的内化金黄色葡萄球菌在淋巴细胞诱导氧化应激和DNA碎片:可能的改善作用Nanoconjugated万古霉素

文摘

金黄色葡萄球菌经常是最孤立的病原体引起血液感染,皮肤和软组织感染和肺炎。淋巴细胞是一个重要的免疫细胞。本文的目的是要测试的改善作用nanoconjugated对Vancomycin-sensitive万古霉素金黄色葡萄球菌(VSSA)和vancomycin-resistant金黄色葡萄球菌(VRSA)侵染诱导淋巴细胞的氧化应激。VSSA和VRSA感染是在瑞士小鼠的腹腔内注射CFU /毫升细菌的解决方案。Nanoconjugated万古霉素是adminstrated VSSA——VRSA-infected老鼠在其有效剂量为10天。万古霉素是adminstrated VSSA VRSA-infected老鼠在一个类似的剂量,分别为10天。万古霉素和nanoconjugated万古霉素adminstrated正常小鼠在有效剂量为10天。本研究的结果显示,体内VSSA和VRSA感染显著增加脂质过氧化水平,蛋白质氧化,氧化谷胱甘肽水平,亚硝酸盐,亚硝酸盐释放,和DNA损伤和减少减少谷胱甘肽的水平,抗氧化酶的地位,和glutathione-dependent酶与对照组相比显著增加或减少附近正常nanoconjugated vancomycin-treated组。这些发现表明潜在的使用和有益作用nanoconjugated万古霉素对VSSA和VRSA侵染诱导淋巴细胞的氧化应激。

1。介绍

金黄色葡萄球菌是一个主要的人类病原体引起严重两社区——和院内感染的发病率和死亡率(1]。它会导致不同的感染从相对较小的皮肤和伤口感染更严重,危及生命的疾病,如肺炎、心内膜炎、骨髓炎、关节炎和败血症。担忧出现耐多药菌株有兴趣重燃的理解这种病原体的毒性机制在分子水平上阐明宿主防御元素提供保护或限制感染(2,3]。许多葡萄球菌感染往往成为慢性(如骨髓炎和乳腺炎)与多个相关复发甚至不解决在什么似乎是一个适当的体液免疫反应(4]。金黄色葡萄球菌已被证明是由非专业的吞噬细胞摄取,如小鼠成纤维细胞、小鼠肾细胞,牛乳腺上皮细胞(5,6]。金黄色葡萄球菌也有能力入侵老鼠和人类成骨细胞细胞系,以及正常的老鼠和人类成骨细胞(7,8]。

多形核中性粒细胞(中性粒细胞)长久以来一直被认为提供重要的宿主防御金黄色葡萄球菌感染主要是因为患者粒细胞减少性或先天性或获得在中性粒细胞功能更容易感染病原体(9]。吞噬细胞的可能性,尤其是中性粒细胞,可以促进金黄色葡萄球菌感染已被其他调查人员提出10- - - - - -13]。体内研究建议的能力金黄色葡萄球菌利用宿主生存在中性粒细胞的炎症反应是这种病原体的毒性机制,调制的炎症反应就足以显著改变引起的发病率和死亡率金黄色葡萄球菌感染(14]。直到现在没有研究评估是否生存金黄色葡萄球菌内淋巴细胞体内,这是否能促进感染发生。

壳聚糖(CS),甲壳素脱去乙酰基的形式,是一个线性多糖,由葡萄糖胺和n -乙酰葡萄糖胺在有关β链接(15]。CS报道具有免疫刺激属性例如增加积累和激活巨噬细胞和多形核的抑制肿瘤的生长,增加抗体反应和诱导细胞因子的生产(16]。羧甲基壳聚糖(CMC)是合成羧化作用从CS的羟基和胺组(17]。在我们之前的实验室报告,我们合成了羧甲基chitosan-2, 2′-ethylenedioxy bis ethylamine-Folate (CMC-EDBE-FA)基于羧甲基壳聚糖纳米粒子标记叶酸通过共价连接2,2′- (ethylenedioxy) bis(乙胺);万古霉素装上它被称为“nanoconjugated万古霉素”,观察其体外杀菌活性金黄色葡萄球菌(18]。在我们的实验室最近的报告中,我们观察到CMC-EDBE-FA是无毒的,它能抑制oxide-mediated氮金黄色葡萄球菌发病机理在淋巴细胞的剂量,duration-dependent方式(19,20.]。本研究旨在测试的改善作用nanoconjugated万古霉素对VSSA——VRSA-induced淋巴细胞的氧化应激。

