文摘
目前的调查是针对研究的可能chemoprotective活动口头管理槲皮素对topotecan-induced表示细胞和基因毒性对小鼠体细胞在活的有机体内。DNA链断裂、微核的形成和有丝分裂活动在当前的研究中进行标记表示细胞和基因毒性。氧化应激标志物如细胞内活性氧生成、脂质过氧化,减少和氧化谷胱甘肽在骨髓评估这一改进可能的机制。槲皮素在小鼠的细胞毒性和基因毒性剂量测试。预处理的老鼠与槲皮素显著降低topotecan-induced基因毒性和细胞毒性的骨髓细胞,而这些影响是剂量依赖。此外,前政府的槲皮素topotecan挑战前改善氧化应激标记。总之,槲皮素具有保护作用的减排topotecan-induced表示细胞和基因毒性小鼠的骨髓细胞中驻留,至少在某种程度上,对其抗氧化效果。根据提供的数据,可以开发策略减少topotecan-induced骨髓抑制和继发性恶性肿瘤癌症患者和医务人员topotecan暴露。
1。介绍
喜树碱,五环的生物碱原本孤立的从中国工厂Camptotheca acuminata 1996年由墙和万尼(1),是一种最重要的铅化合物在抗癌研究。喜树碱的抗癌活动被认为是由于其稳定可逆共价DNA拓扑异构酶的能力我复杂2,3),防止破损的降级一步/重新加入反应的酶。最终结果的药物会导致分裂染色体DNA,细胞死亡,广泛的姐妹染色单体交换和染色体畸变(4,5]。说明特定的目标和机制的喜树碱激发了密集的努力识别小说类似物的缺点,克服自然喜树碱分子,其中包括低水溶性;严重的和不可预测的毒性,包括出血性膀胱炎;药物相互作用的可逆性;内酯不稳定;耐药性。最初的一个主要策略在这方面已经改善自然喜树碱的溶解性化学改性(6]。这种方法产生了不同的水溶性系列类似物或水溶性高活性化合物,其中topotecan (TPT)和伊立替康是最成功的。
两个喜树碱类似物,TPT和伊立替康,已经获得FDA批准的临床治疗卵巢癌、小细胞肺癌(7,8和耐火结肠直肠癌9,10),分别。研究主要集中在这两个药物已经证明了机械之间的差异与细胞毒性强度和DNA-topoisomerase我劈得开的复合物的稳定性11]。因此,这个微分作用可能影响不仅在复制形成链断裂,细胞死亡的可能性和遗传毒性的这些新的抗癌药物。的确,这些药物的治疗效果有限,由于获得性耐药的肿瘤细胞的发展和各种副作用的治疗病人,包括正常细胞的损害可能会导致二次肿瘤的发展。后应用拓扑异构酶抑制剂,对DNA损伤可能导致DNA碎片,染色体断裂和微核(MN)的形成导致基因毒性和可能导致致癌作用。在动物身上,TPT是体细胞诱变剂能够诱导染色体畸变(12]。后续研究的患者接受了喜树碱包含方案显示超二倍性的发生率增加和删除的染色体1 (13]。这些影响可以对这些药物产生抗药性或可能导致二次肿瘤的发展。这些促使这些高效的去除代理一些治疗方案。
在临床治疗,提高药物疗效和减少不良反应的抗肿瘤药物,需要结合其他药物(14]。实验观察表明,一些类黄酮可以增强化疗药物的细胞毒性作用在不损害正常细胞(15]。与这些观念相一致,槲皮素、多酚化合物广泛分布于植物来源的食物,据报道有抗肿瘤作用对几位癌症细胞16,17]。槲皮素的抗肿瘤作用已报告诱导细胞生长抑制和凋亡在多种肿瘤细胞18]。槲皮素也被证明在体外增加DNA拓扑异构酶II抑制剂的浓度,阿霉素,和道诺霉素耐多药癌症细胞系(19]。此外,先前的报道表明,槲皮素增加TPT的生长抑制作用在人类乳腺癌细胞的治疗20.]。改进的口服生物利用度,减少胃肠道毒性伊立替康的槲皮素也报告(21]。因此,喜树碱的组合与槲皮素可能是治疗的好处。然而,槲皮素的影响在TPT-induced表示细胞和基因毒性nontumor细胞在活的有机体内还没有被报道。
