文摘

预防性药物激活的星形基因表达的转录因子Nrf2增强抗氧化防御系统和防止缺血神经元损失和其他疾病模型。然而,Nrf2的作用在调节内源性神经保护反应尚不明朗。我们最近表明,Nrf2轻度氧化应激激活的啮齿动物和人类的星形胶质细胞。此外,短暂暴露于缺血性条件激活Nrf2都被发现在活的有机体内和在体外,这是导致神经缺血预处理。在这里,我们表明,短暂性脑缺血的条件在体外和在活的有机体内导致Nrf2目标基因的表达增加与谷胱甘肽通路有关,包括那些参与谷胱甘肽的生物合成和胱氨酸吸收。综上所述,这些研究表明,星形Nrf2可能代表内源性神经保护预处理的一个重要中介通路。

1。介绍

1.1。Nrf2主调节器的抗氧化基因表达

许多急性和慢性神经系统疾病都与氧化应激有关,生产和解毒的不平衡所引起的活性氧(ROS)。核factor-erythroid两个相关因子2 (Nrf2),帽的一员“n”领转录因子家族,是主调节器的抗氧化防御基因和摘要(1,2]。绑定的Nrf2独联体代理DNA启动子序列,称为抗氧化反应元素(是),允许一群transactivation cytoprotective基因(1,2]。在正常情况下Nrf2必将Kelch-like ECH-associated蛋白1 (Keap1),并通过two-site交互,转录因子是由Cul3 ubiquitinated / Rbx1和针对退化[3]。然而,在氧化应激条件下two-site互动Nrf2 Keap1中断,允许Nrf2逃避Keap1-mediated泛素化和积累在原子核激活基因在其启动子序列,导致诱导抗氧化机械(2]。Upregulation基因的电池有显著影响细胞的承受能力和生存持续氧化侮辱。预防性Nrf2活性的小分子是防止氧化的侮辱在体外,包括自由基捐助者和氧葡萄糖剥夺(OGD),以及有毒的谷氨酸水平或n -甲基- d(门冬氨酸,4- - - - - -6])。Nrf2激活在活的有机体内同样的保护,减少神经毒素或stroke-induced损伤(5,7,8]。

1.2。Nrf2-Mediated神经保护中枢神经系统

Nrf2不可或缺作用在中枢神经系统调节抗氧化反应。Nrf2-dependent基因表达在星形胶质细胞可以保护神经元免受各种创伤和致病因素(9- - - - - -14]。在这些研究中,然而,Nrf2-dependent基因表达人工实现,通过astrocyte-specific Nrf2的过度表达,或通过特征明显治疗途径的小分子催化剂。后者本质上是一种化学预防,即预防性管理小分子Nrf2活化剂带来显著的神经保护(4,5,7,15]。的确,成纤维细胞也呈现抵抗许多亲电试剂,过氧化物,和redox-cycling代理,Nrf2-dependent时尚,通过预处理或与无毒剂量chemopreventive代理“启动”,如萝卜硫素(16]。预防性管理Nrf2催化剂可以被认为是一种人工药理的预处理,即外源性抗氧化反应的激活细胞呈现能更好地捍卫自己从随后的侮辱。然而,很少有人知道什么内生信号可能会触发一个Nrf2-dependent,生理相关的,内源性神经保护反应。

2。结果与讨论

2.1。缺血和氧化应激激活Nrf2星形胶质细胞

在nonneural细胞,通过抑制氧化应激能激活Nrf2 Keap1-dependent Nrf2退化。这是影响至少部分通过修改关键半胱氨酸残基Keap1和可能导致二硫键的形成17和可能是适配器蛋白质构象变化2]。调查是否氧化应激激活Nrf2在神经细胞中,我们选择了两种实验模型重建在体外,OGD和H₂O₂应用程序(18]。曝光时间或浓度选择桥接致命和亚致死的剂量,以确认oxidative-stress-dependent Nrf2激活生理相关的,可行的条件。过氧化是ROS和明确确定的角色导致氧化应激,虽然OGD和随后的再氧化引发复杂的级联的有害事件包括excitoxicity,胞质和线粒体ROS生成和炎症反应(审查[19])。缺氧引起的积累减少电子传递链中的等价物,在再灌注引起一阵ROS生产(20.]。氧化应激和活性氧的生产也来自受损谷氨酸信号由于过度发射机谷氨酸转运蛋白的释放和逆转。由于过度NMDAR活动触发过氧化物生产通过NADPH氧化酶激活和黄嘌呤氧化酶(21]。