2。结果

2.1。表征CMC-EDBE-FA

CMC的峰值分配如下:1741厘米⁻¹(羧基),1070 - 1136厘米⁻¹(。),1624和1506厘米⁻¹(-)。FA-EDBE显示特征吸收乐队在1650和1550厘米⁻¹位于区域相关(-CONH -),相应的,分别(C = O)伸展带和弯曲振动(nh)乐队。这两个乐队的存在表明,羧基之间形成一个酰胺键的叶酸和北半球₂胺组EDBE结束。这两个乐队的特点在CMC-EDBE-FA更加突出和激烈。这提供了额外的酰胺键的形成的证据在附件的叶酸。¹CMC-EDBE-FA H NMR光谱显示峰值约为1.9 ppm归因于acetamido-2-deoxy的甲基氢β-D-glucopyranosyl单位;峰值约为2.9 - -3.2 ppm归因于亚甲基的氢原子EDBE 4和3.5 ppm观察glucopyranosyl氢原子。很明显的质子峰8.7,7.6,6.9,6.4 ppm被观察到¹CMC-EDBE-FA H NMR谱。没有这样的峰出现在相同的化学变化¹CMC H NMR谱。这些山峰的外观确认FA-EDBE与CMC的成功结合。CMC-EDBE-FA大小的自组装纳米粒子在水介质测量激光动态光散射(DLS)不等nm。的形态学CMC-EDBE-FA self-aggregated纳米颗粒被TEM研究。nanoaggregate显示了球面几何和有一个统一的尺寸。较低的放大,纳米粒子平均尺寸大约50 nm观察(数据未显示)18]。

2.2。亚硝酸盐生成淋巴细胞和血清中释放

硝酸盐(NO)生成自由基生成的是一个指标。没有一代明显()的淋巴细胞增加了123.56%和149.66%,分别由于VSSA和VRSA感染与对照组相比,明显()减少了由于nanoconjugated万古霉素治疗,48.16%和47.19%。万古霉素的治疗没有代显著下降(VSSA-infected淋巴细胞)的32.17%,但5.08% VRSA-infected淋巴细胞中并不重要。万古霉素,最有效剂量的使用在这个实验中,并没有引起明显没有代在正常淋巴细胞;然而,nanoconjugated万古霉素,其最有效的剂量使用在这个实验中,显著降低()不代27.74%和50.33%在正常淋巴细胞(图1)。没有释放显著()血清中增加了99.91%和105.71%,分别由于VSSA和VRSA感染与对照组相比,明显()减少了由于nanoconjugated万古霉素治疗,42.11%和42.09%。万古霉素的治疗没有释放显著下降(VSSA-infected淋巴细胞)的30.73%,但3.22% VRSA感染集团并不重要。万古霉素,最有效剂量的使用在这个实验中,在对照组没有显著诱导没有释放;然而,nanoconjugated万古霉素,其最有效的剂量使用在这个实验中,显著降低()不释放20.67%和24.87%在正常血清(图3)。

2.3。髓过氧化物酶活性的淋巴细胞

髓过氧化酶(MPO)是一个很重要的酶产生次氯酸(HOCl)细胞系统,导致氧化损伤。MPO活性显著()的淋巴细胞增加了92.65%和104.28%,分别由于VSSA和VRSA感染与对照组相比,明显()减少了由于nanoconjugated万古霉素治疗,43.19%和48.29%。万古霉素治疗降低MPO活性显著(VSSA-infected淋巴细胞)的38.24%,但5.37% VRSA感染淋巴细胞中并不重要。万古霉素,最有效剂量的使用在这个实验中,没有显著诱导MPO活性在正常淋巴细胞;然而,nanoconjugated万古霉素,其最有效的剂量使用在这个实验中,显著降低()MPO活性23.6%和33.87%在正常淋巴细胞(图2)。

2.4。淋巴细胞脂质过氧化水平

脂质过氧化作用是一个重要的行列式访问细胞损伤。脂质过氧化反应的丙二醛(MDA)水平显著()的淋巴细胞增加了187.23%和228.5%,分别由于VSSA和VRSA感染与对照组相比,明显()减少了由于nanoconjugated万古霉素治疗,51.24%和54.35%。万古霉素治疗降低MDA水平显著(VSSA-infected淋巴细胞)的33.49%,但4.05% VRSA-infected淋巴细胞中并不重要。万古霉素,最有效剂量的使用在这个实验中,没有显著诱导脂质过氧化反应在正常淋巴细胞;然而,nanoconjugated万古霉素,其最有效的剂量使用在这个实验中,显著降低()MDA水平22.13%和28.38%在正常淋巴细胞(图4)。

2.5。淋巴细胞蛋白质氧化水平

和脂质过氧化反应、蛋白质氧化进入细胞损伤也是一个重要的决定因素。蛋白质的氧化羰基(PC)水平显著()的淋巴细胞增加了129.37%和164.57%,分别由于VSSA和VRSA感染对照组相比,明显()减少了由于nanoconjugated万古霉素治疗,43.71%和47.76%。万古霉素治疗减少蛋白质羰基水平显著(VSSA-infected淋巴细胞)的33.68%,但4.99% VRSA-infected淋巴细胞中并不重要。万古霉素,最有效剂量的使用在这个实验中,没有显著诱导蛋白质氧化在正常淋巴细胞;然而,nanoconjugated万古霉素,其最有效的剂量使用在这个实验中,显著降低()个人电脑水平26.51%和32.61%在正常淋巴细胞(图5)。

