文摘

我们使用了骨髓DNA链断裂,微核的形成,精母细胞染色体畸变,和精子特性分析研究体细胞和生殖细胞的染色体不稳定性与多个剂量的柚皮苷治疗糖尿病大鼠。结果表明,柚皮苷对大鼠细胞毒性和基因毒性测试剂。此外,柚皮苷显著降低diabetes-induced体细胞和生殖细胞的染色体不稳定剂量依赖性的方式。此外,糖尿病诱导氧化应激的标记生化改变特征包括增强的脂质过氧化作用,氧化谷胱甘肽的积累,减少减少谷胱甘肽,细胞内活性氧的积累。柚皮苷治疗改善这些生化标记存在剂量依赖的相关性。总之,柚皮苷授予一个吸引人的保护作用对diabetes-induced染色体不稳定性对老鼠体细胞和生殖细胞可能通过减少解释的部分新创高血糖引起的自由基生成。因此,柚皮苷可能是一个不错的候选人与高血糖相关减少基因毒性风险和可能提供减少继发性恶性肿瘤的发展和生殖的结果异常风险,这似乎对糖尿病患者尤其重要。

1。介绍

糖尿病是一种严重的健康问题影响数以百万计的个人世界。到2025年,世界卫生组织(WHO)预计,将有3亿人有糖尿病1]。氧化应激被认为扮演重要角色的aetiopathology各种各样的疾病,如慢性炎症、动脉粥样硬化和癌症(2]。它还可以与II型糖尿病和活性氧产生在这个压力可能会导致DNA损伤(3,4]。此外,糖尿病患者减少了抗氧化防御能力(5]。DNA损伤和修复发挥重要作用在肿瘤转换,因为DNA修复基因的突变可以直接与癌症和DNA修复的功效可能决定容易致癌作用[6]。胚细胞的氧化损伤被认为是各种生殖相关并发症的主要原因导致不孕和其他先天性发育缺陷(7]。已经证明,糖尿病与高水平的DNA氧化损伤和增加对诱变剂和减少DNA修复的功效8,9]。这可能导致染色体不稳定的糖尿病患者,结果是,癌症(10]。流行病学资料表明,糖尿病和癌症风险增加之间的正相关关系,但这种相关性机制的和精确的慢性高血糖症和癌症之间的关系仍模糊(11]。

治疗糖尿病及其并发症在最近的上下文都集中在植物提取物的使用和他们的选民。曾估计,大约80%的地球居民依靠传统医学的初级卫生保健需求,和大部分的治疗包括植物提取物及其活性成分的使用(12]。葡萄柚是饮食的一部分,在大多数国家,经常经常食用果汁。的化学酸味道的水果是柚皮苷,迅速变成了柚苷配基的二氢黄酮的作用的酶-ramnosidase和葡糖苷酶(13]。柚皮苷展览各种药理和治疗属性包括行动作为抗癌,抗炎,和心血管活动14]。此外,柚皮苷降低血糖和血浆胰岛素水平增加糖尿病大鼠(在体外实验15,16]。像大多数类黄酮,柚皮苷金属螯合、抗氧化和自由基清除属性,据报道,提供一些防止脂质过氧化作用[17,18]。

感兴趣包围了天然抗氧化剂的作用和使用的意思是防止氧化损伤与高氧化应激在糖尿病。在这种背景下,我们的目的是评估的潜在效用antigenotoxic柚皮苷对diabetes-induced染色体不稳定性对老鼠体细胞和生殖细胞和阐明可能机制,柚皮苷介导其有利影响。收集这些数据可能导致专注于开发新型antigenotoxic代理通常在人类饮食消费。在实验室动物,四氧嘧啶和链脲霉素在胰腺显示选择性细胞毒肽,从而导致I型和II型糖尿病。糖尿病患者和实验动物模型表现出高氧化应激由于持久和慢性高血糖,消耗的活性抗氧化防御系统,从而促进新创自由基生成(19]。生成的自由基会攻击所有类型的大分子包括DNA导致染色体不稳定,可能会导致突变或致癌作用20.]。的体细胞染色体不稳定性评估骨髓彗星试验和微核测试。精母细胞染色体分析和spermiograms考试在当前的研究中进行标记的生殖细胞染色体不稳定。此外,氧化应激标志物如精子脂质过氧化作用,氧化谷胱甘肽(GSSG)、谷胱甘肽(GSH)含量降低,活性氧(ROS)评估作为一个可能的机制改进。