考虑课程的广泛使用在临床肿瘤学和槲皮素的能力改善治疗结果从TPT提示研究槲皮素结合TPT能否改善TPT-induced表示细胞和基因毒性小鼠正常组织。骨髓DNA链断裂,MN的得分,和有丝分裂活动在当前的研究中进行标记表示细胞和基因毒性。氧化应激标志物如骨髓活性氧(ROS),脂质过氧化,减少谷胱甘肽(GSH)和氧化谷胱甘肽(GSSG)水平评估作为一个可能的机制改进。
2。结果
2.1。槲皮素对TPT-Induced DNA链断裂
碱性彗星试验的结果如表所示1。槲皮素治疗没有表现出显著差异水平的尾巴,尾巴长,尾巴DNA,和橄榄尾巴时刻相比,溶剂控制剂量测试。积极控制环磷酰胺显著增加所有测量参数的水平比对照组()。结果显示,TPT当在单一剂量的0.5或1毫克/公斤导致显著增加的所有测量参数与溶剂对照组相比。然而,当预处理不同剂量的槲皮素被TPT治疗之前,下降率观察DNA链断裂和更高剂量的槲皮素更有效的减少所有测量参数。
2.2。槲皮素对TPT-Induced MNPCE和骨髓抑制
微核测试的结果展示在表2。的频率MNPCE积极控制诱变剂环磷酰胺相比明显高于溶剂对照组()。同样,TPT的单剂量0.5或1毫克/公斤的频率显著增加MNPCE ()。此外,有丝分裂指数明显下降,治疗TPT与溶剂对照组相比。槲皮素治疗没有表现出显著差异的频率相比MNPCE溶剂剂量控制在两个测试。此外,槲皮素不的骨髓细胞毒性测试剂量水平。预处理与槲皮素被发现显著减少MNPCE的频率特别高剂量的槲皮素治疗后获得的值相比TPT孤单。减少引起的细胞有丝分裂指数TPT被发现恢复预处理与高剂量的槲皮素。
2.3。槲皮素对TPT-Induced氧化应激的影响
槲皮素在TPT-induced氧化应激的影响被测量评估骨髓活性氧积累,MDA含量、谷胱甘肽,GSSG水平。骨髓ROS生产被确定DCF的荧光强度评估。如图1,DCF荧光水平治疗后变化不显著的老鼠与槲皮素在100毫克/公斤比溶剂控制。老鼠的DCF荧光水平处理1毫克/公斤TPT显著增加了约1.7倍,而控制动物()。然而,TPT-induced DCF荧光深刻地废除了槲皮素的生产和减少水平显著不同的荧光光纤动物TPT单独处理()。
如图2MDA含量无显著变化,观察槲皮素治疗后骨髓细胞的剂量100毫克/公斤比控制。MDA含量小鼠治疗课程的显著增加(1毫克/公斤的)。TPT-induced MDA形成废除了槲皮素和降低MDA的水平明显不同的水平仅在TPT治疗()。如图3、骨髓GSSG和谷胱甘肽水平没有任何明显的变化在100毫克/公斤quercetin-treated动物相比,溶剂控制。谷胱甘肽水平在1毫克/公斤TPT-treated动物明显减少,加上增加GSSG水平与对照组相比();谷胱甘肽(GSSG率显著降低,表明氧化应激增加()(图4)。动物用槲皮素预处理有显著提高谷胱甘肽水平在1毫克/公斤TPT-treated集团和增加的水平显著不同的谷胱甘肽水平仅TPT-treated ()。GSSG水平也显著减少了槲皮素预防动物相比TPT-treated集团()。因此,GSH / GSSG比率增加槲皮素的动物和预处理是TPT-treated小鼠相比具有统计学意义()。
3所示。讨论