2.6。谷胱甘肽水平和氧化还原在淋巴细胞比率

细胞系统中谷胱甘肽是一种重要的抗氧化剂。所以了解谷胱甘肽水平,我们测量了减少和氧化谷胱甘肽的形式。减少谷胱甘肽(GSH)和氧化还原率(谷胱甘肽(GSSG)显著()在淋巴细胞减少51.2%,60.71%,73.64%,和80.52%,分别由于VSSA和VRSA感染与对照组相比,明显()增长了68.2%,94.12%,173.91%,236.76%由于治疗nanoconjugated万古霉素。万古霉素治疗减少谷胱甘肽和氧化还原率显著增加(在VSSA-infected淋巴细胞46.59%和103.26%),但15.03%和26.47%在VRSA感染淋巴细胞不显著(数字6和8)。氧化谷胱甘肽(GSSG)水平显著(在淋巴细胞升高了84.89%和101.76%,分别由于VSSA和VRSA感染与对照组相比,明显()减少了由于nanoconjugated万古霉素治疗,38.62%和42.48%。万古霉素治疗减少氧化谷胱甘肽水平显著(VSSA-infected淋巴细胞)的27.87%,但9.07% VRSA-infected淋巴细胞不显著(图7)。万古霉素没有改变任何重大变化在谷胱甘肽水平降低,氧化谷胱甘肽水平,氧化还原率在正常淋巴细胞的实验中使用的有效剂量。Nanoconjugated万古霉素,最有效剂量的使用在这个实验中,显著增加(谷胱甘肽水平和氧化还原率降低了30.4%,51.93%,68.48%,118.05%,显著降低()氧化谷胱甘肽水平22.71%和30.4%在正常淋巴细胞(数字6- - - - - -8)。

2.7。在淋巴细胞抗氧化酶地位

超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)、谷胱甘肽还原酶(GR)和glutathione-s-transferase(销售税)测定了解不同实验组的淋巴细胞抗氧化酶状态。SOD、CAT、GPx GR和GST活性明显()在淋巴细胞减少44.65%,54.41%,64.24%,50.83%,50.01%,51.12%,65.85%,66.63%,56.47%,53.55%,分别由于VSSA和VRSA感染与对照组相比,明显()增长了67.37%,83.28%,136.99%,75.93%,71.27%,79.29%,129.08%,184.31%,94.13%,86.35%由于治疗nanoconjugated万古霉素。万古霉素治疗这些抗氧化酶活性显著增加()VSSA-infected淋巴细胞48.3%,44.37%,71.96%,44.74%,和36.99%,8.52%,13.84%,6.65%,7.66%,和9.11% VRSA-infected淋巴细胞中并不重要。万古霉素,最有效剂量的使用在这个实验中,并没有改变任何重大变化在这些抗氧化酶活性,然而,nanoconjugated万古霉素,最有效剂量的使用在这个实验中,显著增加(这些抗氧化酶活动22.5%,35.4%,27.08%,32.92%,31.73%,29.22%,48.23%,38.91%,52.11%,48.14%在正常淋巴细胞(数字9- - - - - -13)。

2.8。检测淋巴细胞凋亡的DNA碎片

凋亡细胞死亡的DNA碎片是一个指标;因此,定量和定性的DNA碎片淋巴细胞在本研究评估。定量DNA碎片在所有组淋巴细胞被二苯胺(DPA)化验spectrophotometrically评估。VSSA DNA片段和VRSA感染产生的461.58%和521.52%,而对照组显示微不足道的DNA片段在淋巴细胞显著相关()。治疗nanoconjugated万古霉素显著()DNA碎片降低了68.84%和69.55%,分别。万古霉素治疗显著降低DNA碎片(VSSA-infected淋巴细胞)的47.3%,但8.05% VRSA-infected淋巴细胞中并不重要。万古霉素,最有效剂量的使用在这个实验中,没有显著诱导DNA碎片在正常淋巴细胞;然而,nanoconjugated万古霉素,其最有效的剂量使用在这个实验中,显著降低()DNA碎片27.58%和32.85%在正常淋巴细胞(图14)。确认从分光光度法获得的数据,我们分析了DNA碎片DNA梯法在1.2%琼脂糖凝胶电泳。淋巴细胞DNA琼脂糖凝胶电泳,隔绝VSSA VRSA-infected淋巴细胞,显示典型的存在DNA梯(细胞凋亡的霍尔马克),而正常淋巴细胞的DNA没有任何梯子。我们发现DNA的微不足道的涂片nanoconjugated vancomycin-treated组(图15)。

3所示。讨论

金黄色葡萄球菌长期以来被认为是一种细胞外的病原体,它甚至可能偶尔生存和繁殖在吞噬细胞内导致长期和反复感染(21]。这是一个最成功的人类病原体的能力开拓并感染住院患者或健康没有损害宿主防御和免疫能干的人在社区(22]。然而,金黄色葡萄球菌偶尔会成为细胞内,至少在单核细胞、巨噬细胞、多形核中性粒细胞(中性粒细胞)当宿主防御机制被激活(23]。我们之前的实验室报告显示,淋巴细胞是容易的金黄色葡萄球菌通过生成一氧化氮,感染和感染成功地消除了治疗nanoconjugated万古霉素剂量,duration-dependent的方式(20.]。在这种背景下,我们目前的研究证明更相关,将有助于进一步研究在调查的改善作用nanoconjugated万古霉素对VSSA和VRSA诱导淋巴细胞的氧化应激。

