文摘

顺铂(CDDP)是其中一个最活跃的细胞毒性药物治疗癌症和肾毒性、肝毒性等副作用。本研究旨在确定蜂王浆的影响(RJ)对CDDP引起的氧化应激损伤的肾脏和肝脏,通过测量组织的生化和抗氧化参数和调查细胞凋亡免疫组织化学。24的雄性sd大鼠中被分为四组,C组:对照组收到0.9%生理盐水;集团CDDP: ip注射顺铂(CDDP 7毫克公斤⁻¹体重i.p。、单剂量);治疗组RJ:连续15天通过与RJ填喂法(300毫克/公斤/天);集团RJ + CDDP:治疗填喂法与CDDP RJ单一注射后的15天。丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH),谷胱甘肽S-transferase(销售税)、谷胱甘肽过氧化物酶(氧化酶)和超氧化物歧化酶(SOD)活性测定在肝脏和肾脏匀浆,和肝脏和肾脏组织学检查。RJ引起显著的保护作用对肝脏和肾脏通过减少脂质过氧化水平(MDA),提高谷胱甘肽的水平,并增加销售税的活动,氧化酶和草皮。在免疫组织化学检查观察到显著增强凋亡细胞数量由顺铂和退行性变化,但这些组织学变化降低肝脏和肾脏组织的RJ + CDDP组。此外,RJ治疗导致肝细胞和肾小管上皮细胞凋亡的增加活动。总之,RJ可能与顺铂化疗改善cisplatin-induced氧化压力参数和凋亡的活动。

1。介绍

Cis-Diaminedichloroplatinum(2)(CDDP),俗称顺铂,建立了作为一个有效的化学治疗剂用于治疗多种癌症如卵巢、膀胱、睾丸,头部和颈部,子宫颈癌癌(1,2]。顺铂的主要dose-limiting副作用是其肾毒性、肝毒性、肾毒性可导致严重的肾病导致急性肾功能衰竭。在几项研究已经证明,注入顺铂产生明显减少肾血流量和肾小球滤过率。肾脏和肝脏功能的改变引起的顺铂与脂质过氧化作用的增加密切相关和活性氧(ROS)的组织(3,4]。此外,顺铂有肝损伤机制等功能和结构线粒体损伤,细胞凋亡,扰动在Ca^{2 +}体内平衡(5,6]。

活性氧(ROS)如过氧化氢、羟自由基、单线态氧,超氧化物阴离子,和过氧化氢自由基形成细胞内暴露于内源性和外源性药物,导致损害许多重要的生物分子,已经涉及到几种疾病(7]。在检查这些prooxidants内源性抗氧化剂,但疾病条件下,平衡转移支持prooxidants,导致氧化应激。过量的活性氧造成重大氧化损伤通过攻击膜脂质等生物分子,DNA和蛋白质在细胞8]。与许多疾病包括相关的氧化应激是神经系统疾病如阿尔茨海默氏症的大脑和帕金森症,慢性心脏疾病,肾脏和肝脏疾病(9]。内源性抗氧化剂,如减少谷胱甘肽(GSH),谷胱甘肽过氧化物酶(氧化酶),超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)的化合物作为自由基食腐动物。这些抗氧化剂与自由基的电子给体和反应生成无害的产品,如水。因此,抗氧化剂防止氧化应激和防止细胞损伤(10]。

一些天然产物,比如lycopen [11),葡萄籽萃取物12[],绿茶13[],咖啡酸苯乙基酯14),有一个演示了对cisplatin-induced肾脏和肝脏氧化损伤保护作用。因此,有相当大的兴趣的作用自然是代理治疗肾脏和肝脏疾病。最近,蜂王浆(RJ)收到了特别关注,因为研究的报道,它是一种高效抗氧化剂和自由基清除能力4,15]。蜂王浆是一种咽下的,下颌腺分泌出的工人蜜蜂(的蜜蜂)。它包含许多重要化合物与自由等生物活性氨基酸、蛋白质、糖类、脂肪酸、矿物质和维生素(16]。到目前为止,RJ已经证明拥有几个实验动物的生理活动,包括vasodilative和低血压的活动(17),血清胆固醇水平下降的感应18),抗菌19,抗过敏药20.,抗炎21),免疫调节22,23),和抗氧化性能16]。此外,坎波尔et al。24]显示RJ paracetamol-induced对肝损伤的保护作用老鼠。

