间检查。这些数据显示第一次立即大幅和持续的影响Protandim HCAEC Nrf2。

4.1。Protandim诱导抗氧化酶

Protandim激活Nrf2协同工作的组件和诱导抗氧化酶的表达。HO-1信使rna是增加到500%的控制响应到40μg / mL Protandim MIN6细胞和1000%的控制在20μg / mL Protandim SK-N-MC细胞(16]。然而,当Protandim的每个植物化学的组件测试分别在Protandim提取的低浓度发现,HO-1 mRNA的最大增长不到200%的控制(16]。当我们观察到显著的蛋白表达多种抗氧化酶(大约125%的控制SOD1、GR和NQO1), HO-1 Protandim-induced增长超过700%的控制。直到最近,HO-1的抗氧化性能被认为是通过生产活性氧清除剂的胆红素,但数据表明HO-1可能有其他抗氧化剂质量和脉管系统在多种细胞类型非常重要。Kadl等人发现,在巨噬细胞细胞死亡是加剧了在缺乏Nrf2或抑制HO-1活动(21]。巨噬细胞中也得到了证实,HO-1减少血红素是一种抗氧化剂的功能可用性,降低NADPH氧化酶的表达血红素含有亚基随后降低过氧化物生产(28]。

减少氮氧化物过氧化物生产在巨噬细胞和内皮细胞有重要意义。存在大量的证据证明氮氧化物的作用,增加了过氧化物生产肥胖和动脉粥样硬化。nonobese控制相比,超重,肥胖受试者展示氮氧化物亚基表达和增强血管内皮的氧化应激(29日]。氮氧化物亚基表达升高在病变的冠状动脉旁路移植患者,尤其是附近的巨噬细胞和氮氧化物表达水平与动脉粥样硬化的严重程度(10]。过氧化物产生的任何机制包括氮氧化物迅速转化为H₂O₂。我们的实验使用H₂O₂在HCAEC作为氧化应激诱导细胞凋亡。虽然H的浓度₂O₂用于我们的实验是基于一致的诱导细胞凋亡在30 - 50%的未经处理的细胞,H₂O₂是一个有关氧化剂在活的有机体内(30.]。

HO-1是否还函数是一种有效的抗氧化剂在内皮细胞血红素通过减少可用性、抑制氮氧化物,和减少过氧化物生产,或通过另一种机制也尚未确定。大基线HO-1主动脉内皮细胞表达也导致减少氧化磷脂对炎症基因的影响(31日),这表明存在HO-1可能延缓疾病表型改变细胞的发展正面临着慢性脂质和氧化压力。时超出了本研究的范围,决定HO-1至关重要的Nrf2-dependent Protandim诱导防止氧化的挑战是必要的。

SOD1、GR和NQO1也显著升高HCAEC回应Protandim虽然效果不是一样大,看到HO-1。这是第一个数据表明GR和NQO1 Protandim反应;增加SOD1表达式和活动曾被报导过15,27]。在红细胞从人体分离后120天的Protandim补充,SOD活性增加了30% (15]。在一个体外人类隐静脉的准备,Protandim治疗SOD活性增加三倍,HO-1活动7倍,过氧化氢酶活动的12 (27]。过氧化氢酶已被证明是提高Protandim和协调保护作用在红细胞和隐静脉制剂,以及防止皮肤癌发展动物模型(15,27,32]。总的来说,这些数据表明,增加抗氧化酶后Protandim治疗特定细胞类型的方式。

4.2。Protandim Nrf2介导防止氧化的挑战

Protandim治疗保护HCAEC从H₂O₂全身的细胞凋亡的影响,显著降低而不是废除Nrf2 Protandim治疗前的沉默。对这种现象有多种可能的解释。首先,减少但不完整的保护可能是由于Nrf2快速的周转率。Nrf2表达起来从而迅速退化。如果细胞Nrf2的半衰期小于30分钟(33]。交付的Nrf2 siRNA可减少提前完成Protandim和H₂O₂治疗Nrf2迅速翻了。第二,siRNA可交付的数量是有限的能力容忍转染的细胞过程。交付的容量小干扰rna沉默Nrf2可能超过Nrf2前所述连续Protandim营业额和后续增加的反应。最后,也可以独立于Nrf2活性抗氧化酶等其他蛋白质p53和sirtuins蛋白(34,35]。然而,我们的数据表明,更多的细胞凋亡在回应一个氧化挑战如果Nrf2沉默不管Protandim治疗指示cytoprotection Nrf2的重要性。

我们使用在内皮细胞凋亡的结果,因为它直接翻译血管疾病的发展和结果。内皮细胞凋亡导致斑块进展和破裂和血栓形成的可能是一个独立的风险因素36]。能诱导内皮细胞凋亡氧化脂质以及活性氧,在动脉粥样硬化和血管内皮细胞凋亡的作用被广泛审查(37- - - - - -39]。

4.3。翻译和未来的研究

我们的数据表明Protandim健康的积极影响冠状动脉内皮细胞支持未来考试的Protandim可能如何影响细胞长期暴露于氧化和脂质挑战。大多数人经历短暂的和/或慢性脂质和氧化应激的脉管系统在生活,积累的影响,最终导致明显的血管疾病。因此,确定Protandim感兴趣的可以减缓或逆转疾病相关的内皮细胞表型改变使用在活的有机体内慢性氧化应激模型。

补充与Protandim对人类是安全的,没有副作用报道(15,16]。已经表明,口服补充Protandim人类循环TBARs,衡量脂质过氧化,减少5 - 12天,产生影响,坚持继续补充,以30和120天15]。此外,红细胞与受试者摄入Protandim 120天相比,有更大的超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活动控制(15]。人体吸收的剂量(15)诱发类似的增加抗氧化酶比20μ克/毫升浓度用于我们的实验。因此影响我们的细胞培养模型中观察到的直接反映在活的有机体内表明暴露的细胞的组件Protandim在人类受试者可能类似于我们使用在体外。研究在活的有机体内将需要执行,以确定如果这些结果可翻译完整的冠状动脉。

5。结论

我们目前的调查显示,首次Protandim治疗HCAEC诱发Nrf2核本地化,二期抗氧化酶的表达,从一个氧化剂和Nrf2-dependent保护压力。氧化应激在CAD起始和发展的作用,和我们的数据支持进一步研究植物化学的Nrf2激活和内源性抗氧化反应作为一个潜在的治疗方法。

缩写

HO-1:	血红素oxygenase-1
Nrf 2:	NF-E2-related因子2
ROS:	活性氧
SOD:	超氧化物歧化酶
格:	谷胱甘肽还原酶
NQO1:	NAD (P) H脱氢酶(醌)1
Keap-1:	Kelch-like ECH-associated蛋白1
计算机辅助设计:	冠状动脉疾病
HCAEC:	人类冠状动脉内皮细胞。

作者的贡献

e·l·多诺万·d·j。罗伊兰,b·f·米勒和k·l·汉密尔顿设计研究;e d进行了研究;j·m·麦考德提供必要的试剂;e·l·多诺万b·f·米勒和k·l·汉密尔顿分析数据并进行统计分析;e·l·多诺万写道。阅读和批准所有的作者都最后的手稿。

确认

作者感谢劳里Biela和曼弗雷德迪博士的帮助。资金是由基督教社会联盟提供蛋白质组学和代谢组学设施学术浓缩计划和科罗拉多州立大学cah minigrant。

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