CMC-EDBE-FA纳米粒子是由羧基(羧基)的叶酸和羧基功能化羧甲基壳聚糖组通过end-amino组亲水性垫片连接,2,2′- (ethylenedioxy) -bis-ethylamine。众所周知,羧甲基壳聚糖易溶于水但叶酸减少水溶性。当羧甲基壳聚糖连接叶酸通过垫片,羧甲基壳聚糖可以作为亲水部分和叶酸作为疏水部分。从我们的研究,很明显,体内VSSA和VRSA感染小鼠淋巴细胞与增强硝酸盐生成、硝酸盐释放,MPO活性、MDA水平,电脑水平,GSSG水平,并减少谷胱甘肽水平,以及减少酶抗氧化(SOD,猫,GPx、GR和销售税)活动,由治疗改善nanoconjugated万古霉素(数字1- - - - - -13)。此外,DNA损伤评估DPA试验和琼脂糖凝胶电泳由于VSSA VRSA感染也观察到淋巴细胞,由治疗保护nanoconjugated万古霉素(数字14和15)。

硝酸在这项研究中,一个重要的一代,MPO活性淋巴细胞,在观察血清和硝酸盐释放VSSA VRSA-infected老鼠,而硝酸生成、MPO活性在正常淋巴细胞,和正常血清硝酸盐释放减少nanoconjugated vancomycin-treated组。治疗nanoconjugated万古霉素VSSA——and-VRSA感染小鼠没有生成,减少MPO活性显著的淋巴细胞,在血清和硝酸盐释放(数字1- - - - - -3)。一氧化氮(NO)是一种自由基合成了一氧化氮合酶(NOS)。号是由两个相同的单体分子量从130到160 kDa [24]。我们以前的研究已经表明,血清中一氧化氮在淋巴细胞合成和释放高VSSA和VRSA感染期间,可与oxidant-antioxidant潜在的变更(20.]。因此,更高层次的亚硝酸盐释放VSSA和VRSA感染可能是由于高自由基的生产,主要是没有。Nanoconjugated万古霉素起到抗氧化的作用,防止硝酸一代可能通过诱导的抑制一氧化氮合酶(间接宾语)表达式25]。次氯酸(HOCl)生成髓过氧物酶和启动antiproteases的失活和潜在的蛋白酶的激活,导致细胞损伤(26]。在这项研究中,nanoconjugated万古霉素抑制髓过氧化物酶活性的增加是由于VSSA VRSA感染,建议nanoconjugated万古霉素(图的保护作用2)。这些结果表明,细胞在淋巴细胞抗氧化剂水平达到一个更高的浓度或回收起到抗氧化作用产生的自由基髓过氧化物酶(27]。因此,除了细胞抗氧化系统,nanoconjugated万古霉素可能间接保护淋巴细胞从VSSA -和VRSA-infection-induced细胞变化。因此,抗氧化自由基损耗的代理似乎有利于防止脂质和蛋白质的损伤。

在这项研究中,相当高度的丙二醛(MDA)和蛋白质羰基水平观察VSSA——VRSA-infected小鼠的淋巴细胞;而MDA和电脑水平在正常淋巴细胞减少nanoconjugated vancomycin-treated组。治疗nanoconjugated万古霉素VSSA——VRSA-infected老鼠在淋巴细胞显著减少脂质过氧化反应和蛋白质氧化(数字4和5)。这可能是由于自由基的生成(主要是没有),可能除了脂质与蛋白质反应。脂质过氧化是扰乱细胞膜的完整性;导致泄漏细胞质酶(28]。蛋白质羰基形成被表明早期的标志蛋白质氧化。蛋白质氧化可能是由于过度氧化蛋白质或减少清理oxidative-damaged蛋白质的能力。氧化修饰的蛋白质可能会导致许多酶蛋白的结构改变和功能失活(29日),可以在不同抗氧化酶SOD活性下降,猫,GPx, GR和销售税。

活性氧(ROS)生成的氧化代谢过程中,可以对各类细胞大分子造成损伤,最终导致细胞死亡。海拔在自由基的形成伴随着立即补偿增加自由基清除酶的活动(30.]。失衡的产生活性氧(ROS)氧化应激和抗氧化系统原因。谷胱甘肽,一个重要的细胞还原剂,参与抵御自由基,过氧化物、有毒化合物在蜂窝系统31日]。在目前的研究中,谷胱甘肽水平降低,淋巴细胞的氧化还原率降低VSSA VRSA-infected老鼠,而谷胱甘肽水平和氧化还原比值在正常淋巴细胞增加nanoconjugated vancomycin-treated组。治疗nanoconjugated万古霉素VSSA和VRSA感染小鼠淋巴细胞中的谷胱甘肽水平和氧化还原率增加(数据6- - - - - -8)。在这项研究中,观察到氧化谷胱甘肽水平是增加VSSA VRSA-infected淋巴细胞,这是改善由于nanoconjugated万古霉素治疗。GSSG水平在正常淋巴细胞减少nanoconjugated vancomycin-treated组(图7)。谷胱甘肽水平降低代表其利用率的增加由于VSSA和VRSA感染。另一方面,谷胱甘肽水平降低可能是由于增加的脂质氧化产品可能会减少可用性所需的NADPH谷胱甘肽还原酶(GR)活性的改变对谷胱甘肽(GSSG32)由于增加活性氧的生产形式。在我们的研究中,增加GSSG水平和减少GR活动(图12)由于VSSA和VRSA感染可能支持的解释。

