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氧化医学和细胞寿命
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氧化医学和细胞寿命/2011年/文章

研究文章|开放获取

体积 2011年 |文章的ID 935160年 | https://doi.org/10.1155/2011/935160

Silva-Aguilar马丁,罗哈斯埃米利奥瓦尔韦德马海拉, ”角色转换氧化应激诱导的金属混合物”,氧化医学和细胞寿命, 卷。2011年, 文章的ID935160年, 11 页面, 2011年。 https://doi.org/10.1155/2011/935160

角色转换氧化应激诱导的金属混合物

Silva-Aguilar马丁,1 罗哈斯埃米利奥,1 和 瓦尔韦德马海拉1

1Departamento药物Genomica y Toxicologia环境,学院Investigaciones基于,大学根据墨西哥,04510年城市大学联盟,DF、墨西哥

学术编辑器:吉尔勒莫Zalba
收到了 08年8月2011年
接受 07年9月2011年
发表 2011年12月04

文摘

金属混合物无处不在的污染物存在。特别是,arsenic-cadmium-lead是领先的有毒混合物代理环境中检测到。这些金属有致癌和细胞转化的潜力。在这项研究中,我们使用两步细胞转换模型,以确定引起的氧化应激的作用转换arsenic-cadmium-lead的混合物。氧化损伤和抗氧化剂反应测定。金属混合物治疗诱发损伤标记物的增加和抗氧化剂的反应。细胞生存能力和增加的损失将潜在的观察在推广阶段。这一发现与代活性氧显著相关。Cotreatment与N-acetyl-cysteine诱发影响转换能力;而开始减少被发现,在推广阶段总阻止改变观察能力。我们的研究结果表明,氧化应激产生的金属混合物中扮演一个重要的角色在推广阶段促进转化能力。

1。介绍

砷(As)、镉(Cd)和铅(Pb)是常用的在许多行业在一定程度上,他们已经产生了污染问题。大量研究报道高水平的这些金属冶炼厂附近地区(1]。急性接触、Cd和Pb产生各种毒性作用在几个目标器官系统;然而,大多数人长期暴露在低水平的这些金属的混合物(2,3]。这三种金属/非金属都有个共同的毒性机制,包括氧化应激的生产,与含巯基的组织反应,干扰基本金属。此外,压力提出了蛋白质和抗氧化酶对element-induced毒性提供共同的细胞保护机制,当他们出现在一个单独的基础(4]。此外,这些金属被列入十大危险物质和混合物的建议作为一个交互剖面研究有毒物质与疾病登记处联合机构(有毒物质)。和Cd被归类为致癌物质和Pb作为一个可能的致癌物质由国际癌症研究机构(IARC) (5- - - - - -9]。

Cd,和铅诱导活性氧簇(ROS)的产生,可以破坏DNA,脂质和蛋白质。产生ROS超氧化物的形式( )、单线态氧( ),过氧化氢自由基( ),一氧化氮( )、过氧化氢(H2O2),dimethylarsinic过氧化氢自由基([ ]),dimethylarsinic激进( ][10,11]。Cd ROS生成过氧化物的形式( )、过氧化氢(H2O2)、氢氧自由基( )和脂质自由基( )。此外,Cd治疗会导致更换的铁在一些酶,和积累的铁分子与H反应2O2产生羟基自由基( )[10,11]。Pb ROS-generating机制是由delta-aminolevulinic酸脱水酶(δ-ALAD)抑制,引起的累积delta-aminolevulinic酸(δ阿拉巴马州)。δ阿拉巴马州正迅速氧化生成如超氧化物自由基(O2•−)、羟基自由基( )和过氧化氢(H2O2)[10,12]。

之间的相互作用,Cd,和Pb增强在某些人群患癌症的风险。然而,与这些金属混合物相关联的致癌机制研究很少。提出了许多可能的作用机制:氧化应激诱变、基因毒性,抑制DNA修复、基因表达变化(13]。在这些拟议的机制中,氧化应激通常被观察到在活的有机体内和在体外系统在接触这些金属混合物(4]。然而,一些研究显示,某些-金属相互作用抑制致癌活性(14]。因为人类不断接触到复杂的金属混合物在低剂量,有必要确定机制转换的过程。

