dna损伤剂和/或组蛋白去乙酰化酶抑制剂诱导的细胞凋亡过程中活性氧的生成

抽象的

活性氧在许多细胞的凋亡过程中起着重要的作用。本文分析了ROS在dna损伤剂(放线菌素D或地他滨)诱导白血病细胞系CML-T1和正常外周血淋巴细胞(PBL)凋亡中的作用。还报道了与组蛋白去乙酰酶抑制剂丁酸或SAHA协同作用的可能性。我们发现，在癌细胞系中，ROS的产生显著促进了细胞凋亡的触发，而在细胞抑制或细胞毒性药物处理的正常淋巴细胞中，出现了坏死和凋亡，并且ROS产生的异质性很大。组蛋白去乙酰酶抑制剂联合处理对放线菌素D的作用没有增强作用，而地他滨联合SAHA对CML细胞产生协同ROS并促进细胞凋亡。适当降低细胞活力表明该联合治疗CML有良好的治疗潜力，但对正常PBL的副作用应引起重视。

1.介绍

依赖于依赖性凋亡增加，活性氧（ROS）产生和线粒体损伤是现象，其可以在经过抗癌药物治疗的细胞中共同观察到，即，细胞内的RO的积累经常发出凋亡或末端分化[1]．另一方面，白细胞介素-(IL-7-和IL-3-)诱导的ROS生成提供了细胞存活[2，3.]．在上调ROS的药剂中，我们可以找到天然化合物(EGCG、姜黄素或大蒜[4- - - - - -6])、抗炎药(孤雌内酯、槲皮素[7，8)、抗癌化学药物(紫杉醇、顺铂、阿霉素[9- - - - - -11]），甚至一些抗氧化剂（例如，褪黑素[12])。一些ROS诱导与细胞凋亡相关[13]，其他则作为独立现象出现[14]．在许多情况下，另一种药物作用的增强或抵抗细胞的敏化是由ROS的产生引起的[4，15- - - - - -18]．

随着ROS的产生，细胞死亡过程中通常会观察到DNA损伤。这两种现象，ROS水平的增加和DNA损伤，可以是独立的或由另一个引起的。放线菌素D (Dactinomycin, actD)会导致ds和ssDNA的断裂，据报道，放线菌素D处理的细胞对后续处理(TRAIL, TNF-alpha)更加敏感，因为活性氧浓度升高[18，19]．据报道，在骨髓瘤细胞中，高浓度的5-aza-2 '脱氧胞苷(decitabine, DAC)引起的dna损伤伴随着caspase独立的ROS生成[20.]以及p53突变的白血病t细胞中ROS产生依赖的凋亡[21]．未检测到正常外周血淋巴细胞产生ROS的影响[22]．在低浓度，(高达1M) DAC作为s相特异性的表观遗传因子(dna甲基转移酶抑制剂)引起新创DNA高甲基化和转录过程的沉默。这一事实现在广泛利用了新的治疗策略[23，24]．然而，我们的实验集中在高浓度处理下DAC的dna损伤效应。这两种药物，actD和DAC，都能够诱导白血病细胞系CML-T1中p53依赖的线粒体解偶联方式的凋亡，但在正常淋巴细胞中也诱导凋亡[22，25]．

丁酸(但，以丁酸钠形式)是一种短链脂肪酸和天然组蛋白去乙酰化酶抑制剂，已知可诱导HL-60细胞的终端细胞分化[26]．丁酸的生理学浓度诱导ROS肠细胞的瞬时ALTER细胞内氧化还原平衡[27丁酸盐预培养可保护结肠菌免受H₂O₂全身的伤害(28]．在正常外周血淋巴细胞中，丁酸盐诱导细胞凋亡，部分由ROS介导[29]．另一种组蛋白去乙酰酶抑制剂，亚酰苯胺羟肟酸(Vorinostat, SAHA)，增加了胃肠道肿瘤细胞中的活性氧水平[30.]以及白血病[31或小细胞肺癌细胞[32]．这些事实加上正常细胞对SAHA处理的相对高抗性[33，34使这种药物在抗癌研究中名列前茅。

在本文中，我们分析了DNA损伤剂，ActD或DAC诱导的白血病细胞系CML-T1和正常外周血淋巴细胞（PBL）细胞凋亡中ROS的作用，以及由组蛋白脱乙酰酶抑制剂，但撒哈拉。还报道了药物组合诱导的效果的比较。