抗氧化剂酶被认为是一个主要防御,阻止生物大分子氧化损伤。SOD迅速dismutates超氧化物阴离子()来减少危险的H₂O₂由猫GPx进一步退化,水和氧气(33]。本研究的结果显示,在淋巴细胞SOD和CAT活动显著下降的VSSA -和VRSA-infected集团;而在正常淋巴细胞增加SOD和CAT活动nanoconjugated vancomycin-treated组。治疗nanoconjugated万古霉素VSSA——VRSA-infected显著增加小鼠SOD和CAT活性淋巴细胞(数字9和10)。草皮,dismutate反过来,同样是一种猫的有效抑制剂(34]。SOD活性的损耗可能是由于处理自由基,由于VSSA和VRSA产生感染。旁边,在感染期间,H₂O₂产生的超氧化物歧化作用的阴离子可能被有效地转化为O₂猫和酶活性显著降低。抗氧化酶活性的损耗是可能是由于酶的失活蛋白质VSSA和VRSA侵染诱导没有一代,酶底物的消耗的差别和/或对这些基因的转录和翻译的过程。

GPx作品是非清除和过量的氢过氧化物分解包括H₂O₂,这可能是流行在氧化应激(35- - - - - -37]。Glutathione-S-transferase(销售税)主要解毒作用亲电子化合物(38),在保护细胞中有确定的角色从诱变剂和致癌物质作为自由基清除剂以及谷胱甘肽。在目前的研究中,谷胱甘肽水平和GSH-dependent酶显著减少,也就是说,GPx, GR和销售税(数字11- - - - - -13VSSA)淋巴细胞和VRSA感染可能是由于利用率来清除自由基生成增加。本研究的结果显示GPx明显下降,GR,在淋巴细胞和销售税活动VSSA VRSA-infected集团,而GPx GR和销售税活动在正常淋巴细胞增加nanoconjugated万古霉素治疗组。治疗nanoconjugated万古霉素VSSA——GPx VRSA-infected小鼠显著增加,淋巴细胞GR和销售税活动(数据11- - - - - -13)。在目前的研究中,观察到MDA水平(图4)和DNA碎片(数据14和15显著升高淋巴细胞由于VSSA和VRSA感染。这个MDA水平减少谷胱甘肽水平升高(图6)和SOD活性(图9),这可能与淋巴细胞DNA碎片。在这项研究中,观察到DNA碎片增加VSSA VRSA-infected淋巴细胞,这是带回附近控制由于nanoconjugated万古霉素治疗。在正常淋巴细胞DNA碎片减少nanoconjugated vancomycin-treated组(图14)。

总之,这里描述的研究中,淋巴细胞是容易的金黄色葡萄球菌感染通过增加一氧化氮导致产量减少抗氧化状态的细胞,和nanoconjugated万古霉素保护从这些感染淋巴细胞减少自由基生成、脂质和蛋白质损伤,也通过增加抗氧化状态。因此,nanoconjugated万古霉素可以作为一种有效的自由基清除剂抗氧化产品,可以作为一个潜在的代理对葡萄球菌感染的治疗。

4所示。材料和方法

4.1。化学药品和试剂

钠十二烷基硫酸盐(SDS), 2, 4-dinitrophenyl肼(DNPH) 5′, 5′硫(bis) 2-nitrobenzoic酸(DTNB),标准减少谷胱甘肽(GSH),谷胱甘肽还原酶(GR)、NADPH Na₄NADPH,氧化谷胱甘肽(GSSG),琼脂糖,叶酸(FA)、壳聚糖(中等分子量),二环己基碳化二亚胺(DCC)、三氟乙酸、2,2′- (ethylenedioxy) bis(乙胺)(EDBE) di-tert-butyldicarbonate(中行₂O), N-hydroxysuccinimide (NHS)和1 -[3 -(二甲胺基)丙基]3-ethylcarbodiimide盐酸盐(EDC)核糖核酸酶A和蛋白酶K从西格玛化工有限公司购买美国。食盐(氯化钠)、十二烷基硫酸钠、乙二胺四乙酸(EDTA),大豆胰蛋白酶的肉汤,仅有肉汤,甘露醇盐琼脂、琼脂粉、蔗糖、氯化镁(MgCl₂)、叠氮化钠(NaN₃)、酚/氯仿/异戊醇溴化乙锭,和溴酚蓝从Himedia购买,印度。Tris-HCl,三羟甲基氨基甲烷缓冲液,磷酸二氢钾(KH₂阿宝₄),di磷酸氢钾(K₂HPO₄),氢氧化钠(氢氧化钠),醋酸钠,醋酸铵,酒精,磺胺,磷酸,N-C-1萘基乙二胺盐酸盐,二苯胺(DPA),甘油,硼酸,O-phenylenediamine,和其他化学品从默克有限公司采购,SRL分公司,印度孟买。所有其他化学物质来自默克有限公司,SRL Pvt,有限公司,孟买和可用的最高等级。