细胞转换是致癌的一个特点的活动(15]。有两大类转换系统的基于目标细胞用于测定:二倍体细胞有限在体外寿命(如叙利亚仓鼠胚胎)和不灭的非整倍性细胞系(如BALB / c 3 t3和影响10 t1/2细胞)(16]。最常使用的靶细胞包括BALB / c 3 t3 A31-1-1细胞。致癌作用通常研究的启动和推广BALB / c 3 t3 A31-1-1细胞(16- - - - - -19]。单独的转换能力,Cd,和Pb一直在测试之前这些细胞;既和Cd给予积极回应,而铅不显示变换(16,20.- - - - - -22]。这项工作的目的是评估的改造潜力金属混合物(2 M NaAsO2+ 2 M CdCl2+ 5 M Pb (C2H3O2)2h·32O)有关的流行病学的浓度,类似发现在职业暴露个人23- - - - - -25),因为没有测试这个模型。

在目前的研究中我们对活性氧的作用以及抗氧化障碍发展的氧化应激损伤通过转换过程。这个过程的启动和推广阶段期间检查两步转换模型在BALB / c 3 t3 A31-1-1细胞。金属混合物的改造潜力作为引发剂和/或启动子也被确定。我们发现氧化应激中起着重要的作用在金属混合物和引发的转换是最著名的在推广阶段的细胞转变。

2。材料和方法

2.1。化学物质

钠meta-arsenite (NaAsO2、纯度100%)、氯化镉(CdCl2,纯度99.5%),12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA) n-methyl-n-nitrosoguanidine (MNNG) 6-hydroxy-2, 5, 7, 8-tetramethylchromane-2-carboxylic酸(Trolox),罗丹明123和dihydrorhodamine 123,购买从奥尔德里奇化工有限公司(威斯康星州密尔沃基/美国)。醋酸铅(Pb (C2H3O2)2h·32O,纯度99.9%),insulin-transferrin-selenium-A(一),1,1,3,3-tetraethoxypropane买来j·t·贝克(墨西哥),GIBCO /英杰公司(美国纽约)和丙烯酰胺化学有限公司(美国),分别。

2.2。细胞培养

形态转换实验用BALB / 3 t3 A31-1-1克隆细胞(写明ATCC)。细胞生长在杜尔贝科的修改鹰的最低基本培养基(DMEM)补充10%的边后卫在空气湿润孵化器低于95%和5%的公司2。细胞被亚文化达到融合之前,通常每周两次。额外的媒体推广期间使用转换的分析包括以下阶段:杜尔贝科的修改鹰的最低基本培养基(DMEM)补充2%的边后卫和1%的(10毫克/毫升胰岛素,5.5毫克/毫升转移,和0.0067毫克/毫升亚硒酸钠)。所有媒体都从GIBCO /获得表达载体(美国纽约)。

2.3。转换试验

执行转换分析和轻微的修改(如前所述22]。转换协议包括在25天,分为两个阶段:起始阶段1到7天之间和晋升天7到25之间。镀BALB / c 3 t3 A31细胞的密度5×105每100毫米盘细胞在DMEM培养基补充10%的边后卫。48 h后孵化1天,subconfluent细胞暴露在金属混合物(2 M NaAsO2,2 M CdCl2,5 M Pb (C2H3O2)2h·32O)或MNNG (0.5) g / mL),如发起人。媒体被4个小时后,开始筛选的细胞密度的山肩1×103细胞每60毫米。在第四天,媒体补充治疗和控制。7天,补充了盘子中补充了1%的和2%的边后卫。金属混合物或TPA (0.1 g / mL)然后添加促进剂。这些媒体和治疗用金属混合物或TPA补充在天11和14。天9、16、18和21岁的细胞只受移植者的新媒体DMEM + 1%的+ 2%的边后卫。25天,细胞被固定与乙醇和彩色染色方案(见图1)。检查启动金属的影响,细胞暴露在金属混合物在起始阶段,然后处理TPA在推广阶段。确定促销效果,细胞治疗与MNNG发起者和暴露在金属混合物在推广阶段。此外,金属混合物的影响被研究了引发剂和促进剂刺激。治疗与MNNG发起者和TPA启动子被用作细胞转换(积极的控制18];同时,两人都是单独测试。学习小组将提到发起者/促进剂。起始阶段收集的样本用于分析治疗后1天4小时和7天4天在启动子治疗开始之前(图1)。推广获得的样本在第11天,16日和21(图1)。改变焦点类型III得分根据以下标准,区分这些焦点基于四个形态特征:(1)病灶超过2毫米直径,(2)深嗜碱性染色(3)密集的积层的细胞,细胞和(4)随机取向的边缘焦点(16,18,21,22]。数据分析使用一个优化模型所描述的庞帝et al。26]。评估改造潜力(TP),我们计算转换疫源地类型III每道菜的数量获得了每个实验条件和调整对活细胞的数量在每个采样的一天。