2.材料和方法

2．1.细胞培养

采用密度梯度离心法将健康人外周血淋巴细胞从水牛衣中分离出来，置于Histopaque 1077 (Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis, MO, USA)上，浓度为500 g，温度为20℃，培养25分钟。用RPMI 1640 (Biochrom AG，德国)重悬组织液浓缩层45分钟，收集非贴壁细胞耗尽单核细胞。淋巴细胞重悬密度为 cells/mL in RPMI 1640 medium (10% FCS, 1% penicillin + streptomycin). CML-T1 cells were cultured in RPMI 1640 at starting density of细胞/毫升。放线霉素D、丁酸钠(均来自Sigma-Aldrich)、SAHA (Cayman Chemical Company, Ann Arbor, MI, USA)和地西他滨(Sigma-Aldrich)分别或联合(同时)在37°C 5% CO下从0至48小时(CML-T1)或72小时(PBL)的时间段内添加₂．用于每种细胞类型的浓度示于表1．

２.２.流式细胞术

细胞活力（通过碘化丙锭，PI），产生反应性氧物质（ROS，观察到由二氯辛荧光素二乙酸酯的产生，H₂通过流式细胞术研究了DCFDA）和线粒体膜电位（MITOTRACKER RED，MTR测量的MMP）。所有荧光探针均购自Invitrogen（Carlsbad，CA，USA）。处理过的细胞（CML,收获PBMC，用PBS洗涤，并悬浮在1mL PBS中。H₂将DCFDA或MTR添加到最终浓度为10米(H₂DCFDA)或40 nM (MTR)在5% CO中浸泡30 min₂在37°C。在PBS中洗涤和重悬细胞后，用FACSCalibur流式细胞仪(BD Biosciences, San Jose, CA, USA)分析样本(5万事件/样本)。活性氧产生的基本水平确定为H₂DCFDA荧光强度达到50％未经处理的细胞。可行细胞区域被定义为散点图的区域，对所有细胞样品稳定，以及H的偏移₂DCFDA光谱量化为达到地面高于地面荧光强度的细胞的比例。在图中，用SEM误差杆绘制了至少四次实验的算术装置。意义水平（P采用InStat软件(GraphPad软件)进行分析。一个P值为0、05或更低被认为是组间比较有统计学意义的差异。研究MitoTracker Red再分布探针对线粒体的染色程度，以观察细胞在不同药物作用下线粒体膜电位的变化。极化线粒体的荧光强度阈值定义为未经mtr染色的细胞达到的最小强度。计算每个样本中线粒体极化的细胞比例(即达到荧光强度阈值的细胞)，并将其作为凋亡标志物。PI-staining, 2L 250年g/mL碘化丙啶原液加入pbs洗涤的0,5 mL细胞悬液中。活细胞的百分数定义为pi阴性染色细胞的数量。

２.３.免疫印迹

Cells were cultured for intervals up to 44 h (CML-T1) or 72 h (PBL) in the absence or presence of DNA-damaging agent (actinomycin D or decitabine) and/or histone deacetylase inhibitor (sodium butyrate or SAHA), harvested from cultures, washed in PBS, and then boiled for 5 min in 200 l的Laemmli缓冲。20万g、4℃离心3 h后，上清液进行12% SDS PAGE电泳，分离的蛋白半干印迹在PVDF转移膜上(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA)。测量PARP,-actin和capase 3的表达水平，如前所述发展了印迹[25]．简单地说，用5%的脱脂奶粉在PBS/Tween中阻断膜，并加入一抗过夜，最终稀释范围为1:500至1:2000。洗涤后，加入Pierce的酶标二抗(1:20 000 - 1:10万)2 h (Pierce Biotechnology, Inc.)。美国罗克福德,IL)。最后使用来自Amersham的ECL Plus化学发光底物和ECL HyperfilmTM对印迹进行可视化。使用Power Look III扫描仪(UMAX Technologies, Inc.)对信号进行量化。和图像分析仪软件AIDA 1D。-肌动蛋白表达作为负载控制。原代兔多克隆抗parp和小鼠单克隆抗caspase 3分别来自Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA, USA)和小鼠单克隆抗-Actin源自Sigma-Aldrich。

3.结果

3．1.细胞生存能力

与DNA损伤的药物（ACTD或DAC），组蛋白脱乙酰酶抑制剂治疗后的CML-T1（CML）细胞和正常的外周血淋巴细胞（PBL）的生存力（BUT或SAHA），以及它们的组合进行了评估（图1）。

实验测定的特定的药物浓度，达到对于两种细胞类型相似的效果。因此，ACTD和SAHA浓度PBL治疗中与用于CML浓度比较加倍，而BUT和DAC分别为CML和PBL相同。即使这些修正并未消除对CML和PBL ACTD行动之间的区别。In CML, actD caused more than 50% viability drop, and addition of histone deacetylase inhibitor (mostly non-toxic when applied alone) shortened the phase of relative cell resistance from 24 h to 16 h. Only moderate DAC individual action was strongly potentiated by SAHA addition, namely, at 48 h exposure. ActD was substantially less toxic for PBL and HDACi addition had almost no effect on PBL viability. However, SAHA potentiation of decitabine toxicity was observed in PBL too. In conclusion, viability curves of combined treatment indicate the possibility of DAC + SAHA synergism in CML as well as in PBL.

