直升机是Prodeath无论p75ICD敏感性对氧化应激的影响

文摘

背景。生成受体的胞内域(ICD), p75NTR,展品不定地赞成和凋亡活动,涉及神经退行性和neurodestructive疾病。这些细胞效应的分子因素并不完全理解。“直升机”p75ICD领域已被证明是proapoptotic在体外系统p75ICD proapoptotic。直升机的影响在系统p75ICD凋亡,因此,直升机是否占p75ICD细胞效应的变化还不为人知。因此,我们检查的影响删除直升机p75ICD的影响上在体外细胞培养系统中p75ICD赞成或凋亡,分别。结果。在HN33.11鼠neuroblastoma-hippocampal神经元混合细胞,p75ICD凋亡。在NIH 3 t3细胞,p75ICD proapoptotic。在两个细胞系直升机域的删除p75ICD减少氧化应激产生的细胞凋亡的发生率。因此,无论p75ICD对细胞的影响的性质,其直升机proapoptotic域。结论。表达p75ICD可以增强或减弱氧化诱导细胞凋亡。变异性的影响p75ICD与变异性的影响其直升机领域。

1。背景

p75NTR,生成受体与神经变性的发病机制和neurodestructive疾病,包括阿尔茨海默病(1- - - - - -3),帕金森病(4],侵入性胶质母细胞瘤(5],chemoresistant神经母细胞瘤(6]。它可以赞成或凋亡取决于环境的表达(6,7]。其活动似乎是由胞内域(p75ICD;(8,9])。p75ICD可以代替全身p75NTR在保护(8,9]和death-inducing [7)模型。

p75NTR属于肿瘤坏死因子受体家族的死亡。因此,c端,CD95-like死域最初认为是负责其proapoptotic属性。然而,p75NTR死域并不像其他肿瘤坏死因子家族的死域死亡受体(10- - - - - -12]。直升机地区近膜p75ICD年底都已被证明是必要而充分的供p75NTR诱导细胞凋亡。直升机必须membrane-anchored或palmitoylated函数以这种方式;事实上,当它不是,它是一个占主导地位的负面影响在这个活动在模型p75NTR proapoptotic [13]。

我们有神经嵴肿瘤模型中特征p75ICD要么是防止氧化应激,因此,凋亡[8,9)或有丝分裂facilitatory逮捕,因此proapoptotic [7]。我们现在证明,凋亡和proapoptotic模型系统,p75ICD-bound直升机似乎proapoptotic。这表明该变量的性质的活动p75ICD相对于细胞生存不是斩波函数的变化的结果。

2。方法

2.1。基因结构和细胞培养模型

HN33.11行(布鲁斯·韦恩的礼物、埃默里大学、亚特兰大,GA)是一种混合的小鼠神经母细胞瘤和初级海马神经元。这些细胞已经被用作无限增殖模型研究疾病的海马体(14),为数不多的大脑区域中p75NTR表达成人(15]。HN33.11杜尔贝科的基本培养基培养细胞(DMEM)补充8%胎牛血清(正在亚特兰大生物制剂,GA)。

全身p75ICD (A)和Chopper-deleted p75ICD (B)构造与V5抗原决定基到克隆pBig2i-MCS-GFP强力霉素(阿霉素-;Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州)监管的向量(表达载体,卡尔斯巴德,CA;图1)。质粒转染到细胞HN33.11使用Lipofectamine 2000(表达载体)和稳定的线路选择抗潮霉素(400毫克/毫升;英杰公司)。构建可诱导性是荧光显微法验证了GFP表达和免疫印迹分析p75ICD片段表达阿霉素后暴露36-48小时。个人GFP-positive和GFP-negative克隆分离进行研究。

NIH 3 t3细胞(位于马里兰州Rockville美式文化集合)也研究确定转染的影响与一个表达式构造(A)或(B),与HN33.11细胞不同,他们不表达内源性p75NTR (Mi和约瑟夫,未发表的结果;也参见图8mcs车道)。转染、筛选、克隆分离NIH 3 t3细胞进行如上所述HN33.11细胞。