图1
2 2 2 3 2 2 2 2 2 2 3 2 2 2 计划的两阶段转换协议,Balb / c 3 t3细胞。起始阶段,1到7天。第一天,subconfluent细胞培养对待MNNG 0.5克/毫升(正引发剂)或金属混合物(2M NaAsO,2M CdCl,5M Pb (CHO)h·3O)作为引发剂刺激在DMEM培养基补充4 h和受移植者SFB为10%。4天中被改变。推广阶段开始在7天结束25天。在促销阶段,细胞在DMEM培养基培养补充其SFB 2%和1%。天7、11和14个细胞治疗与TPA 0.1克/毫升(积极促进剂)或金属混合物(2M NaAsO,2M CdCl和5M Pb (CHO)h·3O)启动子的刺激。与此同时,在天9日16日18日和21中进行更改。抽样天转换协议由“*”;在这些日子里在不断变化的媒体或应用治疗前采集标本。
2.4。生存能力

细胞生存能力是衡量双萤光素染色diactetate (FDA)方法描述罗哈斯et al。27]。简单地说,这些细胞被包含0.02与荧光染料溶液混合 g / mL溴化乙锭和0.015 FDA g / mL。荧光显微镜下细胞进行分析(奥林巴斯BMX-60 UM61002过滤器);green-stained细胞被确定为住,而红点的细胞被确认为死亡细胞。一百个随机选择的细胞每条件进行评估,结果表示为百分比。

2.5。活性氧(ROS)

dihydrorhodamine 123技术是基于依赖的活性氧(ROS) dihydrorhodamine氧化罗丹明- 123 - 123 (28]。简单地说,100年 L整除的收获样本收集和离心机在1200 rpm 5分钟。上层清液被丢弃,180 L的缓冲区(140毫米氯化钠,氯化钾5毫米,0.8毫米MgSO4CaCl 7 ho 1 8毫米2,5毫米葡萄糖和消息灵通的15毫米)和20 L 123年dihydrorhodamine (1 M)补充道。罗丹明123年形成的吸光度测量在505 nm使用ELISA分光光度计(Bio-Rad模型550)和插值曲线的罗丹明123年清廉的浓度 M。

2.6。脂质过氧化(LPx)

硫代巴比土酸的方法被用来测量浓度的丙二醛(MDA) (29日]。一个100 L整除添加到100年 L(三氯乙酸10% (w / v)和3000×g离心10分钟。当时上层清液加入1毫升的硫代巴比土酸试剂(0.375%)、和混合加热45分钟的92°C。硫代巴比土acid-MDA复杂的吸光度为532 nm使用ELISA分光光度计(Bio-Rad模型550)。数据插值到浓度曲线1,1,3,3-tetraethoxypropane从0到10纳米。

2.7。基因毒性。单细胞凝胶电泳(SCGE)测定

10毫升的细胞悬液细胞(10000 - 15000)是75年混合 L LMP 0.5%琼脂糖溶液(0.36%最终)和加载到显微镜载玻片prelayered 150 L 0.5%的正常熔点琼脂糖。SCGE试验进行的描述织女星et al。30.]。短暂,孵化后裂解缓冲(2.5 M氯化钠,100毫米EDTA, 10毫米三羟甲基氨基甲烷、液pH值,补充10% DMSO溶液和1% Triton x - 100)在4°C至少1 h,幻灯片被放置在一个水平电泳室包含运行缓冲溶液pH值(300毫米氢氧化钠,1毫米EDTA > 13)。幻灯片在10分钟的电泳缓冲允许DNA放松。电泳进行10分钟300毫安和25 V (~ 0.8 V /厘米),和所有的技术措施进行了使用非常昏暗的间接照明。电泳后,幻灯片被轻轻删除和冲洗中和缓冲(0.4米三,pH值7.5)在室温下15分钟。幻灯片和100%乙醇脱水(15分钟),之后他们被风干。溴化乙锭(20 L的0.2 克/毫升溶液)被添加到每个幻灯片,和盖玻片放在凝胶上。单个细胞在20 x放大可视化使用奥林巴斯BX-60与荧光显微镜附件(515 - 560 nm激发过滤器,590纳米吸收滤光片)。图像数字化和分析使用固美v。31日software (Kinetic Imaging), and the Olive tail moment (OTM) parameter was used to evaluate DNA damage (200 cells were scored for each condition).