我们发现两个OGD和轻微的氧化应激(subtoxic H₂O₂)应用于混合神经病患/文化18]Nrf2目标基因的诱导表达18),包括经典的目标基因,hemeoxygenase(Hmox1)和最近确定目标基因,sulfiredoxin(Srxn1)。考虑到Srxn1和Hmox1比Nrf2基因可以应对其他因素(22),Nrf2是否特定转录因子介导基因诱导缺血后或H₂O₂应用程序仍不清楚。为了确定这一点,Nrf2相同的协议了文化暴露后没有明显的基因诱导后OGD或H₂O₂应用程序没有Nrf2,突出的核心作用在调节这种基因诱导内源性Nrf2 [18]。值得注意的是,我们发现Nrf2激活在混合文化的轨迹是集中在星形胶质细胞。Nrf2目标基因的诱导OGD或氧化应激并不是纯粹的神经文化缺乏星形胶质细胞中观察到,当激活病患在纯文化被发现是非常健壮的(18]。Immunofluorescent分析的混合文化Hmox1诱导的氧化应激还透露感应是特定于GFAP-positive星形胶质细胞(18]。

2.2。星形Nrf2导致神经缺血预处理

我们下一个评估是否Nrf2-regulated基因表达的增加转化为加强保护,通过量化神经可行性后OGD Nrf2和野生型混合文化。后OGD没有区别观察Nrf2野生型和生存神经元(18),这也许是奇怪Nrf2的已知的防护能力,虽然容易解释的事实Nrf2目标基因诱导的有毒侮辱提供保护出现的太晚了。我们假设一个亚致死的侮辱足以激活Nrf2,可能导致神经缺血预处理(23]。我们建立了一个预处理协议,无毒1.5 h接触OGD授予对毒性显著的神经保护应用24 h后[3 h OGD侮辱18]。确定初始1.5 h OGD侮辱导致Nrf2的招聘途径,Nrf2-dependent预处理刺激后基因表达进行评估。1.5 h OGD预处理刺激导致显著upregulationSrxn1和Hmox1基因表达,展示Nrf2通路的激活(18]。这提出了一个可能的贡献星形Nrf2激活发生在神经保护,我们的预处理协议。

确定的角色Nrf2缺血预处理的保护作用,Nrf2野生型混合文化受到预处理协议。虽然preconditioning-induced增加可行性Nrf2野生型和就非常明显神经元,预处理的保护作用的大小显著减少在缺乏Nrf2 [18]。预处理OGD-induced死亡的总数减少了约60%的野生型神经元,但Nrf2-deficient神经元的30%以下(18]。因此,Nrf2激活负责很大一部分缺血预处理的保护作用在体外。我们下一个决心Nrf2通路是否也会涉及在活的有机体内预处理。目标为实现这一目标,Nrf2基因表达是评估在老鼠身上进行15分钟的阻塞大脑中动脉(MCA),刺激,引发后续的预处理和带来显著的保护缺血性发作在活的有机体内(24]。皮质提取物upregulation侧半球也达到显著水准Srxn1和Hmox1后短暂闭塞(18),证明一个缺血性预处理在活的有机体内激活Nrf2通路。