目前调查的目的是确定是否无毒剂量的生物类黄酮槲皮素,一个强大的抗氧化剂存在于人类的饮食,影响表示细胞和基因毒性抗癌topoisomerase-I抑制剂诱导的课程,对小鼠骨髓细胞在活的有机体内。积极控制诱变剂环磷酰胺在这项研究中,使用这种化合物产生预期的反应。环磷酰胺的结果在同一范围的早期研究[22,23]。这些数据证实了敏感性试验协议之后的检测DNA的破坏性影响。目前的研究表明,槲皮素是细胞毒性和基因毒性剂量测试。此外,它可以保护小鼠骨髓细胞免受TPT-induced表示细胞和基因毒性。这些结果证实了先前的研究,口服的槲皮素并没有导致DNA损伤骨髓细胞(24- - - - - -26]。
得出结论,TPT是体细胞毒性、基因毒性。它诱导剂量和时间增加的百分比MNPCE和治疗后小鼠骨髓染色体畸变TPT的单剂(12]。着丝粒标签(鱼化验pancentromeric小DNA探针)显示,大约48%的TPT-induced MN着丝粒比较消极,证明TPT诱发不仅染色体丢失,而且DNA链断裂(27]。aneugenic(染色体丢失)和致染色体断裂的(DNA链断裂)潜在的药物会导致二次肿瘤的发展和生殖异常的结果。
同意上面所引的报告,目前的实验表明,暴露在TPT导致显著增加骨髓DNA链断裂和MN频率比与溶剂处理后获得的值控制。之前政府的槲皮素之前,TPT挑战改善这些基因毒性标记和清楚地表明槲皮素对TPT的基因毒性的保护作用潜力。不会保护也直接与有丝分裂活动作为一个明显的保护提到了槲皮素预防动物骨髓抑制检查时在间期阶段,,减少TPT-induced myelosuppression老鼠用槲皮素预处理被观察到。此外,所提供的保护,槲皮素表明,槲皮素可以发挥anti-cytogenotoxic存在剂量依赖的相关性影响。事实上,槲皮素的能力带来显著的保护不同的有毒的化学制剂被描述。槲皮素介导的抑制细菌引起的诱变不同诱变剂(28,29日由化学治疗剂]和鼠标clastogenicity诱导;顺铂已报道(26]。
槲皮素的确切机制防止TPT-induced表示细胞和骨髓细胞基因毒性不是众所周知的。保护一个可能的解释表示细胞和基因毒性,同时用槲皮素治疗产生的自由基将允许拦截TPT之前达到DNA和诱导表示细胞和基因毒性。在目前的工作,以评估是否观察anti-cytogenotoxic效应是由于一个增强课程产生的自由基的清除,氧化应激标志物如活性氧积累,脂质过氧化作用,以及谷胱甘肽(GSSG比率进行评估与TPT动物治疗后,与之前相比治疗与槲皮素和溶剂控制动物。目前的研究表明槲皮素预处理降低了TPT-induced骨髓活性氧积累脂质过氧化,预防减少谷胱甘肽(GSSG比率显著。
TPT能够产生活性氧,导致细胞基因组和细胞膜损伤导致脂质过氧化(30.,31日]。脂质过氧化的终端产品也与DNA相互作用导致DNA链断裂,进而发展成染色体断裂。这些染色体断裂可能表现为MN在第一个细胞分裂后的子细胞。同意上面所引的报告,目前的实验表明,TPT处理显著增加了活性氧和脂质过氧化水平和槲皮素预处理降低了TPT-induced ROS和脂质过氧化作用显著。槲皮素被认为是一种有效的自由基清除剂,能抑制脂质过氧化作用在体外和在活的有机体内系统(25,26,32]。
据报道,TPT诱发减少健康兔肝脏抗氧化酶活动(30.,31日]。这可以诱发表示细胞和基因毒性通过抗氧化防御机制的失败,因为抗氧化剂能够保护作为前提下antigenotoxins nontumor细胞抗肿瘤的效果。增加谷胱甘肽,谷胱甘肽(GSSG水平表明保护通过调制槲皮素可能是介导细胞抗氧化水平。这些观察结果证实早期研究槲皮素的报道提高谷胱甘肽,谷胱甘肽peroxidise和超氧化物歧化酶和减少脂质过氧化反应24- - - - - -26]。骨髓减少谷胱甘肽(GSSG比指出TPT-treatment后可能导致更少的保护机制在骨髓细胞,从而开发更多TPT诱导骨髓毒性。然而,组老鼠用槲皮素预处理显示下降表示细胞和基因毒性效果和显著增加骨髓中谷胱甘肽(GSSG比率表明谷胱甘肽的明确的意义。它可以保护细胞谷胱甘肽水平的升高对TPT-induced表示细胞和基因毒性。