2.8。过氧化氢酶活性测定

过氧化氢酶活性测定如Aebi所述31日]。简而言之,这些细胞被洗两到三次与无菌PBS含有蛋白酶抑制剂。10个周期的细胞用10秒每20 MHz。声波降解法后,细胞在10000转离心5分钟在4°C。过氧化氢酶活性和蛋白质浓度测定在上层清液。测定过氧化氢酶的活动,100年的吸光度 L 240海里的上层的决心磷酸盐缓冲剂(50毫米)在室温下。后的20毫米H2O2每15秒,吸光度是记录在一段1分钟。如Aebi所述执行数据分析31日]。

2.9。测定超氧化物歧化酶(SOD)活性

超氧化物歧化酶活性测定后,协议提出的太阳et al。32]。这种方法是基于超氧化物歧化酶之间的竞争和四唑蓝超氧化物自由基形成的黄嘌呤氧化酶反应。细胞用离心机在10000转10分钟在4°C。接下来,200年 L的上层清液被分为两个管子含1.85毫升的反应混合(0.1325毫米0.53毫米0.265毫米黄嘌呤,EDTA,电视台,883毫克/毫升白蛋白,353毫米Na2有限公司3)。50毫升的50 mM磷酸盐缓冲剂(空白)被添加到一个管,和50 L的黄嘌呤氧化酶(2 - 2.5 U /毫升)被添加到其他管。管是孵化15分钟,然后500年 L的CuCl2的解决方案是添加到停止反应。二百毫升的反应混合物加入96孔酶标,和吸光度测量在560海里。SOD的单位计算如下: SOD的定义是单位所需的酶量减少50%的吸光度。

2.10。总抗氧化能力(TAC)

总抗氧化能力测定如Erel所述33与修改)。这种方法是基于abt的减少•+激进。abt•+是由一个初始孵化与过氧化氢在酸性介质(abt的最终浓度•+:10毫米)。接下来,5 L的样本是200年混合 L试剂1 (0.4 M醋酸缓冲;ph值5.8)96孔板。20毫升的abt试剂2(30毫米•+在醋酸缓冲;pH值3.6)被添加到混合,混合和吸光度是读R1和R2(空白)。最后一个吸光度阅读得到的最后5分钟在740 nm潜伏期。反应速率是校准和插值曲线Trolox吸光度(0 - 100 米)。TAC测量试验结果Trolox当量/ L。