4.2。动物

实验使用瑞士雄性老鼠6 - 8周大,重达20 - 25 g。动物喂养标准颗粒饮食和水随意和安置在聚丙烯笼(Tarson)部门动物屋12 h:黑暗周期和温度25±2°C。动物们被允许适应一周。所使用的动物没有任何迹象表明恶性肿瘤或其他病理过程。动物是依法维护国家营养研究所的指导方针,印度医学研究理事会、海得拉巴,印度和维德雅瑟格大学的伦理委员会批准。

4.3。菌株

我们使用coagulase-positive vancomycin-sensitive和防金黄色葡萄球菌菌株,从人类分离术后脓样例(39]。这些菌株生长在37°C在大豆胰蛋白酶的肉汤。细菌培养离心机在15000 rpm 15分钟。颗粒resuspended,用无菌磷酸盐缓冲盐水洗净(PBS)。美国使用UV-spectrophotometer (Schimadzu)在620 nm的吸光度,我们调整了可行的细菌数约克隆形成单位(CFU) /毫升,这对应于一个光学密度为1.6。细菌悬液的调整是连续稀释在磷酸缓冲盐(PBS)给最终的浓度大约100年μL细菌悬液(14]。

4.4。制备CMC-EDBE-FA纳米颗粒和万古霉素的加载

CMC-EDBE-FA纳米颗粒制备,万古霉素是装上它根据我们之前的实验室报告18]。

4.5。VSSA和瑞士VRSA感染小鼠的发展

VSSA和VRSA感染了瑞士雄性小鼠的腹腔内(i.p。)注入100μ细菌悬液中含有的L根据我们之前的实验室报告CFU /毫升20.]。

4.6。实验设计

VSSA——VRSA-infected老鼠对待nanoconjugated万古霉素连续10天的剂量100毫克/公斤体重/天,500毫克/公斤体重/天,分别。的剂量和持续时间nanoconjugated万古霉素选择从我们以前的实验室报告(20.]。以下组考虑实验。我:控制。第二组:万古霉素100毫克/公斤体重/天。第三组:万古霉素500毫克/公斤体重/天。第四组:100毫克/公斤体重/天nanoconjugated万古霉素。V: 500毫克/公斤体重/天nanoconjugated万古霉素。第六组:VSSA感染。第七组:VSSA感染+万古霉素100毫克/公斤体重/天。第八组:VSSA感染+ 100毫克/公斤体重/天nanoconjugated万古霉素。第九组:VRSA感染。感染组X: VRSA万古霉素+ 500毫克/公斤体重/天。感染组XI: VRSA + 500毫克/公斤体重/天nanoconjugated万古霉素。

终止后的实验中,动物被牺牲的腹腔内注射戊巴比妥钠(60 - 70毫克/公斤体重)(40),和血液(/组)是用于血清的制备和分离淋巴细胞的生化氧化参数估计。

4.7。血清和淋巴细胞的分离

血清是通过离心的无抗凝血样1500克15分钟,并保持在−86°C的进一步评估。肝素化血样用于淋巴细胞的分离。从血液淋巴细胞分离使用标准隔离技术(41]。血样稀释以同样数量的PBS (pH值7.0)缓冲区,然后分层仔细在密度梯度(1077年Histopaque西格玛化工有限公司)1:2的比例。在500 g离心20分钟,白色的层的单核细胞,淋巴细胞小心地删除。层被洗了两次相同的缓冲和离心机3000 g 10分钟得到所需的淋巴细胞(颗粒42]。淋巴细胞在低渗的细胞溶解的颗粒溶解缓冲区为45分钟37°C和保持在−86°C到生化估计(42]。

4.8。生化估计

4.8.1。通过淋巴细胞亚硝酸盐(NO)生产

治疗后,100年μL的格里斯试剂(含1 1%磺胺在5%磷酸的一部分,和1部分的0.1% N-C-1 napthyl乙二胺盐酸盐)添加到100μL的示例中,在室温下孵化10分钟,在紫外分光光度计读数被相比在550纳米和亚硝酸钠标准曲线(值介于0.5和25μ米)。没有被表达的水平μ摩尔/毫克蛋白(43]。

4.8.2。在淋巴细胞髓过氧物酶活动的决心

200年μ与200年L细胞溶解产物的反应μL衬底(包含H₂O₂在黑暗和门诊部当)30分钟。空白的准备与磷酸柠檬酸缓冲(pH值5.2)和基质,在没有浮在表面的游离。反应停止增加100μL 2 (N)硫酸和阅读是在492 nm分光光度计(44]。MPO活性表达的μ米/毫克的蛋白质。

4.8.3。测定脂质过氧化(MDA)