2。结果

2.1。柚皮苷对Diabetes-Induced DNA链断裂

碱性彗星试验的结果如表所示1。柚皮苷治疗没有表现出任何显著差异水平的尾巴长,尾巴DNA,尾巴,和橄榄尾巴时刻相比,溶剂控制剂量测试。结果显示,糖尿病导致的水平显著增加所有测量参数与溶剂对照组相比。然而,当剂量的柚皮苷都给糖尿病动物为4周,观察到的DNA链断裂明显降低利率和更高剂量的柚皮苷为更有效的减少在所有测量参数()。

2.2。柚皮苷对Diabetes-Induced MNPCE

MN测试的结果展示在表2。显著增加的频率MNPCE观察与溶剂对照组相比,糖尿病大鼠()。柚皮苷治疗没有表现出显著差异的频率相比MNPCE溶剂剂量控制在两个测试。关于糖尿病动物用柚皮苷治疗,观察保护不力,25毫克/公斤的柚皮苷()。50毫克/公斤,然而,柚皮苷产生一个清晰的显著抑制作用在MNPCE诱导糖尿病相比,未经治疗的糖尿病大鼠()。PCE的结果率:指标也呈现在表2。表明没有明显下降的百分比PCE观察骨髓细胞取样时从糖尿病大鼠()。同样,没有一个测试剂量的柚皮苷修改了比率与对照组相比。

2.3。柚皮苷对Diabetes-Induced精母细胞染色体畸变

精母细胞的结果diakinesis-metaphase我分析如表所示3。柚皮苷治疗没有表现出显著差异的频率结构或数字(多倍体)染色体畸变与溶剂剂量控制在两个测试。结果显示,糖尿病诱发异常的初级精母细胞,具有统计学意义(与非糖尿病的对照组相比)。然而,在剂量测试,柚皮苷治疗减少的总频率异常的初级精母细胞在糖尿病大鼠与未经治疗的糖尿病组相比,和更高剂量的柚皮苷给更有效减少总染色体畸变的频率()。此外,管理生产的柚皮苷高剂量响应接近一个观察到溶剂的控制。

2.4。柚皮苷对Diabetes-Induced改变精子计数和异常

精子细胞实验的结果如表所示4。治疗大鼠与柚皮苷并不影响参数研究了比非糖尿病患者控制剂量值在测试。精子数量明显减少在未经治疗的糖尿病动物中观察到的值相比对照组。此外,糖尿病引起的不正常精子的比例显著增加()。糖尿病与柚皮苷治疗大鼠4周后诱导增加精子数量的减少百分比。此外,不正常精子的比例也与柚皮苷治疗和恢复的柚皮苷高剂量给更多的改进()。

2.5。柚皮苷对Diabetes-Induced精子的氧化应激的影响

柚皮苷的影响在diabetes-induced氧化应激大鼠被测量评估精子MDA含量、谷胱甘肽(GSSG水平,和活性氧积累。这些实验的结果也显示在表4。MDA含量无显著变化观察精子细胞中柚皮苷治疗后相比,控制在两个剂量进行测试。糖尿病动物的MDA含量与对照组相比显著增加()。Diabetes-induced MDA形成废除了柚皮苷在两个测试剂量和降低级别显著不同的MDA水平治疗糖尿病的动物。高剂量的柚皮苷对更多的保护()。