3所示。结果

3.1。在体外细胞转化

的改造潜力金属混合物(2 M NaAsO2,2 M CdCl2和5 M Pb (C2H3O2)2h·32O)确定基于端点测试使用的数量疫源地每板染色试验在25天,调整与存活细胞的数量在每一个采样每一天的状态。在这种分析我们提出转变潜在跨起始(表(TP)数据1(表)和推广阶段2对所有实验条件)。金属混合物表现出高度的改变可能在启动和推广阶段的转换。准时在表1、金属混合物作为引发剂刺激是独特的实验条件,清楚地显示了积极的TP除了积极控制,MNNG / TPA(引发剂/促进剂),而金属混合物作为促进剂和金属/金属展示在第七天TP具有统计学意义。然而通过推广阶段(表2),TP阳性所有实验条件是最大的在11天的转变过程。在促销阶段,金属混合物作为引发剂治疗减少TP,而金属混合物作为发起人或引发剂和促进剂增加TP,显示一个添加剂的行为。此外,金属混合物的影响高于观察的积极控制(MNNG / TPA);同时,无论是MNNG还是TPA显示转换能力(数据未显示)。
起始阶段
一天 治疗一个 生存能力(%)b 菜与焦点/菜得分c 不。改变焦点/菜 TPd
1 控制 100±5.5 4/6 1.8±0.05 1±0.27
MNNG + TPA 96±4.8 6/6 62.25±9.9 * * * 35.37±5.6 * * *
金属混合物+ TPA 100±1.7 6/6 33.75±11.6 * * * 18.41±6.3 * * *
MNNG +金属混合物 96±4.8 6/6 23±7.7 * * * 2.61±0.88
金属混合物+金属混合物 100±1.7 6/6 29.5±5.7 * * * 3.22±0.62
4 控制 100±0.0 4/6 1.8±0.05 1±0.27
MNNG + TPA 89±5.8 6/6 62.25±9.9 * * * 22.7±3.6 * * *
金属混合物+ TPA 89±9.1 6/6 33.75±11.6 * * * 12.4±4.2 * * *
MNNG +金属混合物 89±5.8 6/6 23±7.7 * * * 3.2±1.1
金属混合物+金属混合物 89±9.1 6/6 29.5±5.7 * * * 1.9±0.4
7 控制 100±0.25 4/6 1.8±0.05 1±0.27
MNNG + TPA 83±2.8 * * 6/6 62.25±9.9 * * * 83.5±13.4 * * *
金属混合物+ TPA 93±0.12 * * 6/6 33.75±11.6 * * * 66.5±22.8 * * *
MNNG +金属混合物 83±2.8 * * 6/6 23±7.7 * * * 6.2±2.1 *
金属混合物+金属混合物 93±0.12 * * 6/6 29.5±5.7 * * * 9.4±1.8 *
一个治疗增加了MNNG 0.5)的浓度 0.1 g / mL, TPA g / mL,和金属混合物(如2所示 M, Cd 2 5 M, Pb 米);b对比例控制;c两个实验有三个生物复制;d改造潜力(TP)计算数量的转换焦点类型III每道菜/存活细胞在相应的抽样的一天。统计分析,学生的t以及 * * *值< 0.05,< 0.01,* * * < 0.001。
表1
改变可能通过起始阶段。
推广阶段
一天 治疗一个 生存能力(%)b 菜与焦点/菜得分c 不。改变焦点/菜 TPd
11 控制 100±0.5 4/6 1.8±0.05 1±0.27
MNNG + TPA 77±19.1 * 6/6 62.25±9.9 * * * 61.6±9.8 * * *
金属混合物+ TPA 57±15.8 * 6/6 33.75±11.6 * * * 62±21.3 * * *
MNNG +元混合物 9±0.66 * * * 6/6 23±7.7 * * * 70.5±23.8 * * *
金属混合物+金属混合物 17±0.3 * * * 6/6 29.5±5.7 * * * 78.5±15.1 * * *
16 控制 100±0.0 4/6 1.8±0.05 1±0.27
MNNG + TPA 100±11.5 6/6 62.25±9.9 * * * 67.9±10.8 * * *
金属混合物+ TPA 100±18.5 6/6 33.75±11.6 * * * 25.1±8.6 * * *
MNNG +金属混合物 31日±8.9 * * 6/6 23±7.7 * * * 38.5±13 * * *
金属混合物+金属混合物 30±8 * * * 6/6 29.5±5.7 * * * 55.2±10.6 * * *
21 控制 100±0.0 4/6 1.8±0.05 1±0.27
MNNG + TPA 77±0.5 * * * 6/6 62.25±9.9 * * * 42.6±6.8 * * *
金属混合物+ TPA 88±2.2 * * 6/6 33.75±11.6 * * * 11.7±4 *
MNNG +金属混合物 76±0.05 * * * 6/6 23±7.7 * * * 13.6±4.6 *
金属混合物+金属混合物 31日±6.9 * * * 6/6 29.5±5.7 * * * 50.5±9.7 * * *
一个治疗增加了MNNG 0.5)的浓度 0.1 g / mL, TPA g / mL,和金属混合物(如2所示 M, Cd 2 5 M, Pb 米);b对比例控制;c两个实验有三个生物复制;d改造潜力(TP)计算每道菜nmber转换疫源地类型III /存活细胞相应的抽样的一天。统计分析,学生的t以及 * * *值< 0.05,< 0.01和* * * < 0.001。
表2
改变可能通过促进阶段。
3.2。影响金属混合物的起始阶段

化学致癌作用是一个多步骤的过程,包括细胞形态转化,致癌的潜在风险衡量在启动和推广阶段(20.,34]。我们确定金属混合物的机制影响氧化应激在起始阶段使用天样本1、4、7(数字2和3)。


图2
2 2 2 3 2 2 2 t 影响金属混合物通过转换过程的起始阶段,氧化损伤标记。Balb / c 3 t3细胞暴露在发起者刺激,金属混合物(2M NaAsO,2M CdCl,5M Pb (CHO)h·3O)或MNNG(积极的引发剂),在第一天。量是1天,4小时后引发剂接触,前4天至7天改变介质。数据代表的意思是3个人实验由一式三份。我们评估的生成活性氧(ROS)使用dihydrorhodamine - 123氧化。脂质过氧化(LPx)评估使用硫代巴比土酸的方法,使用碱性彗星试验和基因毒性的决心。方差分析和学生的以及;*与控制酒吧。

图3
2 2 2 3 2 2 2 t 影响金属混合物通过转换过程的起始阶段,抗氧化活性标记。Balb / c 3 t3细胞暴露在引发剂刺激,金属混合物(2M NaAsO,2M CdCl,5M Pb (CHO)h·3O)或MNNG(积极的引发剂),在第一天。量是1天,4小时后引发剂接触,前4天至7天改变介质。数据代表的意思是3个人实验由一式三份。抗氧化活性被表示为一个百分比值对控制。超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶活动进行评估使用分光光度分析,和总抗氧化能力(TAC)评估的abt°+激进的方法(方差分析和学生的以及;*,**,***与控制酒吧)。