综上所述,本研究的一个临界点的可能性可能有治疗窗口TPT结合槲皮素的使用,使其在正常细胞有害的副作用最小化。TPT的有害影响,至少部分介导的氧化应激机制,可以预防或减少激进的食腐动物。TPT对DNA拓扑异构酶我有直接影响,其抗肿瘤活性的一个重要组成部分,这将改变任何改变氧化还原反应的操作。改善骨髓细胞有丝分裂活动的动物用槲皮素预处理TPT毒性可能关注槲皮素的有益作用来克服癌症化疗的一个最严重的问题,这是骨髓抑制和相关的免疫抑制。槲皮素是有效地减少表示细胞和基因毒性TPT诱导的骨髓细胞和可能减少二次肿瘤的风险没有最初的肿瘤细胞。槲皮素的保护作用可能是可能归因于其游离基清除剂效应调制引起TPT的更改。根据本文提供的数据、策略可以减少开发的有害影响TPT利用槲皮素在正常细胞。
4所示。材料和方法
4.1。动物
成年男性瑞士白化小鼠体重25 - 30 g(10 - 12周)从实验动物保健中心,药学院,沙特国王大学。动物保持在标准条件下的湿度、温度(25±2°C),光(12 h光明/黑暗12 h)。他们用一个标准的小鼠粒饮食和可以免费获得水。所有实验动物进行了根据动物保健和使用委员会的指导方针在药学院,沙特国王大学。
4.2。药物和化学物质
槲皮素(美国圣路易斯西格玛化工有限公司)是由填喂法在丙二醇作为车辆。强饲法政府是24小时和1 h TPT腹腔内注射前。控制动物被给予丙二醇车辆。槲皮素在剂量水平的50和100毫克/公斤。转换后动物的剂量相当于人类剂量,剂量为100毫克/公斤槲皮素在小鼠体内被发现在人类对应8.1毫克/公斤。因此,平均体重60千克,需要486毫克槲皮素。国家饮食记录的群体评估槲皮素的摄入量的饮食习惯表示每日的槲皮素水平高达200 - 500毫克可以达到高端消费者的水果和蔬菜,特别是在这种情况下,个人消费的皮部分就是水果和蔬菜,比如西红柿,苹果,和洋葱33]。课程和环磷酰胺(美国圣路易斯Sigma-Aldrich)溶解在盐水立即使用前。TPT的剂量(0.5和1毫克/公斤)的基础上,选择文献数据(12,27]。所有其他化学物质都是最好的分析级。
4.3。试验协议
雄性小鼠适应了2天,分为10组组成的5小鼠,建立如下:组1:小鼠作为对照组和治疗日常车辆连续两天;组2和3:老鼠与槲皮素治疗剂量的50或100毫克/公斤,分别一天一次,连续两天;第四组:老鼠注射一剂0.5毫克/公斤TPT孤独;组5和6:老鼠用槲皮素治疗的剂量50或100毫克/公斤/天,分别一天一次,连续两天,0.5毫克/公斤TPT的管理2天,1小时后槲皮素暴露;集团7:老鼠注射一剂1毫克/公斤TPT单独;组8和9:老鼠用槲皮素治疗的剂量50或100毫克/公斤/天,分别一天一次,连续两天,1毫克/公斤的课程是管理2天,1小时后正常槲皮素暴露;集团10:老鼠注射一剂40毫克/公斤环磷酰胺和用作积极控制诱变剂。
4.4。检测的DNA链断裂
老鼠被颈椎脱位牺牲后24 h TPT治疗,和从一个股骨骨髓细胞收集。单引号和双DNA链断裂研究了碱性单细胞凝胶电泳(彗星碱性测定)据泰斯的指导方针等。34),用细微的修改(如前所述23]。幻灯片和溴化乙锭染色(20μg / mL)和研究使用荧光显微镜(日本尼康)配备合适的过滤器。五十个单个细胞被选为每个计算分析;所有实验进行了至少三次,每个都有两个平行的每个数据点的幻灯片。单个细胞分析与TriTek CometScore(图1.5版本软件5)。参数研究访问DNA损伤的尾巴(任意单元),尾部DNA(%),尾巴长度(μ米),橄榄(任意单元)。