脂质过氧化作用被山谷地形的方法估计马哈et al ., 200944]。简单,反应混合物包含Tris-HCl缓冲区(50毫米,pH值7.4),四丁氢过氧化物(必和必拓(500)μFeSO M在乙醇中),1毫米₄。孵化后的样品在37°C 90分钟,反应停止通过添加0.2毫升的8%十二烷基硫酸钠(SDS)其次是1.5毫升的20%乙酸(pH值3.5)。的丙二醛(MDA)中形成孵化估计通过添加1.5毫升的0.8%稍后通知,进一步加热45分钟的混合物在95°C。冷却后,样本离心机,稍后通知活性物质(TBARS)被使用在532海里浮在表面的测量米⁻¹厘米⁻¹消光系数。脂质过氧化作用的水平表示的μ摩尔/毫克的蛋白质。

4.8.4。测定蛋白质羰基在淋巴细胞(PC)的内容

蛋白质氧化是通过测量监控蛋白质羰基含量通过衍生化2,4-dinitrophenyl肼(DNPH) [44]。一般来说,在50 mM细胞溶解产物蛋白磷酸钾缓冲,pH值7.4,与DNPH derivatized 2 N盐酸(21%)。空白样本混合2 N HCl孵化1 h在黑暗中;蛋白质沉淀trichloro 20%醋酸(柠檬酸)。Underivatized蛋白质是用乙醇洗净:乙酸乙酯(1:1)混合物。最终颗粒的蛋白质溶解在6 n盐酸胍和吸光度测量在370海里。蛋白质羰基含量来表现的μ摩尔/毫克的蛋白质。

4.8.5。减少测定谷胱甘肽(GSH)

估计减少谷胱甘肽在细胞溶解产物是由山谷地形的方法·马哈et al ., 200944]。所需的样本数量和25%的柠檬酸和离心机在2000 g×15分钟解决沉淀蛋白质。上层清液吸气,稀释1毫升0.2钠磷酸盐缓冲剂(pH值8.0)。之后,2毫升的0.6毫米DTNB补充道。10分钟后,黄色的光密度由反应形成复杂的谷胱甘肽和DTNB (Ellman试剂)以405海里。得到标准曲线与标准减少谷胱甘肽。谷胱甘肽的水平被表示为μ克谷胱甘肽/毫克的蛋白质。

4.8.6。测定氧化谷胱甘肽(GSSG)

衍生化后氧化谷胱甘肽水平测定谷胱甘肽与2-vinylpyidine根据山谷地形的方法·马哈et al ., 200944]。总之,与0.5毫升样品,2μL 2-vinylpyidine添加和孵化为1小时37°C。然后混合脱去蛋白质4%磺基水杨酸和离心机在1000 g×10分钟解决沉淀蛋白质。上层清液吸气,和GSSG水平估计在412 nm DTNB反应分光光度计GSSG曲线和计算标准。GSSG被表示为的水平μ克GSSG /毫克的蛋白质。

4.8.7。超氧化物歧化酶(SOD)的活性

超氧化物歧化酶(SOD)活性测定的抑制能力的自动氧化pyrogalol根据Gautam et al ., 201045]。50 mM的反应混合物被认为是三(羟甲基)氨基甲烷(pH值8.2),1毫米二乙三胺五乙酸,20 ~ 50岁不等μL的样本。的反应是由0.2毫米pyrogalol,和吸光度测量活动在420 nm 25°C为3分钟。SOD活性表达为单位/毫克的蛋白质。

4.8.8。过氧化氢酶(CAT)的活性

细胞中过氧化氢酶活性测定的方法溶解产物Gautam et al ., 201045]。最后反应3毫升含有0.05米三羟甲基氨基甲烷缓冲液,5毫米EDTA (pH值7.0),和10毫米H₂O₂(在0.1米磷酸钾缓冲,pH值7.0)。大约50μL的样本添加到上面的混合物。吸光度的变化速度每分钟240海里被记录。过氧化氢酶活性计算通过使用43.6米的摩尔消光系数⁻¹厘米⁻¹对H₂O₂。猫的表达水平μ摩尔H₂O₂消费/分钟/毫克的蛋白质。

4.8.9。活动的谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)

谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)活性测定的方法Gautam et al ., 201045]。反应混合物中含有50 mM磷酸钾缓冲(pH值7.0),1毫米EDTA,叠氮化钠1毫米,0.2毫米NADPH, 1 U谷胱甘肽还原酶,谷胱甘肽1毫米减少。样例,后,被允许平衡为5分钟25°C。反应是由添加0.1毫升的2.5毫米H₂O₂。吸光度在340海里被记录为5分钟。值被表示为n摩尔NADPH氧化辅酶ii使用的消光系数米⁻¹厘米⁻¹在340纳米。GPx活性的表达用n摩尔NADPH消耗/分钟/毫克的蛋白质。

4.8.10。活动的谷胱甘肽还原酶(GR)

谷胱甘肽还原酶(GR)活性测定的方法Gautam et al ., 201045]。酶测定的管子在37°C和孵化GSSG包含2.0毫升的9毫米,0.02毫升的12毫米NADPH Na₄2.68毫升的1/15 M磷酸盐缓冲剂(pH值6.6),和0.1毫升的样品。这种酶的活性是由监控的吸光度下降340海里。GR表达的活动用n摩尔NADPH消耗/分钟/毫克的蛋白质。