ROS生成是积极对待MNNG第四天的样品。脂质过氧化作用和基因毒性观察治疗后的金属混合四个小时1天。基因毒性也诱导4天,但是脂质过氧化作用和基因毒性观察7天(图2)。

治疗后与金属混合物,过氧化氢酶和总抗氧化能力激活在第一天(图发现了3)。这些结果表明,细胞经历了转型相伴生存能力下降(表1)。Treatment-induced氧化应激抑制了细胞抗氧化反应。

3.3。影响金属混合物的推广阶段的转换

推广阶段的细胞转换后发生慢性暴露于启动子代理。BALB / C 3 t3细胞可以作为一个模型转换协议(这个效果的35]。金属混合物氧化应激的影响在这个阶段测量在第11天,16日和21日(数字4和5)。


图4
2 2 2 3 2 2 2 t 影响金属混合物(2M NaAsO,2M CdCl,5M Pb (CHO)h·3O)通过促进阶段的转换过程,氧化损伤标记。Balb / c 3 t3细胞暴露4小时引发剂刺激,金属混合物或MNNG(积极的引发剂),在第一天和启动子刺激,金属混合物或TPA(积极的促进剂),天7、11和14。采样是在第11天,16日和21的转换协议监控提升的阶段。数据代表的意思是3个人实验由一式三份。我们评估的生成活性氧(ROS)使用dihydrorhodamine - 123氧化。脂质过氧化(LPx)评估使用硫代巴比土酸的方法,使用碱性彗星试验和基因毒性的决心。方差分析和学生的以及;*,***与控制酒吧。

图5
2 2 2 3 2 2 2 t 影响金属混合物(2M NaAsO,2M CdCl,5M Pb (CHO)h·3O)通过促进阶段的转换过程,抗氧化活性标记。Balb / c 3 t3细胞暴露4小时引发剂刺激,金属混合物或MNNG(积极的引发剂),在第一天和启动子刺激,金属混合物或TPA(积极的促进剂),天7、11和14。采样是在第11天,16日和21的转换协议监控提升的阶段。数据代表的意思是3个人实验由一式三份。抗氧化活性被表示为一个百分比值对控制。超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶活动进行评估使用分光光度分析,和总抗氧化能力(TAC)评估的abt°+激进的方法(方差分析和学生的以及;*,**,***与控制酒吧)。

在所有的治疗,我们观察到一个戏剧性的减少细胞的生存能力在11天(表2)。然而,仅仅16天,细胞处理金属混合物/ TPA(引发剂/促进剂)演示了恢复控制的水平。11天,改造潜力决定每治疗引起的类似的积极控制。然而,随着时间的推移这种效应降低。21天,诱导启动子的金属混合物治疗转换到类似于TPA子治疗(表2)。

氧化应激是决定基于测量活性氧的水平,脂质过氧化作用和基因毒性。这些参数是高度增加治疗后与金属混合物在推广阶段16天。然而,只有ROS生成检测每治疗(图11天4)。

抗氧化活性是由测量过氧化氢酶和超氧化物歧化酶(SOD)活动以及TAC。这些活动是高度增加16天,但只有过氧化氢酶活性增加与金属混合物治疗后11天/ TPA和MNNG /金属混合物(图)5)。在促销阶段,我们观察到一个大仰角在氧化应激标记(16天),导致细胞生存能力下降(表21天2)。这些结果表明克隆选择过程的细胞抵抗氧化应激的能力。

