文摘
降解氧化或氧化改性蛋白质是细胞的抗氧化防御系统的重要组成部分。4-Hydroxy-2-nonenal,主要反应性醛形成的脂质过氧化反应,导致许多类型的细胞损伤。据报道,4-hydroxy-2-nonenal-modified ubiquitin-proteasome蛋白质降解的途径,或者在某些情况下,溶酶体途径。然而,我们以前使用U937细胞的研究表明,4-hydroxy-2-nonenal-modified glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶是由组织蛋白酶g .退化在目前的研究中,我们孤立4-hydroxy-2-nonenal-modified glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase-degrading酶从大鼠中性粒细胞的活性蛋白质分数28 kDa。使用特定的抗体,28 kDa蛋白质被确认为组织蛋白酶G .此外,退化活动被组织蛋白酶G抑制剂抑制。这些结果表明,退化的组织蛋白酶G中扮演着关键角色4-hydroxy-2-nonenal-modified glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶。
1。介绍
中度的活性氧浓度影响许多生理功能。然而,当活性氧浓度超过机体的抗氧化能力,动物细胞进入一个称为氧化应激状态,过量的活性氧诱导的氧化损伤细胞组件。因此,氧化应激已经涉及到大范围的疾病,包括癌症,糖尿病,男性不育,自身免疫性疾病,动脉粥样硬化和心血管疾病1- - - - - -3]。
接触氧化应激,这发生在活性氧和自由基的存在,导致许多不良事件包括修改蛋白质与DNA反应(4]。也会发生脂质过氧化反应和各种醛反应,如2-alkenals 4-hydroxy-2-alkenals, ketoaldehydes,生成5]。4-Hydroxy-2-nonenal (HNE)是一个主要的反应性醛形成的过氧化反应ω6多不饱和脂肪酸,如亚油酸、花生四烯酸(6),并参与各种生理和病理反应(5,6]。
HNE具有很高的稳定性和反应性,主要是负责许多类型的细胞损伤与氧化应激有关。HNE共价结合半胱氨酸、赖氨酸、组氨酸残基(5]。这些加合物被发现在一些疾病的病变,包括老年痴呆症患者的大脑中(7,8和动脉粥样硬化病变的低密度脂蛋白9]。HNE修改酶和DNA,也会影响蛋白质合成和细胞信号(6,10]。许多不同的酶是HNE敏感,比如glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶(GAPDH) (EC 1.2.1.12) [11),glucose-6-phosphate脱氢酶(12),谷胱甘肽还原酶(13),interleukin-1β转换酶(14],Na+K+atp酶(15]。
HNE绑定的蛋白质会导致氨基酸构象变化和修改,以及蛋白质的积累和聚合导致细胞障碍(16]。这种改性蛋白质的分解是一个重要的防御机制对细胞的氧化应激。主要的蛋白水解系统氧化或HNE-modified蛋白质的降解是ubiquitin-proteasome通路(17- - - - - -19]。最近,ubiquitin-dependent HNE-modified蛋白质的溶酶体降解据报道在人类晶状体上皮细胞(20.]。
GAPDH是经典的糖酵解酶在能源生产过程中扮演着重要的角色。哺乳动物GAPDH显示多样化活动的数量与糖酵解功能无关。包括它的作用在膜融合,微管捆绑,磷酸转移酶活动,核出口RNA, DNA复制和DNA修复。此外,GAPDH是参与细胞凋亡,与年龄相关的神经退行性疾病,前列腺癌,和病毒的发病机理21]。最近的研究已经建立了几个新角色GAPDH包括组蛋白基因表达的转录控制,识别欺诈结合核苷酸的DNA,其强制参与端粒结构的维护(22]。此外,GAPDH起着明显的作用在阿尔茨海默疾病相关凋亡细胞死亡(23]。