2.2。西方的屁股

蛋白质浓度测定用布拉德福德试验(Bio-Rad蛋白质化验,Bio-Rad实验室、大力神,CA),和15μ克蛋白质被加载到15%氟化钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶和转移到polyvinylidine膜(微孔,贝德福德,MA)作为我们前面描述的(16]。免疫印迹分析使用anti-p75ICD (Promega,菲奇堡,WI;1:1000)和anti-V5(罗福斯,利特尔顿有限公司;1:4000)抗体。

2.3。接触氧化压力

细胞治疗6-hydroxydopamine (6-OHDA;Sigma-Aldrich)或H₂O₂在完成(即。,serum-containing) culture medium for 1 hour. Media were replaced and cells were incubated for 48 hours before analysis via flow cytometry or the MTS viability assay (see what follows).

2.4。细胞周期分析

2×10⁶细胞被固定在乙醇、核糖核酸酶处理,沾propidium碘检测DNA。GFP-expressing -nonexpressing细胞分析了我们之前的描述(6)的存在和缺乏强力霉素。

2.5。MTS试验

20μL CellTiter 96水一个解试剂(Promega)添加到每个在96 - 100年试验板包含样品μL培养基。板是在37°C 1小时孵化湿润,5%的公司₂大气之前阅读每个在490纳米的光密度(OD_490海里)在一个盘子读者。

2.6。通过免疫印迹测定Caspase-3乳沟

细胞收获在0、6、9、12、24小时6-OHDA或车辆后治疗。细胞颗粒resuspended进radioimmunoprecipitation分析缓冲区(10毫米三羟甲基氨基甲烷、液pH值8;150毫米氯化钠;0.1%诺乃清洁剂p 40;0.5%的钠脱氧胆酸盐;0.1% SDS;1毫米phenylmethylsulfonyl氟化物;4μg / mL抑肽酶;1毫米原钒酸钠;从Sigma-Aldrich),声波降解法和离心后,整除的上层清液含有等量的蛋白质被加载到一个钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶蛋白免疫印迹。墨迹是沾染了一种主要兔抗体裂解caspase-3和goat-anti-rabbit二级抗体(细胞信号技术,贝弗利,MA)。

2.7。赫斯特染色测定细胞凋亡

与6-OHDA治疗后,细胞被洗一次与杜尔贝科的磷酸盐和95%乙醇固定与冷。赫斯特染色33342 (Sigma-Aldrich;2毫克/毫升原液)被添加到细胞1:200稀释在杜尔贝科的磷酸盐;这些细胞被培养在室温下30分钟。细胞在杜尔贝科洗一次磷酸盐和安装在幻灯片的荧光显微镜分析。

2.8。统计分析

群体间的比较参数变量进行使用学生的t -测试。被认为是具有统计学意义的差异的水平。

3所示。结果

3.1。分析Dox-Regulated p75ICD HN33.11向量系统细胞

HN33.11细胞转染GFP的控制向量,C2eGFP,或测试质粒,MCSiresGFP,服用阿霉素(0.5 - 3μg / mL)。阿霉素诱导MCSiresGFP-transfected细胞GFP的表达。相比之下,阿霉素治疗没有增强绿色荧光蛋白表达C2eGFP-transfected细胞(图2(一个))。

HN33.11细胞然后用MCSiresGFP,转染gfp(一个),或(B)构建gfp表达。阿霉素诱导GFP表达在所有情况下,尽管(A)和(B)结构表现出一定程度的“泄漏”在缺乏强力霉素(图2 (b))。

稳定的线路已创建的两个克隆-GFP-transfected (A)和(B) -GFP-transfected细胞。Dox-induced GFP表达了在所有情况下(图3(一个))和GFP-positive GFP-negative克隆被孤立。图3 (b)也表明,然而,这些HN33.11-derived克隆表达内源性长篇p75NTR大约在同一水平的克隆,使诱导p75ICD (A)和(B)的假定增量p75ICD p75NTR可以通过内源性生成的乳沟。