3.4。皮尔森相关分析和多变量分析

确定在转换过程氧化应激的影响,我们进行了统计分析,评估治疗的效果与金属混合物在启动和推广阶段。表3显示了氧化标记和抗氧化反应标记物之间的关系;然而,只有ROS和细胞生存能力与转化的潜力。我们继续学习使用多元分析与多元线性回归关系。每个变量的模型得到;然而,改造潜力预测只有细胞生存能力和ROS感应(表4)。这些结果表明,活性氧的影响转换和可行性通过氧化应激的产生和具有挑战性的抗氧化反应。
皮尔森的相关性
相关系数( )		 ROS LPx 基因毒性 SOD活性 过氧化氢酶活性 TAC 生存能力
TP一个 0.436 * 0.071 −0.046 0.216 0.219 0.155 −0.753 * *
ROSb 0.730 * * 0.209 0.754 * * 0.881 * * * 0.835 * * * −0.539 *
LPxc 0.453 * 0.909 * * * 0.833 * * * 0.873 * * * −0.282
基因毒性 0.582 * 0.445 * 0.149 −0.001
草皮d活动 0.848 * * * 0.805 * * * −0.439 *
过氧化氢酶活性 0.782 * * * −0.429
TACe −0.398
值表示相关系数( ), 值* ,* * ,* * * 。一个TP:改造潜力;bROS:活性氧;cLPx:脂质过氧化;dSOD:超氧化物歧化酶;eTAC:总抗氧化能力。
表3
皮尔森的氧化与抗氧化之间的关联标记影响改变潜在的(TP)。
多元线性回归 系数 标准错误 价值 VIF一个
ROSb 0.183 0.076 0.037 8.545 *
LPxc 0.023 0.034 0.506 12.405
基因毒性 −0.006 0.096 0.948 3.346
草皮d活动 0.008 0.096 0.934 12.940
过氧化氢酶活性 −0.112 0.068 0.132 8.732
TACe −0.028 0.018 0.149 10.827
生存能力 −0.373 0.123 0.013 1.926 *
一个VIF:方差膨胀因子;bROS:活性氧;cLPx:脂质过氧化;dSOD:超氧化物歧化酶;eTAC:总抗氧化能力。* 。
表4
多变量分析与转化潜在相关的标记(TP)。
3.5。NAC对转化的影响诱导的金属混合物;测定细胞生存能力、转化能力和脂质过氧化作用

N-Acetyl-cysteine (NAC)是一种半胱氨酸捐助者促进谷胱甘肽(GSH)的减少。南汽在螯合疗法作为一种抗氧化剂金属解毒。根据这些特点,我们进行了metals-NAC cotreatment试图阻止metal-mixture-induced氧化应激和转换(36]。我们与10毫米NAC coexposed细胞和金属混合物(2 M NaAsO2,2 M CdCl2和5 M Pb (C2H3O2)2h·32O)转换协议。

我们确定了NAC对细胞活力的影响和lipidperoxidation 16天的协议,因为这时间点引起最大的诱导氧化应激。观察细胞生存能力的丧失后NAC cotreatment引发剂刺激和TPA促进剂治疗。然而,生存能力复苏中观察到南京cotreatment启动子的刺激;这些效果是类似的控件(图确定6)。


图6
N 2 2 2 3 2 2 2 t 的影响-acetyl-cysteine (NAC) metal-mixture-induced转换、细胞生存能力的决心。细胞与10毫米NAC cotreated金属混合物(2M NaAsO,2M CdCl,5M Pb (CHO)h·3O);样本收集了16天。数据代表三个独立实验的意思是一式三份。细胞生存能力提出了对控制比例值,由代谢双重染色。方差分析和学生的以及*,***。

引发剂刺激,NAC cotreatment并不影响脂质过氧化;然而,这些治疗方法作为启动子刺激废除metal-mixture-induced脂质过氧化在推广阶段(图8)。

转换是由测量病灶数量每道菜25天(图7)。NAC cotreatment减少转换当管理作为引发剂,而NAC cotreatment废除metal-mixture-induced转换作为促进剂治疗。南汽cotreatment引发剂和促进剂中间效果;它减少了转换焦点(图的数量7)。这些结果表明,氧化应激会极大地影响推广阶段而不是启动阶段;因此,non-oxidation-stress机制必须是在起始阶段观察到的影响。


图7
N 2 2 2 3 2 2 2 t 的影响-acetyl-cysteine (NAC) metal-mixture-induced变换,变换焦点每道菜的数量。细胞与10毫米NAC cotreated金属混合物(2M NaAsO,2M CdCl,5M Pb (CHO)h·3O);样本收集了25天。数据代表三个独立实验的意思是一式三份。转换提出了褶皱的变化对控制的价值观。这个值对应于焦点的数量/盘在实验条件控制的焦点/盘数量样品。结果提出了关于控制的比例值。方差分析和学生的以及*,**,***。

图8
N 2 2 2 3 2 2 2 t 的影响-acetyl-cysteine (NAC) metal-mixture-induced变换,脂质过氧化作用。细胞与10毫米NAC cotreated金属混合物(2M NaAsO,2M CdCl,5M Pb (CHO)h·3O);样本收集了16天。数据代表三个独立实验的意思是一式三份。LPx测量作为氧化应激标记。结果提出了关于控制的比例值,由硫代巴比土酸方法(方差分析和学生的测试* *,***)。