2.3。Nrf2-Regulated谷胱甘肽通路基因的活化预处理刺激

除了Srxn1和Hmox1,Nrf2也调节酶的表达参与谷胱甘肽合成和利用率,系统大大有助于细胞的抗氧化能力。事实上,星形胶质细胞激活Nrf2超表达的小分子被认为促进神经保护的协调upregulation谷胱甘肽的合成和释放,导致附近的神经元增加谷胱甘肽前体的可用性来提高自己的谷胱甘肽池(25]。

确定谷胱甘肽通路基因诱导预处理后,基因表达的代表Nrf2-controlled谷胱甘肽通路成员被量化定量实时PCR (qPCR) 4或8 h后暴露在1.5小时OGD预处理刺激。的表达glutamate-cysteine连接酶(Gclc),谷氨酸/胱氨酸逆向转运(xCT)评估;Gclc编码病原反应酶的催化亚基的谷胱甘肽合成,xCT编码胱氨酸/谷氨酸转运体和代表获得半胱氨酸对谷胱甘肽合成的主要机制。暴露在缺血性预处理刺激授予显著增加Gclc基因表达(图1(一),*,未配对以及,)和附近显著增加xCT表达式4 h后OGD(图1 (b),,未配对以及,)。谷胱甘肽的评估是否招聘途径也可能发生在活的有机体内15分钟,成年老鼠受到MCA闭塞,正如上面提到的,这是一个刺激触发在活的有机体内预处理。四小时后,老鼠牺牲和同侧和对侧的皮层组织从RNA隔离和qPCR半球。瞬态MCA闭塞引起显著upregulation mRNA的表达Gclc和xCT身体的同侧的皮层(见图2(一个)和2 (b),* *,* * *,学生的以及,),以及在另一个Nrf2目标基因的表达,Glutamate-cysteine连接酶调节亚基(Gclm)(图2 (c),* * *,学生的以及,),这表明这些基因产物的潜在贡献合成神经保护收购缺血性预处理在活的有机体内。因此,各种Nrf2基因短暂缺血引起的目标在活的有机体内。

2.4。Nrf2-Dependent Nrf2-Independent Astrocyte-Mediated神经保护机制

我们发现病患Nrf2在预处理过程中发挥作用是符合研究识别ROS生产建立必要的事件预处理[26),发现超氧化物自由基或H₂O₂能够激活预处理反应(27]。此外,我们发现谷胱甘肽的关键标记途径的基因表达增加在体外和在活的有机体内预处理支持谷胱甘肽的神经保护作用通路Nrf2-dependent组件的缺血性预处理。的确,许多研究已经确定了谷胱甘肽作为参与预处理[28,29日),和chemopreventive保护与明显upregulation谷胱甘肽的生物合成的16),Nrf2激活大脑中(7,15]。

与我们的结果,最近的一项研究发现一个Nrf2-independent subtoxic H后神经保护作用₂O₂代在星形胶质细胞(30.]。作者利用一个优雅的表达系统,H₂O₂第星形胶质细胞酶导致一个特定的、可量化的程度的H₂O₂应用D-alanine后生产。这反过来导致星形胶质细胞保护性反应,使神经元抗氧化的侮辱。然而,这种反应是不依赖于星形Nrf2激活和可能涉及酪氨酸磷酸酶抑制(30.]。尽管两者之间的差异背后的潜在原因的研究讨论了在其他地方(18),它是可行的,Nrf2-dependent和Nrf2-independent机制有助于自适应神经由星形胶质细胞反应轻微氧化侮辱。此外,各个通路的重要性可能取决于氧化的发展阶段或严重程度或性质的侮辱。尽管有这些问题,很明显,星形胶质细胞是自适应神经反应的重要介质subtoxic侮辱。

2.5。结束语

星形Nrf2的识别,内源性脑缺血预处理的中介,强调了星形胶质细胞的重要性在塑造神经易受侮辱。而且它强调的潜在价值星形Nrf2作为治疗目标在各种与氧化应激相关障碍(31日]。自从Nrf2控制多个组件的谷胱甘肽系统和thioredoxin-peroxiredoxin系统[2,31日,32山),它有能力协调大脑中抗氧化剂氧化反应的侮辱。虽然研究已经集中在啮齿动物系统中,这将是重要的决定人类星形胶质细胞能够调节神经反应Nrf2-activating刺激,一些人类干细胞为基础的方法现在能够回答。