3.2。保护作用的(A)在HN33.11细胞gfp的表达

我们以前的研究表明转染的保护作用与p75ICD表达式构造对氧化应激p75NTR-negative PC12嗜铬细胞瘤细胞(8,9]。鉴于HN33.11转染的细胞(A) gfp所说的已经p75NTR-positive p75ICD进入细胞,我们首先寻求测试假设(A) gfp表达将增强HN33.11细胞的抗氧化剂的压力。已知HN33.11细胞表达多巴胺吸收系统[17),我们使用6-OHDA造成氧化应激,如我们在以前的出版物(8]。

图4(一)显示了浓差电池6-OHDA HN33.11细胞存活曲线。稳定的线表示被镀细胞每60毫米盘和暴露于6-OHDA (300μ米)1小时和48小时孵化sub-G1流仪定量分析之前(即。、凋亡)核。Dox-induced (A)的表达gfp HN33.11细胞凋亡(克隆A37和A38)(图4 (b))。

确保转染单独与构造(A)或构造(B)有或没有GFP没有改变HN33.11细胞通过细胞周期的进展,我们检查了转染子通过流式细胞术6-OHDA的缺失。数据表所示1表明构造(A)和(B)构造在本机或GFP-linked状态改变HN33.11细胞的细胞周期分布。

3.3。去除的影响(A)的直升机领域gfp在HN33.11细胞免受氧化应激

表达式构造(B) gfp产生一个代表p75ICD GFP-linked蛋白质-直升机领域。两个克隆(B2和B51), (B)的稳定转染子,-GFP-transfected HN33.11细胞被用来测试删除的影响直升机的保护作用(A) gfp(克隆A37和A38)。

结果克隆A37和A38可比,是此克隆B2和结果。因此,数据显示克隆A37和B2。图5对比检测的时间进程激活caspase-3后1小时接触6-OHDA (150μ米)在MCS-GFP-transfected(控制)细胞克隆A37和B2。正如所料,与(A) gfp转染保护HN33.11 6-OHDA-induced激活caspase-3和减弱这种激活的时间进程。和(B)转染gfp使这种效果更加明显;即删除直升机领域进一步保护细胞免受6-OHDA和变弱caspase-3激活的时间进程。

形态学研究(图6)文档的凋亡诱导衰减6-OHDA (150μ米1小时;照片后24小时内完成6-OHDA治疗)MCS-GFP细胞克隆A37相对稳定和相对克隆A37克隆B2。

流仪分析sub-G1细胞核的细胞克隆的患病率B2 6-OHDA处理(300μ米图所示7。比较这些结果与克隆(A) gfp的图4 (b)表明,切除(A) gfp的直升机域构造不阻止HN33.11细胞氧化应激的保护。

3.4。分析Dox-Regulated p75ICD向量系统在NIH 3 t3细胞

为了研究转染的影响(A) gfp和(B) gfp细胞上不内生p75NTR表达或p75ICD时,我们做稳定转染子NIH 3 t3细胞与这些构造和MCS-GFP(控制)。因为NIH 3 t3细胞不表达儿茶酚胺转运体(18),我们被他们使用氢氧化应激₂O₂。我们先前的研究已经证明6-OHDA和H的定性相等₂O₂在其他细胞氧化应激模型的发电机p75NTR-mediated调制对活性氧(8]。

图8表明,NIH 3 t3细胞转染MCS不表达p75ICD;转染与构造(A)或构造(B),分别导致每个p75ICD的两个片段的表达。在这种背景下,表达式构建足够“漏水”排除使用阿霉素表达打开和关闭。氧化应激对NIH 3 t3的影响因此转染子一样的存在和缺乏强力霉素(数据没有显示)。

3.5。影响表达式的构建(A)或构造(B)在氧化应激引起的细胞死亡在NIH 3 t3细胞

的保护作用与构造(A)在HN33.11,构造(A)与H强化治疗引起的细胞死亡₂O₂在NIH 3 t3细胞(图9)。删除的直升机与合成构造域和转染(B)返回响应NIH 3 t3细胞氧化应激的MCS-transfected细胞;即删除直升机领域保护NIH 3 t3细胞与p75ICD转染的影响。这表明,尽管p75ICD表达相反的影响对氧化应激的敏感性在HN33.11和NIH 3 t3细胞,分别直升机域是proapoptotic细胞系和p75ICD的微分效应(即。构造(A))不相关的微分信号通过直升机。