细胞凋亡是一种由事件相关的特殊的细胞形态变化,如收缩,染色质凝聚和DNA损害(25]。很多因素导致凋亡机制,认为发挥关键作用的两个主要家庭的蛋白质,包括半胱氨酸蛋白酶叫做半胱天冬酶酶(特别是半胱天冬酶3、8和9)和bcl - 2家族。半胱天冬酶3 8和9酶在凋亡过程中发挥有效作用的肝脏和肾脏。Caspase-3,最重要的半胱天冬酶家族的成员,负责许多细胞凋亡的生化机制,导致核和胞质基质的乳沟,染色质缩合、DNA片段化,而凋亡体(26,27]。然而,Bcl - 2,这是徒凋亡(Bcl -)或proapoptotic (Bcl -),Bcl -,这个家族的重要一员,阻止凋亡活动通过阻断细胞色素c从线粒体释放28]。

因此,本研究的目的是探讨保护作用的蜂王浆cisplatin-induced氧化损伤和凋亡改变老鼠的肝脏和肾脏的生化和免疫组织化学方法。

2。结果

2.1。生化研究

没有动物死在控制和其他RJ -和CDDP-treated组。RJ和CDDP血清生化的影响参数表1。CDDP-treated老鼠有显著提高ALT, AST活动,和肌酐水平()。然而,老鼠的预处理与这些CDDP RJ显著抑制- - - - - -ALT和AST升高诱导活动和肌酐水平。此外,RJ单独诱导所有生化测试参数变化不显著。

MDA的变化及谷胱甘肽,谷胱甘肽水平- - - - - -Px,销售税,肝脏和肾脏SOD活动如表所示2。MDA含量在肝脏和肾脏的动物管理CDDP单独观察显示与对照组相比显著增加,这增加被发现统计学意义()。这与RJ增加减毒的预处理。而且,显著()谷胱甘肽水平降低和氧化酶、销售税和SOD活动被认为CDDP-treated肝脏和肾脏组织的大鼠与对照组相比。预处理大鼠的RJ缓解这些CDDP-induced降低(表2)。独自RJ治疗导致显著增加谷胱甘肽,谷胱甘肽的水平- - - - - -Px、销售税和SOD活动伴随着相比显著降低MDA值控制。

2.2。组织化学和免疫组织化学结果

的肝脏和肾脏RJ-only集团控制和显示正常的组织学结构。CCDP-treated组,显著的组织学改变组成的拥堵,扩张,上皮细胞液泡化,单核细胞在肝脏和肾脏组织的渗透。另一方面,这些变化是减少RJ + CCDP对待动物。

在这项研究中,凋亡和凋亡immunepositive反应在肝脏和肾脏研究caspase-3和Bcl -抗体,分别。凋亡及凋亡活动组的比较如图1,2,3,4。Caspase-3免疫活性细胞强烈在肝脏中央静脉周围观察(图1)和近端小管上皮细胞和肾肾小球CDDP集团(图2)。我们观察到凋亡细胞的数量增加的肝脏和肾脏CDDP组与其他组相比,但是,RJ + CDDP组,有显著减少凋亡细胞数(、表3)。此外,有趣的是预防退化性变化和减少caspase-3 RJ治疗活动近端小管(图据CDDP组2)。Bcl -观察免疫活性浓度在中央静脉周围肝(图3),在肾皮质,肾脏的肾小球囊,足细胞相比其他群体CCDP组(图4)。另一方面,Bcl -积极的反应是增加RJ组相对于对照组(数字3和4)。