3所示。材料和方法

3.1。神经元的文化

皮质鼠标混合文化的神经元和星形胶质细胞准备描述(33从E17.5 CD1小鼠neurobasal生长培养基补充B27(表达载体,加州卡尔斯巴德,美国)。这些文化包括大约90% NeuN-positive神经元和10% GFAP-positive星形胶质细胞(34]。实验进行培养的神经元后8 - 10天中皮质神经元发展过程,网络表达功能NMDA-type和AMPA / kainate-type谷氨酸受体,并形成突触联系。开始之前的实验中,神经元受到营养不足,将他们从生长介质转移到TMo了两个小时,一个中等含10% MEM (salt-glucose-glycine英杰公司)和90% (SGG)介质(NaHCO SGG: 114毫米生理盐水、0.219%₃MgCl 5.292毫米氯化钾1毫米₂2毫米CaCl₂甘氨酸,消息灵通的10毫米,1毫米,30毫米葡萄糖、丙酮酸钠0.5毫米,0.1%酚红;渗透性325 mosm / l, (35])。

3.2。氧葡萄糖剥夺

OGD进行培养小鼠神经元。从TMo细胞转移,洗一次glucose-free,平衡盐溶液(与甘露醇SGG代替葡萄糖,SGG-Mann): 114毫米氯化钠,NaHCO 0.219%₃MgCl 5.292毫米氯化钾1毫米₂2毫米CaCl₂甘氨酸,消息灵通的10毫米,1毫米,甘露醇30毫米,0.5毫米丙酮酸钠,0.1%酚红;渗透性325 mosm / l的解决方案,此前被冲洗溶液95% N脱气₂-5%的公司₂30分钟电池被安置在脱气glucose-free SGG-Mann和模块化的孵化室,这是刷新N为95%₂-5%的公司₂4分钟的流量20 L / min,根据制造商的指示(美国加州Billups-Rothenburgh, Del Mar),为了充分驱逐任何剩余的氧气室中。有房间的细胞被留在OGD在37°C 3 h,在返回之前常氧条件和glucose-containing媒体(TMo)。没有OGD控制细胞被置于SGG和维护在常氧条件3 h也回到了TMo。所有细胞都留在TMo直到RNA隔离的时间点。厌氧条件下在模块化孵化室被证实用干厌氧指示条(费舍尔科学、拉夫堡、英国)。

3.3。RNA隔离,rt - pcr和qPCR

使用绝对Stratagene RNA RNA分离Miniprep工具包由制造商,包括可选的DNAse治疗(Stratagene,阿姆斯特丹,荷兰)。qPCR, 1 - 3的互补脱氧核糖核酸合成μg RNA使用Stratascript QPCR互补脱氧核糖核酸合成装备(Stratagene)根据制造商的指示,如前所述6,34]。简单,所需的RNA (3μ在RNase-free稀释水(g) 7μL最终体积)和混合在冰2 x cDNA合成主混合(10μL),随机引物:oligo-dT引物3:1(共2μl - 200 ng),要么是1μL RT /核糖核酸酶块酶混合物反应(RT)或1μL水(no-RT控制反应)。反应混合物喜忧参半,旋转下来,孵化为2分钟25°C,在42°C 40分钟,5分钟在95°C。互补脱氧核糖核酸是储存在−20°C。稀释的cDNA随后被用于实时PCR (cDNA相当于6 ng最初RNA / 15μL qPCR所有基因的反应)。qPCR执行在一个Mx3000P qPCR系统(Stratagene)使用辉煌SYBR绿色qPCR大师混合(Stratagene)根据制造商的指示。简单,所需数量的模板与2 x的混合在冰上SYBR绿色主人混合,正向和反向引物在每个最终浓度200海里,30 nM最终火箭被动参考染料浓度,水所需的反应体积。技术复制以及没有模板和no-RT包括消极的控制,和至少3生物复制两种情况进行了研究。利用引物的序列如下(最终在200 nM):xCT-F:5′-ATACTCCAGAACACGGGCAG-3′,xCT-R:5′-AGTTCCACCCAGACTCGAAC-3′,Gclc-F:5′-CCAACCATCCGACCCTCTG-3′,Gclc- - - - - -R:5′-TGTTCTGGCAGTGTGAATCC-3′,Gclm-F:5′-GCACAGCGAGGAGCTTC-3′,Gclm-R:5′-GAGCATGCCATGTCAACTG-3′,GAPDH-F:5′-GGGTGTGAACCACGAGAAAT-3′,GAPDH-R:5′-CCTTCCACAATGCCAAAGTT-3′。qPCR自行车计划是10分钟在95°C;40 30秒的周期在95°C, 40秒60°C与荧光检测,在72°C和30秒;1周期(解离曲线)的1分钟95°C和30秒55°C增加到30秒95°C(斜坡率:0.2°C /秒)和连续检测荧光的55 - 95°C的斜坡。数据分析使用MxPro qPCR分析软件(Stratagene),和感兴趣的基因的表达规范化GAPDH,常用的控制。