在先前的报道中,我们表明,GAPDH修改HNE或acetylleucine chloromethyl酮,合成抑制剂acylpeptide水解酶,降解酶,并伴随着释放23 kDa片段的白血病细胞株U937 [24,25]。此外,我们纯化HNE-modified GAPDH-degrading酶从U937细胞提取和识别这种酶组织蛋白酶G (EC 3.4.21.20) [26]。
中性粒细胞在炎症和感染的网站,迅速积累,这些细胞被激活细菌和host-derived因素。经过吞噬作用的微生物或其他微粒物质,中性粒细胞分泌各种介质,具有强大的促炎和抗微生物的活动。这些介质包括抗生素肽和蛋白酶,存储在中性粒细胞颗粒和脱粒过程中释放。人类嗜中性粒细胞弹性蛋白酶,蛋白酶3,和组织蛋白酶G三个胰凝乳蛋白酶家族的丝氨酸蛋白酶都存储在主(嗜苯胺蓝的)中性粒细胞的颗粒。中性粒细胞的形式在感染的第一道防线,在这个函数是不可或缺的。然而,不平衡的嗜中性粒细胞活性蛋白酶可能导致疾病。这种不平衡可能源于控制中性白细胞蛋白酶的不足,以及暴露在过度蛋白酶活动由于的存在增加中性粒细胞炎症组织的数字。增加中性粒细胞弹性蛋白酶的水平确实是与各种炎症性疾病,如慢性阻塞性肺疾病、生殖道炎症,炎症性肠病。囊性纤维化,障碍表现为缓慢而无情的破坏正常的气道结构,强调中性白细胞蛋白酶对疾病的重要贡献。同时,中性白细胞蛋白酶与系统性血管炎,如韦格纳肉芽肿病。 This type of vasculitis can affect multiple organs including the lungs and kidneys and is characterized by granulomatous inflammation. Moreover, the majority of the patients with granulomatous inflammation also have circulating antineutrophil cytoplasmic autoantibodies directed against proteinase 3. Several reports indicate that such antibodies can activate neutrophils. Neutrophil proteases are also associated with tumor development and metastasis [27]。
在目前的研究中,我们用N-formyl-Met-Leu-Phe激活大鼠中性粒细胞(fMLF)。然后我们检查是否组织蛋白酶G从这些激活细胞条件培养基中有效HNE-modified GAPDH退化。
2。结果
2.1。退化HNE-Modified GAPDH通过孵化细胞中性粒细胞的摘录
HNE GAPDH是检查的剂量依赖性降低使用细胞提取物中性粒细胞浓度从10到100μm .如图1乐队的,密度GAPDH HNE随剂量增加而降低。在100年的时间退化GAPDHμM HNE也检查了。乐队的密度对应36 kDa的GAPDH下降。没有减少GAPDH水平细胞提取物中性粒细胞孵化时没有HNE(图2)。
2.2。GAPDH-Degrading酶的分离
条件培养基从大鼠中性粒细胞用细胞松弛素B和fMLF集中预处理通过硫酸铵沉淀,然后分馏Sephacryl s - 200人力资源列。洗脱图如图3。自髓过氧物酶、弹性蛋白酶和组织蛋白酶G从中性粒细胞释放与fMLF刺激后,确定这些酶的活动。髓过氧化物酶活性检测在13 - 16分数与主要的蛋白质峰。组织蛋白酶G和GAPDH-degrading活动是分开的主要蛋白质峰和coeluted相同的分数。25 - 28活跃的分数是用于进一步的实验。
sds - page的结果有效的蛋白质部分孤立的细胞提取物中性粒细胞如图4(一)。一个乐队在凝胶28 kDa的分子量。确定28 kDa蛋白质的组织蛋白酶G,我们使用了一个anticathepsin G抗体在西方的屁股(图4 (b))。
(一)银染色
(b)免疫印迹
2.3。组织蛋白酶G抑制剂对HNE-Modified GAPDH-Degrading活动