3所示。讨论

最近的研究表明,使用植物的chemopreventive代理结合化疗可以增强化疗药物的疗效,降低其毒性正常组织(4,17,24,29日- - - - - -31日]。本研究调查的影响RJ CDDP-induced肝脏和肾脏损害。动物收到CDDP显示血清和组织严重的生化和组织学变化。另一方面,预处理与RJ引起显著改善测试参数,由CDDP显著改变管理。血清肌酐浓度常用来衡量肾功能在临床实践32]。在我们的研究中,表1显示血清肌酐浓度的增加。在目前的研究中,动物的肌酐浓度,观察单靠CDDP处理增加了。还附带的组织学研究显示肾脏皮质肾小管细胞严重变性CDDP-treated老鼠。一些作者也描述了增加CDDP对肌酐水平和组织学变化的影响(33- - - - - -35]。在这项研究中,美国政府的RJ CDDP治疗前显著预防血清肌酐水平的增加与CDDP单独治疗组。此外,组织学研究表明,RJ政府在肝脏和肾脏造成更少的退行性改变先前的研究。

AST和ALT活动的增加CDDP-alone组被发现与损害肝脏和肝脏功能的变化。血清AST和ALT水平的上升归因于受损肝脏的结构完整性,因为这些通常都是位于细胞质中,而在肝损伤后释放到循环(36]。Greggi安图内斯等。33),Parlakpinar et al。34),而莫拉et al。35]也描述了增加CDDP对血清AST和ALT的变化的影响的活动。另一方面,预处理的RJ显著抑制CDDP-induced肝损伤就是明证降低血清AST和ALT(表的活动1)。此外,肝脏组织病理学分析部分表示温和的小叶中心的坏死和淋巴细胞浸润与CDDP相比,老鼠RJ + CDDP处理。

顺铂作用于肿瘤细胞通过释放自由基如超氧化物自由基、羟基自由基、过氧化氢自由基、单线态氧,同时损害肝脏和肾脏细胞。自由基已知攻击细胞膜的高度不饱和脂肪酸诱导脂质过氧化反应,这被认为是在许多病理事件和关键过程的反应引起的氧化应激(1,37]。顺铂治疗引起的增加脂质过氧化水平,减少抗氧化酶的活动,防止脂质过氧化作用在肝脏和肾脏等组织(31日,38]。已经提出许多细胞通路为诱导氧化应激和脂质过氧化物的状态。例如,它可能cisplatin-induced氧化应激和细胞色素P450 2 e1 (CYP2E1)介导的氧化应激协调产生肝毒性(39]。另一方面,Safirstein [40)表示,顺铂在肾脏的主要目标是连续近端和远曲小管,它积累,鼓励由多个机制如氧化应激、细胞损伤DNA损伤和细胞凋亡。

目前的研究表明,脂质过氧化(MDA)在大鼠肝脏和肾脏显著增加顺铂单独对待。这个结果同意以前的研究已证明的参与氧化应激和脂质过氧化CDDP-induced肝脏和肾脏毒性(4,11,13,14,31日]。预防性RJ治疗显著改善的增加肝脏和肾脏MDA水平。RJ包含生物活性氨基酸如天冬氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、酪氨酸、甘氨酸、赖氨酸、亮氨酸、缬氨酸和异亮氨酸。先前的研究表明,RJ的抗氧化作用可能与它的自由氨基酸含量(41]。

活性氧(ROS)如过氧化氢、超氧化物阴离子,羟基自由基生成细胞在正常条件和由主要清道夫立即解毒酶(SOD基于谷胱甘肽的酶如氧化酶、消费税,和猫。然而,过量的活性氧产量CDDP导致抗氧化失衡,导致脂质过氧化和抗氧化损耗42]。在我们的研究中,主要的食腐动物酶活动(谷胱甘肽、氧化酶、销售税和SOD)明显降低cisplatin-treated老鼠的肝脏和肾脏。这个结果可能与CDDP-induced自由基生成增加或减少数量的保护酶对脂质过氧化作用。在以前的研究中,CDDP被发现对肝脏和肾脏组织过氧化效应(4,14,34]。然而,RJ治疗改善cisplatin-induced肝脏和肾脏损害由于自由基的生产。与此同时,谷胱甘肽水平升高,氧化酶的活动,销售税,CDDP + RJ组SOD酶隐含在自由基的数量减少顺铂管理和反映这些酶在自由基的清除中发挥了重要作用。我们的研究结果与其他研究者的结果如Al-Majed et al。43),Aleisa et al。44],Arafa [30.)对肾脏和肝脏组织中注射顺铂和卡铂引起低的谷胱甘肽,氧化酶SOD,一氧化氮水平。此外,在这项研究中,观察到的谷胱甘肽水平,活动的销售税,氧化酶,SOD CDDP + RJ-treated组高于CDDP组。这些结果表明,RJ支持影响增加谷胱甘肽的抗氧化系统,氧化酶,销售税,SOD活动。最近,它已被证实,RJ防止四氯化碳- [15)、镉- [45),和对乙酰氨基酚(扑热息痛)24分别诱导肝毒性基因毒性和肾毒性。