4所示。讨论

许多金属在环境中发现被归类为致癌物质(7- - - - - -9]。这些金属是常见的急性接触;然而,在冶炼厂和回收电池行业,人们就会受到长期NaAsO金属混合物2,CdCl2和Pb (C2H3O2)2h·32啊,有这样的接触作为我们的特别感兴趣(1,23- - - - - -25]。几项研究已经找到一个交互执行概要的混合物表明致癌过程中添加剂相互作用[5,6]。在体外细胞转换化验显示一个相对较高的相关性致癌性生物分析;最通行的模型是Balb / c 3 t3细胞,我们可以评估引发剂和促进剂物质转换过程(26]。因为细胞转换是一个事件与此相关的致癌能力,我们评估是否2的金属混合物 M NaAsO2,2 M CdCl2,5 M Pb (C2H3O2)2h·32O可以变换Balb / c 3 t3细胞。这些细胞最近提到好的模型研究混合物(37]。我们评估的影响混合物作为引发剂,促进剂,并确定转换过程中氧化应激的作用。我们的研究结果表明,金属混合物(2 M NaAsO2,2 M CdCl2,5 M Pb (C2H3O2)2h·32产生转换作为引发剂和促进剂(O)表1和2),因为其他研究表明,单一暴露在这些金属不产生转换在同一浓度镉除外。看来,混合增强形态转换在这个模型(16,21,22,38]。与此同时,关于改变的潜力,这是一个衡量能力的细胞产生焦点,我们发现一个强大的效果,当金属混合物和启动子多启动程序管理,指出这个特殊的混合物在致癌过程的相关性。镉、另一方面,提出了子模型中,几位作者21,25,26,34,39- - - - - -42]。这是同意这个想法,金属致癌可能更相关的促销效果而不是启动效应。

的主要影响变量变换是活性氧簇(ROS)的产生和细胞生存能力的丧失;这些数据支持克隆选择理论(10)(表3和4,数据6和7)。我们统计分析ROS的贡献,lipoperoxidation基因毒性,SOD活性,过氧化氢酶活性,TAC和可行性改造潜力在启动和推广阶段。然而,只有ROS生成和损失的细胞生存能力与变换显著相关(表3和4)。我们总结在图的观测现象9;我们表明,氧化损伤引起大分子在起始阶段(图2细胞生存能力(表中)没有变化1)。考虑到DNA损伤发生在第一天的起始过程(图2),我们表明,DNA修复系统可能已经受损的金属混合物治疗,除了观察到的基因毒性;这些影响被观察到在其他研究[43- - - - - -46]。在促销阶段,转化细胞的克隆选择显然是观察,就是明证增加氧化应激标记(ROS生成),诱导抗氧化反应,细胞生存能力在16天(数据的损失2- - - - - -5、表2)。细胞各种优势幸存下来,比如那些有很高的抗氧化能力(图5)。这些数据同意报道结果Salnikow et al。47),确定nickel-transformed Balb / c 3 t3细胞展示较高的抗氧化能力比是非Balb / c 3 t3细胞(47]。此外,肿瘤细胞具有抗氧化能力升高(48,49]。目前的结果表明,氧化应激参与metal-mixture-induced转换,因为高浓度的氧化标记观察在两个阶段,而这些影响诱导转化细胞的克隆选择。来证实这些结果,cotreatment金属混合物(2 M NaAsO2,2 M CdCl2和5 M Pb (C2H3O2)2h·32O)和执行NAC(数字6- - - - - -9)。这种治疗废除时观察到的改变影响了作为促进剂治疗。然而,治疗的效果是减少时表现引发剂刺激或两者兼而有之。这些结果表明,不同的机制可能构成金属混合物的影响开始转换期间,这种机制可能涉及DNA损伤、DNA修复改变或调节基因的表达。然而,在推广阶段,诱导的氧化应激中扮演一个重要的和决定性的作用在metal-mixture-induced细胞转变。我们的研究结果表明,氧化应激诱导的金属混合物(2 M NaAsO2,2 M CdCl2和5 M Pb (C2H3O2)2h·32O)在Balb / c 3 t3细胞导致克隆选择。


图9
2 2 2 3 2 2 2 计划的金属混合物在Balb c / 3 t3转换过程。我们表明,损伤大分子(脂质和DNA)发生起始阶段的第一天,没有细胞生存能力的变化,表明DNA修复系统可能已经受损的金属混合物治疗(2M NaAsO,2M CdCl,5M Pb (CHO)h·3O),除了观察到的基因毒性。在促销阶段,转化细胞的克隆选择显然是观察,就是明证增加氧化应激标记,诱导抗氧化剂反应,以及细胞生存能力的损失。细胞与各种优势幸存下来,比如具有较高的抗氧化能力,直到焦点的形成。

承认

美国的。马丁是收件人的奖学金Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologia (CONACyT)。

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