各种组织蛋白酶G抑制剂的影响HNE-modified GAPDH-degrading活动活跃的分数了。丝氨酸蛋白酶抑制剂DFP和组织蛋白酶G抑制剂,Z-GLF-CMK,组织蛋白酶G抑制剂,N-acetyl-eglin Cα1-antichymotrypsin,。活跃的分数是孵化eGAPDH和HNE各自的抑制剂的存在。所有抑制剂有效地抑制HNE-modified GAPDH-degrading活动活跃的分数(图5)。
3所示。讨论
中性粒细胞是最丰富的循环白细胞在人类和先天免疫反应中发挥着基础性的作用。这是最好的例子就是由嗜中性白血球减少症患者,慢性肉芽肿性疾病,或白细胞粘附缺陷综合症,尤其容易受到细菌和真菌感染。中性粒细胞炎症迅速招募网站。他们的主要作用是杀死入侵的细菌和某些真菌物种通过吞噬作用释放的颗粒生产的酶和蛋白质和一系列的氧物种。然而,这些细胞的高度破坏性的能力也提出了潜在的中性粒细胞损害健康组织发生在许多炎症性疾病,如急性呼吸窘迫综合征、炎症性肠病、类风湿性关节炎(28,29日]。
HNE是一个α,β不饱和醛所形成的过氧化反应ω6多不饱和脂肪酸。HNE增加在高胆固醇血症和动脉粥样硬化病变导致积累HNE-protein加合物(30.]。同时,HNE促进内皮细胞氧化应激(10,31日),内皮屏障功能障碍(32,33),和细胞凋亡34,35]。最近,一些出版物报道的角色HNE-protein加合物在阿尔茨海默病的发病和进展36- - - - - -38]。自HNE-modified蛋白质导致许多细胞功能紊乱,HNE-modified蛋白质的去除导致细胞生存的重要后果。然而,HNE-modified蛋白质的降解机制尚未阐明。以前,我们发现GAPDH退化是由HNE 4-hydroxy-2-hexenal和是由一种不同的酶催化水解酶和溶酶体酶(25]。此外,我们纯化HNE-modified GAPDH-degrading酶从U937细胞的透析和连续色谱提取和识别这种酶作为组织蛋白酶G (26]。
组织蛋白酶G是一个主要的丝氨酸蛋白酶嗜苯胺蓝的颗粒中中性粒细胞和单核细胞和丰富的U937细胞。组织蛋白酶G具有各种功能,包括血小板活化、凝血因子的蛋白水解作用,血管紧张素ⅱ代,单核细胞趋化现象的活动和杀菌活性。也参与肌凝蛋白的降解,弹性蛋白、蛋白多糖、层粘连蛋白、胶原蛋白、免疫球蛋白G和M [39,40]。
在目前的研究中,我们孤立HNE-modified GAPDH-degrading酶细胞提取物的大鼠中性粒细胞通过透析和Sephacryl s - 200人力资源柱层析法(图3)。结果,一个活跃的一部分包含28 kDa蛋白质被确认为组织蛋白酶G使用组织蛋白酶G-specific抗体(图4)。活跃分数eGAPDH和HNE孵化时的各种组织蛋白酶G抑制剂,退化GAPDH是强烈抑制(图5)。
我们发现HNE-modified GAPDH也退化的提取HL-60细胞,另一个人成髓细胞的白血病细胞株,但不是Jurkat的提取细胞,淋巴细胞白血病细胞系(数据没有显示)。一起在中性粒细胞和单核细胞高表达的组织蛋白酶G,很可能由组织蛋白酶G HNE-modified蛋白质的降解选择性地发生在粒细胞和单核细胞类型。应该注意,退化HNE-modified GAPDH组织蛋白酶G是独立于泛素,而退化HNE-modified依赖泛素蛋白水解酶和溶酶体酶(17,18,20.]。
机制负责去除蛋白质改性脂质过氧化作用的产品是不清楚。因此,很难描绘这样一个蛋白质改性疾病严重程度的贡献或进展。以前的研究报告互相矛盾的结果。在晶状体上皮细胞,HNE-modified蛋白质优先ubiquitinated和降解溶酶体与很少或没有贡献的降解蛋白质的蛋白酶体途径(20.]。在铁nitrilotriacetate-treated动物的肾脏,蛋白酶体降解被认为是去除的重要途径protein-HNE加合物(17]。主导作用的蛋白酶体切除protein-HNE加合物,然而,不符合几项研究表明,氧化应激减少蛋白酶体活性,HNE抑制蛋白酶体直接共价修改(17,41]。此外,在体外研究表明,HNE-cross-linked蛋白质抑制蛋白酶体活性(42),这表明蛋白质降解途径以外的蛋白酶体可能是重要的protein-HNE加合物。很可能不同的路径由不同的细胞和蛋白质去除订婚了,他们的贡献随脂质过氧化的程度43)(图6)。