4.5。骨髓微核测试
剩下的腿节从同一动物用于碱性彗星试验被用于估计MN频率和有丝分裂活动。骨髓涂片,和幻灯片沾May-Gruenwald /染色解决方案如前所述[35]。每个动物,1000多色红细胞(PCE)盲目显微镜下对锰的存在。此外,电脑的数量在1000年normochromatic红细胞(指标)动物记录评估骨髓抑制,有丝分裂活动是按照百分比计算PCE = [PCE / (PCE +出版社)]×100。
4.6。氧化应激指标的测量
研究槲皮素的影响在氧化引起的DNA损伤TPT,动物被视为在组1、3、7、9。老鼠牺牲TPT治疗后颈椎脱位24 h,并收集来自股骨的骨髓细胞的活性氧积累,估计脂质过氧化作用,谷胱甘肽,GSSG水平。细胞内ROS的生成是评估基于细胞内peroxide-dependent氧化2′,7′二乙酸-dichlorodihydrofluorescein (DCFH-DA)形成荧光化合物,2′,7′二氯荧光素(DCF),与修改如前所述36]。骨髓细胞收集管含1.5毫升胎牛血清然后离心洗冷PBS (pH值7.4)。骨髓细胞被离心收获,与冷PBS洗了两次,终于在PBS resuspended。200年μL骨髓细胞(2×105与200年)孵化μL DCFH-DA(0.4海里)60分钟37°C的黑暗。的荧光强度是监控FLUOstarω标(BMG LABTECH有限公司、德国)的激发波长485 nm和发射波长520 nm)。结果表示为褶皱控制。
Malonodialdehyde (MDA)产生的脂质过氧化作用在骨髓细胞根据量化的方法Ohkawa et al。37基于硫代巴比土酸),(稍后通知)反应。MDA水平样本,从标准曲线计算使用1,1,3,3-tetramethoxypropane作为标准,表示为μ摩尔/ g蛋白。谷胱甘肽是化验,5、5′-dithiobis (2-nitrobenzoic酸)(DTNB)根据协议所描述的Ellman [38]。GSSG与DTNB化验、谷胱甘肽还原酶和NADPH如前所述[39]。谷胱甘肽的浓度和GSSG从标准曲线,计算得到的谷胱甘肽和GSSG从刚做好的标准解决方案,分别表示为μ摩尔/ g蛋白。谷胱甘肽的价值获得除以GSSG谷胱甘肽(GSSG比率值。蛋白质测定的方法是由洛瑞et al。40),使用牛血清白蛋白作为标准。
4.7。统计分析
数据表示为平均值±标准偏差(SD)的意思。方差齐性分析参数测试和正常和被发现是正态分布。因此,数据分析采用非参数测试,Mann-WhitneyU以及,克鲁斯卡尔-沃利斯检验之后,邓恩的多个测试或方差分析比较,方差分析,其次是Tukey-Kramer多重比较。结果被认为如果明显不同值。
缩写
| 课程: | Topotecan |
| LMA: | 低熔点琼脂糖 |
| PCE: | 多色的红细胞 |
| 米歇尔。内格罗蓬特: | 微核 |
| TBARS: | 硫代巴比土酸反应的物质 |
| ROS: | 活性氧 |
| 谷胱甘肽: | 减少谷胱甘肽 |
| GSSG: | 氧化谷胱甘肽。 |
利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
确认
作者感谢刺激讨论Sabry阿迪博士和他的援助及相关研究。这项工作是支持的资助研究中心药房,沙特国王大学,利雅得,沙特阿拉伯(080145)。