精子谷胱甘肽和GSSG水平没有任何明显的变化在naringin-treated动物相比,控制。谷胱甘肽水平在糖尿病动物明显减少,加上增加GSSG水平与对照组相比(),所以,谷胱甘肽(GSSG率显著下降,表明氧化应激增加()。糖尿病动物对待两个剂量的柚皮苷有显著提高谷胱甘肽水平在治疗糖尿病动物和增加水平明显不同于谷胱甘肽在未经治疗的糖尿病大鼠的水平。GSSG水平也显著降低糖尿病动物的治疗剂量的柚皮苷治疗糖尿病大鼠相比。因此,GSH / GSSG比率增加柚皮苷治疗糖尿病动物,未经治疗的糖尿病大鼠相比具有统计学意义。最大增加GSH / GSSG比率也观察到糖尿病动物用柚皮苷治疗50毫克/公斤。

精子ROS生产被确定DCF的荧光强度评估。DCF荧光水平没有任何明显的变化与剂量的柚皮苷治疗后的大鼠比控制。精子DCF荧光水平在糖尿病动物显著增加了约1.6倍,而控制()。然而,diabetes-induced生产完全废除了DCF荧光剂柚皮苷和降低水平显著不同的荧光光纤未经治疗的糖尿病动物()。

3所示。讨论

糖尿病本身并不负责糖尿病患者的死亡率和患病率高。他们是主要由其引起的并发症,首先冠心病,,至少在某种程度上,氧化应激与糖尿病相关的后果。一些报道称,糖尿病与癌症有关,但这种关联机制尚不清楚。一项研究表明,糖尿病与高水平的DNA氧化损伤,诱变剂敏感性增加,减少DNA修复的功效8]。因为氧化DNA损伤可能导致癌症的推广和发展,它可以被看作是一个元素的糖尿病和癌症之间的联系(9]。在这种情况下,使用天然抗氧化化合物有好处在预防糖尿病氧化应激相关的后果。重要的是,某些抗氧化剂已知基因毒性或致癌性势(21,22];然而,柚皮苷的治疗,在目前的研究中,是没有任何基因毒性和/或细胞毒性在非糖尿病患者和糖尿病大鼠。此外,柚皮苷治疗发现防止diabetes-induced增加体细胞和生殖染色体不稳定。这些观察结果证实先前的研究报道中柚皮苷防止辐射或lomefloxacin-induced染色体不稳定性在动物模型(23,24]。

致糖尿病的代理链脲霉素的基因毒性效应在当前的研究中观察到与以往动物研究的结果一致(25,26]。观察到染色体不稳定的大鼠实验性糖尿病患者可以解释许多生理变化引起的胰腺链脲霉素引起的细胞破坏。这种损伤可能引发炎症过程,以及hyperglycaemia-induced氧化应激(27),这可能足以增加染色体损伤。长期的糖尿病大鼠的状态开始前抽样产生了大量的额外伤害在糖尿病大鼠;这可能是由于糖尿病的代谢发生改变,因此,碰巧在人类长期的高血糖症,他们获得不同的血管和肾功能障碍。这些疾病可能会导致炎症反应也增加自由基的生产,因此,与DNA损伤(28,29日]。事实上,高浓度的DNA损伤评估与姐妹染色单体交换、MN、碱性彗星试验报告II型糖尿病患者(8,30.,31日]。越来越明显,DNA损伤率增加或体细胞染色体断裂是癌症的一个重要危险因素32]。

在糖尿病男性生殖障碍建立和糖尿病是最常见的男性勃起功能障碍的原因。此外,精液质量差也报告了糖尿病男性,包括精子浓度和增加不正常精子形态(33]。在糖尿病的动物模型,通过四氧嘧啶或链脲霉素诱导,早期作品展示了各种男性生殖障碍的结构和功能(34,35]。在当前的研究中我们有确定的生殖细胞基因毒性的发生率精母细胞染色体畸变,精子数、精子形态异常。标记在这些研究参数改变的进步阶段糖尿病可能证实糖尿病诱导对精子形成有很大的影响,在存储和运输精子成熟和发展。高发病率的精母细胞染色体畸变、减少精子数量和更高的不正常精子在进步阶段糖尿病可能被解释为一个综合效应降低睾丸间质细胞功能(就是明证降低血清中睾酮水平/睾丸)和糖尿病危害氧化应激36]。当前结果证实早期研究观察基因毒性升高和氧化应激在糖尿病大鼠的精子26,37]。