总之,目前的研究澄清,组织蛋白酶G从大鼠中性粒细胞降低HNE-modified GAPDH,表明组织蛋白酶G中扮演一个重要的角色在消除HNE-modified在暴露于氧化应激蛋白形成。
4所示。材料和方法
4.1。化学物质
人类红细胞GAPDH (eGAPDH) Z-Gly-Leu-Phe chloromethyl酮(Z-GLF-CMK) N-acetyl-eglin Cα1-antichymotrypsin取自Sigma-Aldrich有限公司(圣路易斯,密苏里州,美国)。二异丙基fluorophosphate (DFP),细胞松弛素B, fMLF和光纯化学工业有限公司购买从kouichi(日本大阪)。Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-4-methylcoumaryl-7-amide (Suc-AAPF-MCA)和N-methoxysuccinyl-Ala-Ala-Pro-Val-4-methylcoumaryl-7-amide(往下(当地)-AAPV-MCA)得到肽研究所(日本大阪)。HNE是从开曼化工有限公司(美国密歇根州安娜堡)。我来自Calbiochem组织蛋白酶G抑制剂(默克公司,达姆施塔特,德国)。Sephacryl s - 200人力资源来自通用电气医疗集团生命科学(美国新泽西州皮斯卡塔韦)。其他化学物质和溶剂的分析试剂级。
4.2。抗体
一只老鼠anti-GAPDH单克隆抗体(mAb)购买的AbD Serotec (MorphoSys AG, Martinsried,德国)。一只兔子anticathepsin G多克隆抗体(帕布)从Calbiochem购买。生物素化的山羊antimouse免疫球蛋白帕布,生物素化的山羊antirabbit免疫球蛋白帕布,和辣根过氧化物酶(合)共轭链霉亲和素是来自Dako丹麦/ S(斯特鲁普、丹麦)。
4.3。隔离的中性粒细胞和制备细胞提取物的中性粒细胞
动物实验都是按照1980年开展动物实验指导的日本政府和我们大学的动物实验委员会批准。退休的雄性Wistar鼠获得来自制药实验室(日本东京)和被安置与免费的食物和水。12:12光暗周期保持在1周。中性粒细胞被孤立polypeptone引出如前所述[44与未成年人)修改。总之,5毫升的10% polypeptone无菌生理盐水腹腔注射。十二小时后,老鼠与乙醚麻醉,被斩首。包含中性粒细胞的腹膜冲洗了30毫升的磷酸盐(PBS)包含一个单位/毫升的肝素。清洗解决方案是通过纱布过滤和离心7分钟500 g。红细胞在15毫升0.15 NH细胞溶解4Cl。
准备细胞提取、中性粒细胞(2×108细胞/毫升)收集,与冰冷的PBS洗两次,处理细胞裂解缓冲(20毫米磷酸盐缓冲剂,pH值7.4,1毫米EDTA, 0.05% (v / v)特里同x - 100)为3分钟。细胞溶解产物在17000 g离心10分钟在4°C,由此而来的上层清液(细胞提取物中性粒细胞)是用于进一步分析。蛋白质的浓度是由布拉德福德法(45使用牛血清白蛋白作为参考标准。
4.4。净化程序HNE-Modified GAPDH-Degrading酶
中性粒细胞分离出14老鼠resuspended汉克斯的解决方案(3×109细胞)。细胞松弛素B和fMLF被添加在最终浓度为34.6μM和6.6μM,分别。在37°C细胞孵化1 h在湿润的气氛中5%的有限公司2和95%的空气然后离心机120克15分钟。合成条件培养基是收集并受到硫酸铵饱和度(65%)降水30分钟。离心收集的沉淀是30分钟的15000克。沉淀是resuspended 4毫升的50毫米醋酸钠缓冲包含1 M氯化钠(pH值4.0)和透析对同一个缓冲区使用常用的透析管(分子量截止:14000)。小由离心沉淀了15分钟(8000克)。浮在表面的分数透析后应用于Sephacryl s - 200人力资源列(1.5×90厘米)平衡相同的缓冲区和筛选了缓冲区的流量6毫升/小时。洗出液的紫外吸光度在280 nm,监控和列分数(3.0毫升/管)化验弹性蛋白酶、髓过氧物酶和组织蛋白酶G活动。