4.8.11。活动的Glutathione-s-Transferase(销售税)

Glutathione-s-transferase(销售税)活动是衡量的方法Gautam et al ., 201045]。酶测定的管子是孵化25°C和包含2.85毫升的0.1米磷酸钾(pH值6.5)包含1毫米的谷胱甘肽,0.05毫升的60 mM 1-chloro-2, 4-dinitrobengene和0.1毫升的样品。这种酶的活性是由监控吸光度的增加在340海里。销售税的活动是表示用n摩尔NADPH消耗/分钟/毫克的蛋白质。

4.8.12。定量估算的DNA碎片分析二苯胺(DPA)测定

二苯胺(DPA)淋巴细胞反应的方法是由Peradones et al ., 199346]。高氯酸(0.5)添加到包含未雕琢的DNA(200年resuspended样本μL(低渗的裂解缓冲)和其他supernatant-containing DNA片段的一半。然后两卷的一个解决方案组成的0.088 DPA, 98% (v / v)冰醋酸,1.5% (v / v)硫酸,0.5% (v / v)的浓度1.6%乙醛溶液添加。样本储存在4°C 48 h。反应是量化spectrophotometrically 575海里。分段计算的百分比比DNA的上层清液中总DNA。

4.8.13。DNA琼脂糖凝胶电泳的分散研究

DNA凝胶电泳进行如我们之前所述实验报告(47]。总之,治疗计划后,淋巴细胞在270年resuspendedμL pre-cooled裂解缓冲(10毫米Tris-HCl, 10毫米氯化钠,10毫米EDTA, pH值7.4)与30μL SDS (10%)。核糖核酸酶A(100年最终浓度μg / mL)随后补充道,和孵化持续在45°C 45分钟。随后,蛋白酶K(100年最终浓度μg / mL)添加到细胞溶解产物,和孵化继续在50°C在一夜之间完成消化。DNA分离出溶解产物用酚/氯仿/异戊醇。然后,DNA是沉淀的一个卷10米无菌醋酸铵,并两卷绝对乙醇紧随其后在13000×g离心10分钟在4°C。提取的DNA样本用70%乙醇和溶解在50μL TE缓冲(10毫米Tris-HCl 1毫米EDTA, pH值7.6)。凝胶加载缓冲区(10毫米EDTA, 0.25%溴酚蓝、30%甘油)被添加到DNA样本在1:5比和加载到1.2%琼脂糖凝胶。电泳是在此种缓冲50 V 90分钟(90毫米Tris-HCl 2毫米EDTA, 90毫米硼酸,pH值8.0)。100个基点分子量标记(Genai,班加罗尔,印度)。电泳后,DNA被浸泡在此种凝胶缓冲区包含可视化1.5μg / mL溴化乙锭在紫外线,这张照片摄于Bio-Rad凝胶文档系统。

4.8.14。蛋白质估计

蛋白质决定根据Lowry et al ., 1951使用牛血清白蛋白作为标准48]。

4.9。统计分析

数据被表示为平均值±标准错误,。实验组和对比的手段控制,是由双向方差分析测试(使用统计软件包,起源6.1,北安普顿,马01060年美国)与多重比较测试;限制的意义。

缩写

猫:	过氧化氢酶
菌落:	集落形成单位
CMC:	羧甲基壳聚糖
CMC-EDBE-FA:	羧甲基chitosan-2 2′-ethylenedioxy bis ethylamine-Folate
CS:	壳聚糖
DLS:	动态激光光散射
分区:	二苯胺
DTNB:	5′,5′硫(bis) 2-nitrobenzoic酸
EDBE:	2,2′-ethylenedioxy bis-ethylamine
EDTA:	乙二胺四乙酸
费尔南多-阿隆索:	叶酸
HOCl:	次氯酸
GPx:	谷胱甘肽过氧化物酶
格:	谷胱甘肽还原酶
谷胱甘肽:	减少谷胱甘肽
GSSG:	氧化谷胱甘肽
销售税:	Glutathione-s-transferase
知识产权:	腹腔内
H2O2:	过氧化氢
MDA:	丙二醛
MPO:	髓过氧物酶
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌:	耐甲氧西林金黄色葡萄球菌
生理盐水:	氯化钠
NADPH:	烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸
没有:	一氧化氮
PBS:	磷酸缓冲盐
中性粒细胞:	多形核中性粒细胞
ROS:	活性氧
金黄色葡萄球菌:	金黄色葡萄球菌
SDS:	钠十二烷基硫酸盐
SOD:	超氧化物歧化酶
SSA:	磺基水杨酸
稍后通知:	硫代巴比土酸
此种:	三硼酸EDTA
TBARS:	硫代巴比土酸活性物质
柠檬酸:	Trichloro醋酸
透射电镜:	透射电子显微镜法
VSSA:	Vancomycin-sensitive金黄色葡萄球菌
VRSA:	Vancomycin-resistant金黄色葡萄球菌。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

作者表达感恩的生物技术,印度政府资助。作者还表达感恩印度理工学院,Kharagpur维德雅瑟格大学Midnapore提供设施来执行这些研究。

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