感应和修复的DNA链断裂和alkali-labile网站链脲霉素是由几个作者分析。Mossman et al。38]表明,链脲霉素诱导DNA单链断裂在鼠胰岛瘤细胞系(RINr 38),这些病变可以修复时间的方式,与大多数修复完成24小时接触后链脲霉素。使用相同的细胞系,Pettepher et al。39]表明,链脲霉素诱发alkali-labile网站剂量依赖性的方式在线粒体DNA,这些病变可以修好。Pettepher et al。39)发现8 h后暴露于抗生素,55%的损伤诱导的线粒体DNA被移除。修复的水平增加到70%在24 h。

另一方面,在我们的研究糖尿病大鼠安乐死大约4周后链脲霉素管理和染色体不稳定和氧化应激标志物的频率明显高于在糖尿病大鼠比控制。因此,链脲霉素本身并不负责染色体不稳定性的增加水平在糖尿病大鼠。这一事实可能证明Junod et al。40)为了遵循链脲霉素合成的新陈代谢,(1 -¹⁴(2 - C)链脲霉素¹⁴链脲霉素C),(3 -甲基¹⁴1 - 2.7 C)链脲霉素(具体活动Ci /毫克)的老鼠。首先,收集的尿液在第一次1 h药物包含注射放射性的比例最高(34%,3 -甲基¹⁴链脲霉素C),与(1 - 40%¹⁴链脲霉素和(2 - C)¹⁴链脲霉素C)。这个大比例建议改变链脲霉素或其代谢物迅速从体内消除。因此,染色体不稳定性的增加水平在糖尿病大鼠体细胞和生殖细胞可能是由于氧化应激导致的高血糖。高血糖,公认的长期并发症糖尿病发病的因素,不仅产生的ROS也变弱抗氧化机制通过清除的糖化酶(41]。

抑制机制diabetes-induced染色体不稳定在目前的研究并不清楚。一个可能的解释是,柚皮苷治疗糖尿病产生的自由基将允许拦截之前达到DNA。在目前的工作,以评估是否观察antigenotoxic效应是由于一个增强糖尿病产生的自由基的清除剂,氧化应激标志物如脂质过氧化、谷胱甘肽(GSSG比率和活性氧积累,后4周进行评估糖尿病感应。目前的研究表明柚皮苷减少diabetes-induced精子脂质过氧化和活性氧积累和预防显著减少谷胱甘肽(GSSG比率。谷胱甘肽水平的增加表明保护通过柚皮苷可能介导细胞抗氧化水平的调制。这些观察结果证实早期的研究中,据报道,柚皮苷清除自由基和脂质过氧化物(15,24]。因此,清除自由基的柚皮苷似乎对高血糖诱导染色体不稳定性的一个重要机制。

柚皮antigenotoxic行动的详细机制仍有待调查。在最近的研究中,我们试图确定一个可能的机制的柚皮苷antigenotoxic行动,也就是说,抑制自由基生成。结果表明,自由基生成,大大抑制了高血糖与柚皮苷治疗。此外,分析氧化应激相关基因表达的基因,测量更敏感标记的脂质过氧化反应,或氧化DNA损伤,采用免疫检测这些标记可能是有趣和可能提供分子的见解对柚皮苷的保护作用与染色体不稳定引起的高血糖。然而,目前糖尿病患者使用柚皮苷作为饮食的一部分,还应该考虑其额外的有益这可能减少染色体不稳定,这似乎对糖尿病患者尤其重要。

4所示。材料和方法

4.1。动物

成人纯种白化的雄性老鼠体重250 - 300 g(10 - 12周)从实验动物保健中心,药学院,沙特国王大学。动物保持在标准条件下的湿度、温度(20±2°C),光(12 h光明/黑暗12 h)。他们用一个标准的老鼠颗粒饮食和可以免费获得水。所有动物实验中所描述的手稿是按照公认的标准进行人道动物保健按照美国国立卫生研究院的指导方针和沙特阿拉伯王国的法律要求。