３．２．ROS生成

在使用不同药物或其组合治疗期间，监测细胞中活性氧的生成(图)2）。P各种药物的价值统计和组合治疗效应的意义综述总结在表格中2．

在CML细胞中，活性氧生成在最初的16 h降低，在actD作用24 h后达到原始水平，而在加入actD 48 h后，与对照组细胞相比，活性氧浓度显著升高。在经过DAC处理的细胞中，也观察到瞬时ROS浓度下降，但随后ROS产量的增加不足以达到初始浓度。但或SAHA处理使CML中活性氧生成逐渐增加。与仅由HDACi诱导的ROS相比，将actD与组蛋白去乙酰化酶抑制剂联合使用主要导致略微增加ROS的产生，而与单独由actD产生的相关ROS水平无关。同样，当DAC单独使用时，它降低了ROS水平，但与单独使用SAHA相比，DAC + SAHA联合使用增强了ROS的生成。

在PBL，ACTD或DAC治疗仅引起的ROS产生相对于对照水平的小的波动。组蛋白脱乙酰酶抑制剂诱导CML细胞ROS积累相似，但来自不同的血沉棕黄层中获得的数据集被广泛分散。几乎没有当与ACTD组合进行了测试中检测到的增效作用。相反，CML，DAC与SAHA的组合甚至没有协同在PBL来自ROS产生方面。

3.3。细胞凋亡的特征

监测PARP片段化和caspase 3活化以及ROS生成;治疗24 h后的代表性免疫印迹如图所示3.．根据生存能力测量，actD引起的PARP断裂导致了相当大的细胞损伤，而DAC在两种类型的细胞中只引起了中度的PARP断裂。HDACi组蛋白去乙酰化酶抑制剂的作用不同，而SAHA引起了显著的PARP断裂，丁酸钠暴露后PARP断裂较弱。在此，一些增强效应带来了所有的组合测试。与这些结果相反，仅在CML细胞中检测到caspase 3的大量激活。根据PARP片段化特征，主要在actid单独或联合处理的CML细胞中观察到显著的执行性caspase激活，以及在DAC + SAHA联合实验中也观察到。

数字4显示细胞凋亡通路的另一标记物线粒体膜电位在单个药物或组合药物处理24小时后的变化。与上述结果一致，在CML-T1细胞中未观察到HDACi联合actD导致线粒体膜去极化增强。各药物及其联合用药作用24 h后对正常PBL线粒体膜电位的影响均较弱。

4.讨论

细胞凋亡是正常细胞中的生理过程，无效的凋亡途径通常是癌细胞的主要标志之一。因此，支付了对凋亡变化的过程支付了大的关注。ROS形成经常发生在凋亡过程过程中，并且其对编程的细胞死亡的贡献毫无疑问。大规模的细胞毒性和细胞抑制药物提供了许多方法，可诱导肿瘤细胞中的细胞凋亡或末端分化。然而，大多数情况下，在某种程度上也是常规细胞的可行性，并且该特征代表了癌症治疗的不希望的副作用。更多药物应用的组合作用可以通过针对增殖（癌症）细胞的方法来最小化这些不可行的现象。

dna损伤剂，actD和高度集中的DAC，属于非常有效但强大的药物组，其副作用是显著的。组蛋白去乙酰酶抑制剂，丁酸钠和SAHA，是表观遗传药物，主要引起末端分化，因此它们对分化的，静止的细胞只有很小的作用。当使用低浓度时，越来越多的人关注DAC作用的表观遗传机制，这使我们有理由进一步研究DAC和SAHA联合表观遗传效应。

我们研究了ROS在dna损伤药物、组蛋白去乙酰化酶抑制剂(histone deacetylase inhibitors, HDACis)或这两种药物联合诱导的细胞死亡过程中的作用。研究了白血病细胞系CML- t1 (CML)和健康供体正常外周血淋巴细胞(PBL)对增殖细胞无功能凋亡信号和静止细胞完整死亡机制的影响。