4所示。讨论

生成受体、p75NTR、函数作为低亲和力,独立的受体和与TrkA coreceptor。在它的独立功能,它作为发起者的赞成和凋亡信号通路。它是越来越“依赖受体受体家族,赋予细胞对生长因子的依赖生死攸关的决策(19]。

绑定的神经生长因子的细胞外领域p75NTR和随后的绑定各种关联蛋白与胞内域导致p75NTR的顺序乳沟α- - -γ分泌酶解放p75NTR的胞内域,p75ICD [20.]。我们之前已经证明p75ICD不定地支持就足够了,凋亡p75NTR在某些活动在体外系统(8,9]。的氨基端段p75ICD被称为“直升机”,已被证明是proapoptotic在一个在体外系统holo-p75NTR proapoptotic [13]。在目前的研究中,我们问的问题是直升机,相反,是一个凋亡在体外系统holo-p75NTR凋亡。我们测试的假设直升机活动确定是否赞成p75NTR或凋亡在给定的系统。

我们目前的结果不符合这一假设。他们证实,直升机proapoptotic holo-p75NTR是否赞成或凋亡。p75NTR对细胞生存的影响的变化因此与可变性的斩波器的影响。

而酪氨酸激酶受体一直调节细胞死亡等过程,扩散,保护、发展和分化和神经系统疾病(了21]),p75NTR参与发展和疾病特征(要少得多了(22])。然而,最近的研究表明p75NTR可能在阿尔茨海默氏症中扮演不同的角色(1- - - - - -3),帕金森病(4沿着神经轴[],分化和突触连接23),电阻的神经肿瘤化疗(6),和迁移的胶质母细胞瘤细胞离开原发肿瘤(5]。

p75NTR表达在中枢神经系统发育限制,当人类生活进步从胚胎到成年,p75NTR从无处不在的表达式,表达式主要局限于基底前脑胆碱能神经元,海马(了22])。此外,p75NTR和淀粉样前体蛋白(APP)已被证明和交互,交互作用,诱导神经元死亡。p75NTR处理应用神经生长因子和影响β淀粉样蛋白改变p75NTR-APP互动(24]。此外,p75NTR是presenilin-1衬底和两个coregulated系统和在正常发展模式(1,2]。这些观察结果牵连p75NTR在阿尔茨海默病的发病机制。

proNGF-sortillin-p75NTR复杂已经涉及到细胞凋亡与帕金森病有关。这个复杂的被建议作为一个潜在的目标预防黑质神经元的变性(4]。

修剪的轴突发育神经突结果最近被证明是一个p75NTR-dependent过程(25]。脑源性神经营养因子(BDNF)是协调的同源p75NTR配体依赖性活动轴突在发展的持久性。那些不活跃的轴突退化过程中,需要p75NTR。

抵抗嗜铬细胞瘤PC12细胞的化疗(6),增强作用的神经母细胞瘤细胞死亡后氧化化疗(26),和迁移距离与中枢神经系统原发性肿瘤侵袭性恶性胶质瘤的5所有主要依靠的是p75NTR。

理解的结构和分子基础p75NTR函数及其上下文的依赖可能因此确定新靶点治疗或预防神经退行性疾病,神经系统发育异常,神经系统癌症。分子的“解剖”p75ICD可能促进功能隔离的赞成和凋亡的影响,促进操纵一个或另一个信号级联触发p75NTR和参与特定的病理或发育过程。本研究的结果提出的问题是否Chopper-free p75NTR碎片或p75ICD可能原型抗氧化和抗凋亡治疗策略的神经系统。

5。结论

p75NTR是细胞的细胞功能和上下文相关的。相比之下,直升机的细胞功能不依赖于p75NTR的函数在一个特定的细胞或上下文。直升机是proapoptotic p75NTR pro -或在细胞凋亡。的可变性p75NTR概率的函数,因此,不变量直升机的函数的结果。此外,Chopper-free p75NTR碎片或p75ICD可能可行的原型发展的凋亡的神经退行性疾病的治疗策略。

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