许多研究报道,CDDP被发现有凋亡影响肾脏和肝脏(28,46- - - - - -48]。细胞凋亡的特征是磷脂酰丝氨酸外化、细胞膜出芽细胞收缩,染色质凝聚。凋亡细胞凋亡蛋白酶酶命名为引发剂还存在(例如,2,8,9,10,12)和效应还存在(例如,3、6和7)。通过激活效应还存在行为还存在引发剂的引发凋亡过程(26,27,49),而bcl - 2家族蛋白质,一般行为凋亡,抑制线粒体细胞色素c的释放和程序性细胞death-inducing酶(28,50,51]。Bcl -bcl - 2家族的一员,一直在观察细胞凋亡调节化疗反应(51,52]。Bcl -可能抑制凋亡过程形成一个抑制复杂procaspase-9和Apaf-1,过度的延迟或抑制细胞凋亡53),以及提供一个真正的生存优势在细胞治疗与化疗药物(51]。在这项研究中,增加免疫阳性染色的Bcl -观察在肝脏和肾脏部分RJ + CCDP相比CCDP组。这些发现表明,过度的Bcl -模式家族蛋白引起的蜂王浆中可能需要化疗。

Caspase-3已被确认为在哺乳动物细胞凋亡的重要中介。细胞凋亡是由激活的发起者caspases-8 caspase-9,这引发效应caspase-3 [54]。肾脏细胞死亡是顺铂治疗期间化疗的结果,是限制其使用的主要因素之一(47,55]。cisplatin-treated肾脏近端小管的可能显示组织学变化,如细胞凋亡和肿瘤病49]。这类似于体外细胞凋亡或结果与顺铂肿瘤病取决于暴露的浓度和长度(56]。体外,caspase-3被激活在cisplatin-induced肾细胞凋亡(56),但负责caspase-3激活的机制尚未完全了解。在这项研究中,增加caspase-3表达观察老鼠的肝脏和肾脏CCDP处理与对照组相比。本研究的结果与先前的报道是在协议(29日,48,57]。cisplatin-induced凋亡被认为是DNA损伤的结果(46,47]。这些结果说明caspase-3活动增加可能与CCDP-induced细胞凋亡相关。此外,RJ预处理前CCDP注射免疫染色在肝脏和肾脏降低凋亡细胞的数量,但增加凋亡Bcl -活动。因此,cisplatin-induced凋亡,至少在某种程度上,可能会阻止蜂王浆。

4所示。结论

总之,CDDP处理诱发肝脏和肾脏损伤的血清生化参数的海拔,抗氧化活性的下降,caspase-3免疫染色细胞数量的增加。自由基的过度生产上述变化的主要原因之一。然而,预处理RJ发现减少CDDP-induced肝脏和肾脏的化学变化和凋亡细胞数。这可能是由于凋亡的保护,蜂王浆的抗氧化剂和自由基清除活动和其组件。因此,RJ可能有助于防止肝脏和肾脏毒性表现为CDDP化疗。

5。材料和方法

5.1。材料

蜂王浆是来自ArıMuhendislik公司,安卡拉,土耳其,并储存在−20°C到使用。剂量300毫克/公斤RJ是溶解在蒸馏水和连续10天口服组RJ和RJ + CDDP老鼠。CDDP的注射形式(Ebewe和、伊斯坦布尔,土耳其)从当地药店购买。所有其他化学物质从σ(圣路易斯,密苏里州,美国)。