首先检测临床用药浓度对CML细胞48h内的活力，并构成72h内的相关药物浓度时间框架，以达到可比较PBL活力的效果。而8M DAC和2 mM BUT对两种细胞类型的影响相似在PBL中，M SAHA和5 nM actD必须增加2倍才能引起类似的活力下降。与HDACis联合治疗并没有增强actd诱导的细胞死亡。与此同时，actid诱导的凋亡标记物，例如p53稳定、Puma诱导或线粒体去极化，并没有因HDACi的存在而增强。从这个角度来看，单用actD对CML的治疗效果并没有改善，但联合使用也没有加重副作用。使用SAHA作为DAC治疗的增强剂可显著降低CML的活力。不幸的是，SAHA也增强了DAC在淋巴细胞中的作用。在这里，我们认为生存能力下降主要是由细胞非凋亡方式死亡引起的[22]．考虑用于CML和PBL不同浓度的SAHA，我们测试的1的效果 M SAHA在PBL上。事实上,1M SAHA没有显著增加DAC对正常PBL生存能力的影响(数据未显示)。

正如引言中所描述的，所有测试的药物都被报道在某些类型的细胞中增加ROS水平，经常促进凋亡诱导。在我们的细胞中，在两种细胞类型的HDACi处理后检测到大量的ROS产生，但从不同的淋巴细胞供体获得的数据集比CML实验获得的数据集更分散。虽然在放线菌素d处理的PBL中也测量到适度持续增加ROS的产生，但需要更长的作用时间来诱导actinomycin d在CML中增加ROS的产生，而在此之前，间隔16小时内ROS水平显著下降。在actD处理的CML的活力曲线上也观察到适当的反应延迟，如果actD联合任意组蛋白去乙酰化酶抑制剂处理细胞，则不会出现这种延迟。此外，与actD的贡献和作用时间无关，actD + HDACi联合治疗比HDACi单独治疗表现出略高的ROS生成。CML和PBL之间的显著差异也体现在DAC的作用上。DAC + SAHA联合处理对SAHA诱导的ROS产生没有影响，这反映出DAC处理PBL没有任何变化，而在CML中观察到DAC处理细胞中ROS的短暂减少和DAC + SAHA诱导的广泛ROS产生。

poly (adp -核糖)聚合酶(PARP)的裂解程度是衡量细胞凋亡效应的一个指标。在我们的细胞中，PARP碎片反映了actD、BUT、DAC和所有联合治疗的活力趋势，但更大的PARP碎片也发生在saha处理的细胞中。因此，随着PARP切割的程度，在actid处理的CML中观察到广泛的caspase 3激活;在SAHA处理的细胞中也监测到caspase 3的大激活，但当使用but或DAC处理细胞时，仅检测到中等效果。令人惊讶的是，用免疫印迹法在PBL样本中只检测到caspase 3活性较差或无活性。我们用其他方法检测处理过的PBL中轻微的caspase 3激活——荧光法或共价标记caspase抑制剂裂解的光度法。但是，在添加药物后的48小时内，CML中激活的执行型caspase的数量持续增加，而在对照组水平下，PBL中caspase 3的瞬时激活在24小时后随后下降(数据未显示)。我们得出结论，在CML细胞增殖过程中，所有药物和组合均可诱导线粒体凋亡，而ROS的产生可显著辅助细胞凋亡的诱导。在PBL中，大的活力下降伴随着适当的PARP碎裂，但在处理期间没有检测到任何显著的ROS产生变化和执行性caspases激活。这一事实证实了PARP片段并不总是依赖于caspase 3的激活[35]和其他因素参与这种类型的PARP切割的触发。因此，我们可以得出结论，坏死以及凋亡参加了淋巴细胞活力下降一部分，这种变化也伴随着活性氧的含量大的偏差的处理PBL产生。

结论

在我们的研究中，我们的抗癌药物治疗两种细胞的过程中研究产生活性氧的作用。不同DNA损伤的药物和组蛋白脱乙酰酶抑制剂是用于治疗癌症或正常细胞。我们发现，在癌细胞系CML-T1，ROS产生显著促成凋亡触发，而在通过细胞抑制或细胞毒性药物治疗的正常淋巴细胞，坏死以及发生凋亡测定ROS产生的大的异质性。组蛋白去乙酰酶抑制剂联合处理对放线菌素D的作用没有增强作用，而地他滨联合SAHA对CML细胞产生协同ROS并促进细胞凋亡。细胞活力的降低相应承诺表示在CML这个组合的治疗潜力。然而，虽然有中ROS的产生没有协同效应，PBL的可行性一滴地西他滨治疗也被结合SAHA表示细胞死亡在PBL也诱导增强。因此，需要对两种药物浓度的优化进一步的研究，以提高使用在癌症治疗这种组合的可能性。

承认

这项工作得到了捷克共和国卫生部赠款IGA NS 9637-4的支持。

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