4.5。测定的HNE-Modified GAPDH-Degrading活动
每个分数与eGAPDH孵化的整除(6μg / mL)和100年μ米HNE 20毫米磷酸盐缓冲剂(pH值7.4)包含1毫米EDTA在37°C 3 h。测量退化细胞的活动从中性粒细胞,提取的整除(0.4毫克/毫升)孵化与不同浓度的HNE 37°C在同一个缓冲区。分析的样品然后使用anti-GAPDH马伯西方墨点法。
4.6。sds - page及免疫印迹
蛋白质样本准备在SDS - page示例缓冲区(62.5毫米Tris-HCl, pH值6.8,4% (w / v) SDS, 20% (v / v)甘油,10% (v / v) 2-mercaptoethanol,和0.01% (w / v)溴酚蓝)。整除的样本进行sds - page 12%聚丙烯酰胺凝胶的方法Laemmli [46]。银染色,12%聚丙烯酰胺凝胶染色和光银染色II工具包使用kouichi和光纯化学工业有限公司(kouichi)。西方墨点法,凝胶electroblotted到聚乙二烯二氟化物膜(Immobilon-P转移膜;微孔有限公司)180 mA 2小时用半干的传输系统(Trans-Blot SD细胞;Bio-Rad实验室Inc .,赫拉克勒斯,美国加州)。涂抹膜被2%块Ace的解决方案(日本住友制药有限公司、大阪、日本)1 h,探索用鼠标anti-GAPDH马伯(16 ng / mL)或兔子anticathepsin克帕布(0.5μ为2 h g / mL),然后使用生物素化的可视化antimouse或antirabbit免疫球蛋白帕布,HRP-streptavidin,止动剂西方化学发光合衬底(微孔有限公司)。拉斯维加斯- 1000紫外迷你F85 Luminoimage分析仪(日本东京富士胶片有限公司)是用于化学发光检测。每个乐队的密度被多计量化软件(版本3.0;富士胶片有限公司)和表达任意单位。
4.7。酶活性的分析
组织蛋白酶G和弹性蛋白酶活动是通过测量已知的方法使用Suc-AAPF-MCA和往下(当地)-AAPV-MCA作为基质,分别为(47,48]。溶液的荧光强度是阅读的发射波长460 nm和360 nm的激发波长。髓过氧化物酶的活性决定spectrophotometrically使用tetramethylbenzidine和H(620海里)2O2作为底物49]。一个单位的酶活性被定义为1所需的酶量μ摩尔的底物转化为相应的产品在1分钟37°C。
4.8。统计分析
数据被表示为均值±SE和分析了双尾未配对的学生t以及。
缩写
| DFP: | 二异丙基fluorophosphate |
| eGAPDH: | 红细胞glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶 |
| fMLF: | N-formyl-Met-Leu-Phe |
| GAPDH: | Glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶 |
| HNE: | 4-hydroxy-2-nonenal |
| 合: | 辣根过氧化物酶 |
| 马伯: | 单克隆抗体 |
| 往下(当地)-AAPV-MCA: | N-methoxysuccinyl-Ala-Ala-Pro-Val-4-methylcoumaryl-7-amide |
| 帕布: | 多克隆抗体 |
| PBS: | 磷酸盐 |
| Suc-AAPF-MCA: | Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-4-methylcoumaryl-7-amide |
| Z-GLF-CMK: | Z-Gly-Leu-Phe-chloromethyl酮。 |
承认
作者非常感激Akira田中博士对他有价值的和有用的建议本文准备。