3.4。在活的有机体内局灶性脑缺血

所有实验都是在成年雄性C57Bl / 6 j小鼠(英国查尔斯河)在一个合适的家庭办公室执照和遵守法规规定的动物(科学过程)(1986)。瞬态局部缺血(15分钟)是引起管腔内的灯丝闭塞的右大脑中动脉(MCA)。动物麻醉和维护与异氟烷(2%),30%的混合物O₂和70% N₂O面罩。局灶性脑缺血诱导的右侧大脑中动脉的闭塞8 - 0尼龙单丝(Ethicon、Kirkton、苏格兰)涂上硅树脂的混合物(Xantoprene,拜耳牙、大阪、日本)和硬化剂(弹性体活化剂,拜耳牙)。简而言之,右侧颈总动脉(CCA),颈外(ECA)、颈内动脉(ICA)动脉及其分支通过颈中线切口暴露。6丝缝合和CCA的近端分叉的ECA ICA然后第二个缝合系在ECA甲状腺上动脉栓塞(STA)。STA和枕动脉通过电凝法(OA)被关闭。涂硅单丝(直径220μ米)被引入CCA通过一个小切口和先进的10毫米远端颈动脉分叉,MCA挡住。阻塞后,老鼠然后简要从麻醉中恢复过来,放在孵化器(30°C)之前reanesthetized为了消除单丝允许再灌注。伤口缝合关闭,麻醉停止。再灌注后3.75 h (),老鼠reanesthetized短暂5%异氟烷和斩首。大脑被迅速删除,和地区提供的MCA(纹状体和皮层)同侧和对侧的中解剖MCAO的领土,在液态氮冷冻,保存在随后的RNA分析−80°C。冷冻组织样本(ipsi -和侧)称重和单一化1毫升玻璃Dounce匀浆器,和RNA分离如上所述使用Stratagene绝对RNA迷你准备工具包(Stratagene)。Sham-operated动物被视为上面除了没有执行MCA闭塞。

确认

这项工作是由威康信托基金会,一个皇家学会大学研究奖学金(GH)、医学研究苏格兰Tenovus苏格兰,和不明白。凯伦·f·s·贝尔是CIHR博士后奖学金的收件人。吉尔。h·福勒在阿尔茨海默氏病协会收到奖学金。作者宣称没有利益冲突。这种额外的观点文章与以下稿件:贝尔kf,穆巴拉克B,福勒J,巴克斯特PS,古普塔K, T Tsujita Chowdhry年代,Horsburgh K,海耶斯JD和Hardingham通用电气(2011)轻度氧化应激在星形胶质细胞激活Nrf2导致神经缺血预处理。Proc。国家的。学会科学。美国108年,E1-2。