4.2。药物

柚皮苷和链脲霉素是购自σ(Sigma-Aldrich圣路易斯,密苏里州,美国)。链脲霉素是溶解在刚做好的柠檬酸钠缓冲(pH值4.4)而柚皮苷是溶解在蒸馏水和由填喂法后准备。控制动物收到等量的蒸馏水。所有其他化学物质都是最好的分析级。

4.3。诱导糖尿病大鼠

隔夜禁食大鼠进行糖尿病由一个刚做好的链脲霉素腹腔注射(65毫克/公斤)柠檬酸缓冲体积的1毫升/公斤。链脲霉素政府三天后,每个大鼠的血糖水平确定。大鼠的血糖水平> 350 mg / dL被认为是糖尿病和包括在这项研究。柚皮苷治疗开始注射链脲霉素(即后第三天。评估后,血糖)。

4.4。实验设计

六组5成年老鼠。三组人第一次糖尿病如上所述。糖尿病确诊时,两组有25或50毫克/公斤柚皮苷口服使用胃内的管每日一段4周和其他两个非糖尿病患者组也每日收到的口服剂量的胃内的管25或50毫克/公斤柚皮苷为4周。柚皮苷的剂量选择的基础上,其抗高血糖药和抗氧化作用在体外糖尿病雄性Wistar鼠(16]。未经处理的非糖尿病患者和糖尿病组还包括在实验中。动物被轻度麻醉下颈椎脱位4周后柚皮苷治疗、骨髓细胞、睾丸和精子细胞取样。柚皮苷被描述在葡萄柚汁约101毫克/升(42]。在动物的剂量相当于人类剂量转换(人类剂量(毫克/公斤)=鼠剂量(毫克/公斤)×(6/37)),剂量为50毫克/公斤柚皮苷在大鼠与人类8.1毫克/公斤。因此,平均体重60千克,需要486.5毫克柚皮苷。基于前面提到的浓度范围,486.5毫克柚皮苷是包含在0.5升的葡萄柚汁。

4.5。检测骨髓DNA链断裂

老鼠被颈椎脱位牺牲,收集从一个股骨骨髓细胞在试管中冰冷的PBS (Ca^{2 +}和毫克^{2 +}自由、pH值7.4)和DNA链断裂研究了碱性单细胞凝胶电泳(彗星碱性测定)据泰斯的指导方针等。43]用细微的修改如前所述44]。幻灯片和溴化乙锭染色(20g / mL)和研究使用荧光显微镜(日本尼康)配备合适的过滤器。五十个单个细胞被选为每个计算分析;所有实验进行了至少三次,每个都有两个平行的幻灯片/动物。单个细胞分析与TriTek CometScore 1.5版本软件。参数研究访问DNA损伤是尾巴的长度(μ米),尾部DNA(%),尾巴(任意单元),和橄榄尾巴(任意单元)。

4.6。骨髓微核测试

剩下的股骨用于估计微核(MN)频率和有丝分裂活动。骨髓细胞收集管含胎牛血清和离心10分钟1100 rpm。体积小的颗粒是resuspended涂片制备胎牛血清。两个从每个老鼠骨髓涂片的准备。风干后,涂片被May-Gruenwald /编码和彩色染色如前所述[45]。从每个动物,1000多色红细胞(pc)和1000 normochromatic红细胞(NCEs)研究了锰的存在在1000 x使用尼康显微镜的放大。除了个人电脑的数量在1000出版社/动物记录评估骨髓抑制,有丝分裂活动。值被表示为占总数的% pc红细胞计数来确定减少成红血球细胞增殖。