5.2。动物和治疗

阿塔土尔克大学实验研究中心、埃尔祖鲁姆土耳其,成年女性的雄性sd大鼠中提供,180±20克,6 - 8周大。动物被关在铁笼的温度22 - 24°C和12小时光/暗周期在研究过程中,美联储与标准商业老鼠食物和自来水。本研究实验都是经当地伦理委员会批准在凯末尔大学动物实验。动物们被分成4组,每6老鼠,根据他们的实验治疗。对照组大鼠(C)收到0.9%生理盐水。蜂王浆组大鼠连续15天(RJ)治疗与RJ填喂法(300毫克/公斤/天)。顺铂组大鼠(CDDP)收到了单剂注入CDDP(7毫克/公斤体重i.p。;Ebewe和、土耳其伊斯坦布尔)。蜂王浆+顺铂组大鼠(RJ + CDDP)收到单一口服剂量的蜂王浆(300毫克/公斤/天订单。)连续15天的单剂量腹腔注射CDDP(7毫克/公斤⁻¹)。

5.3。样本收集和生化检测

24小时最后RJ和CDDP治疗后,所有的动物都被麻醉的ip注入60毫克钠pentobarbitone每公斤体重,然后牺牲颈椎错位。血液样本收集管和离心10分钟的3000克。血清中分离了出来,然后储存在−80°C到分析。肝脏和肾脏被移除,用生理盐水洗净,并存储在−80°C到分析。所有组织都保持在+ 4°C在准备。肝脏和肾脏的一部分(1:9,w / v)化验都是均质在0.9%氯化钠溶液的泛光灯TH国际高速搅拌器(美国弗吉尼亚州Warrenton)。组织匀浆在15.000 g离心15分钟,然后分析的清晰的浮层被移除。测量的丙二醛(MDA)水平,Ohkawa描述的方法等。58使用了)。测量组织谷胱甘肽(GSH),谷胱甘肽过氧化物酶(氧化酶),glutathione-S-transferase(销售税)和超氧化物歧化酶(SOD)活动依法进行描述的方法由研究院和蒂策(资助59)和安德森(60),屋和情人节61年),Habig et al。62年),和太阳等。63年),分别。结果表示为MDA nmol / g蛋白,μ摩尔/ g蛋白对谷胱甘肽和销售税,U / g蛋白氧化酶和草皮。丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)活动和肌酐浓度测定采用自动分析器(au - 2700;奥林匹斯山,日本东京)。

5.4。组织化学和免疫组织化学检查

肝脏和肾脏样本固定在10%中性缓冲福尔马林和嵌入在石蜡。石蜡块是降低5 - 7μ米厚,沾染了马洛里斯曼的三重染色改性。染色标本在光学显微镜下检查。凋亡细胞免疫组织化学方法测定(streptavidin-biotin-peroxidase染色)视为棕色的颜色。免疫组织化学检查,主要抗体单克隆caspase-3 (biovision稀释:1/25——3015 - 100年)和Bcl -(稀释:1/50圣克鲁斯- sc - 8392)和生物素化的二次抗体(DAKO-Universal LSAB Kit-K0690)。抗体结合位点的可视化与轻拍(σ)由高功率光显微镜检查和评估(尼康i50)。凋亡和细胞凋亡染色都是估计一个图像处理系统(Kameram单反,1.6.1.0 Mikro SistemŞti。、土耳其)。对于每一个标本,caspase-3和Bcl -immunreactivities检查在10个随机选择的地区约X20的目标。

部分的微观得分是由一个组织病理学实验室技术人员和组织学家。这已由规模:弱在≤25%的组织;:轻度≤50%的组织;:温和≤75%的组织;:≥75%的很强的组织。平均退化强度计算和报告如下:+ -1.00 = 0.00;+ + = 1.01 - -2.00;+ + + = 2.01 - -3.00;+ + + + -4.00 = 3.01。分数派生的半定量的使用光学显微镜对每个动物和报告的准备工作如下:没有:−,温和:+,温和:+ +,严重:+ + +,和很强的:+ + + +。

5.5。统计分析

统计分析,测试组之间的差异的方差分析(方差分析)其次是邓肯的事后测试使用SPSS 17.0为Windows XP (SPSS Inc .)、芝加哥、生病)。一个值被认为是显著的。所有数据都表示为平均值,±S.E.M.