4.7。初级精母细胞染色体分析

颈椎脱位后,睾丸被使用和放置在2.2%柠檬酸等张tri-sodium解决方案。白膜的albugenia不辞而别,催眠的小管被嘲笑成细胞悬液。悬浮离心5分钟在1000 rpm和颗粒在低浓度1.1% tri-sodium resuspended柠檬酸溶液在室温下20分钟。离心后上清液被丢弃和丸resuspended Carnoy的固定剂。需要两到三个变化的固定剂前准备的幻灯片。最后,细胞悬浮在1毫升的固定剂和清洁滑动释放染色体爆开。至少有四个幻灯片为每个动物和被允许干燥过夜。编码的幻灯片都沾染了染色,正如前面详细的得分46]。几百传播diakinesis-metaphase我每亮视场显微镜下分析了动物细胞染色体畸变。的畸变类型记录在diakinesis-metaphase我细胞包括单价的,片段,休息,多倍体植株,多价有一连串的四个染色体。总额的比例计算每组染色体畸变。

4.8。尾附睾的精子评价

对于精子的特征分析,每个大鼠附睾的内容之一是收集评估精子异常,精子数量。后立即颈椎脱位,caudae epididyme每只动物的解剖和切口。然后epididymes被单独成管状满3毫升的胎牛血清。管被放置在一个埃普多夫孵化器在32°C 30分钟让精子积极离开epididymes。组织残差从管中删除。幻灯片是染色和亮视场显微镜检查的石油油浸物镜根据出版协议(47]。两个半千精子每组的得分和异常归类为接近那些被Wyrobek和布鲁斯47]。异常精子形式容易识别的非晶,嘴,没有钩,三角形,香蕉状,尾异常,矮人和巨人。精子数量确定在光学显微镜下使用纽鲍尔hematocytometer根据世界卫生组织手册人类精液的检查(48平均每个动物,两项。

4.9。测定精子细胞的氧化应激标志物

研究柚皮苷对糖尿病诱导的氧化损伤的影响,精子细胞收集从剩下的caudae epididymes估计脂质过氧化作用,谷胱甘肽,GSSG, ROS生成。Malonodialdehyde (MDA)生成的精子细胞的脂质过氧化作用是量化的方法Ohkawa et al。49根据硫代巴比土酸反应)。MDA水平样本,从标准曲线计算使用1,1,3,3-tetramethoxypropane标准和表示为nmol /毫克的蛋白质。谷胱甘肽是化验,5、5′-dithiobis (2-nitrobenzoic酸)(DTNB)根据协议所描述的Ellman [50]。GSSG与DTNB化验、谷胱甘肽还原酶和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(如前所述51]。谷胱甘肽的浓度和GSSG从标准曲线,计算得到的谷胱甘肽和GSSG从刚做好的标准解决方案,分别表示为g /毫克的蛋白质。谷胱甘肽的价值获得除以GSSG谷胱甘肽(GSSG比率值。蛋白质定量的方法是由洛瑞et al。52)使用牛血清白蛋白作为标准。

细胞内ROS的生成是评估基于细胞内peroxide-dependent氧化2′,7′二乙酸-dichlorodihydrofluorescein (DCFH-DA)形成荧光化合物,2′,7′二氯荧光素(DCF)与一些修改(如前所述)(53]。包含1.5毫升的精子细胞收集管胎牛血清,然后离心,用冰冷的PBS缓冲(pH值7.4)。精子细胞被离心收获,与冷PBS洗两次,最后resuspended在PBS缓冲。200年L精子细胞(与200年)孵化L DCFH-DA (0.4米)60分钟37°C在黑暗。的荧光强度是监控FLUOstarω标(BMG LABTECH有限公司、德国)的激发波长485 nm和发射波长520 nm)。结果表示为非糖尿病患者控制的褶皱。

4.10。数据分析

数据表示为平均值±标准偏差(SD)的意思。数据分析采用非参数测试,Mann-WhitneyU测试,或者克鲁斯卡尔-沃利斯检验之后,邓恩的多个对比测试。结果被认为如果明显不同值小于0.05。

缩写

ROS:	活性氧
MNPCE:	血细胞多色的红细胞
米歇尔。内格罗蓬特:	微核
谷胱甘肽:	减少谷胱甘肽
GSSG:	氧化谷胱甘肽。

承认

作者扩展他们的感谢院长以来在沙特国王大学科学研究的资助工作通过研究小组项目。以序列- vpp - 120。