著名的t细胞反应对乙酰胆碱受体ε亚基在重症肌无力 - raybet雷竞app,雷竞技官网下载,雷电竞下载苹果

文摘

人类的乙酰胆碱受体是乙酰胆碱受体特征作为目标抗原在重症肌无力(MG)。致病性对乙酰胆碱受体抗体反应alpha-chain已经广泛调查和诊断和预后的价值。然而,少即是已知的t细胞反应的发病的相关性对抗原表位的乙酰胆碱受体链(α,ε,γ)。使用酶联immunospot有关酶联免疫斑点)(化验我们测量t细胞反应对重组片段和合成的多肽和人类乙酰胆碱受体亚基在MG患者(n = 15)和健康的捐赠者(高清;n = 9)。在毫克,最高的t细胞反应被发现对重组表达ε1 - 221。在合成肽ε201 - 215显示最突出的t细胞反应和代表的肽MG和HD最显著的区别。综上所述,突出对t细胞反应人类乙酰胆碱受体亚基表示MG的发病机制中的一个重要的角色。

1。介绍

人类的烟碱乙酰胆碱受体(乙酰胆碱受体)组成的五个单元(2 ,1 ,1 ,,要么1γ或1亚基)特征作为目标抗原在重症肌无力(MG) [1]。的亚基的胎儿受体被替换的亚基在成人肌肉;两个子单元共享约53%同源性在氨基酸水平(2]。病原的抗体主要是针对α乙酰胆碱受体亚基。抗体反应以及淋巴球活动一直在广泛调查MG和巨大的诊断和预后价值。

免疫球蛋白G(免疫球蛋白)自体抗体生产辅助T cell-dependent。虽然MG被认为是被范式antibody-driven自身免疫性疾病,发病的重要辅助细胞很感激。几项研究已经比较t细胞反应涉及执行亚基与监管ε亚基使用片段和纯化重组多肽的人类乙酰胆碱受体(2- - - - - -8]。的ε亚基是特别感兴趣的是其表达在成年人的肌肉不同于胎儿γ亚基,这一事实可能导致克隆删除的逃避和MG autoreactive T淋巴细胞的发展,尤其是在肌无力的胸腺(9]。按照这一假说,两份报告描述,健康受试者相比,只有MG病人对合成的多肽ε亚基的t细胞增殖(2,10]。一直,在MG胸腺瘤患者ε亚基是优先表达(11]。

我们使用了一个酶联immunospot有关酶联免疫斑点)(化验以确定t细胞反应对重组片段和人类乙酰胆碱受体的合成肽。依照之前的观察我们发现对著名的t细胞反应ε亚基虽然没有显著差异显著的α亚单位抗原表位。

2。患者和方法

2.1。病人和控制

外周血淋巴细胞(PBL)获得患者的知情同意广义眼部毫克(n = 15)或健康献血者(高清,n = 9)。PBL是由密度离心分离,要么立即冻结和解冻进行分析或直接使用。

2.2。合成的重组片段

人类和ε亚基多肽合成由总RNA PCR在cDNA准备人的小腿肌肉所描述的其他地方(12]。重组蛋白片段是由沃尔夫冈Wienhold和亚瑟Melms(请提供13]。碎片被表达在大肠杆菌和纯化SDS /页面标准协议(5,12]。α1 - 103和α1 - 209细胞外领域的碎片,阿尔法327 - 298的胞内域亚基(1]。ε1 - 221是一个片段的细胞外的领域ε亚基。

2.3。合成肽

由固相肽合成Fmoc-chemistry自动化为多个肽多肽合成仪合成如前所述[14]。IDGQFGVAYDANVLVε116 - 130年,是一个HLA-DR3-binding肽。ENGEWAIDFCPGVIRε201 - 215年,包含一个显性表位限制HLA-DR52a [7]。IRRKPLFYVINIIVPε236 - 250年,包含一个占主导地位的t细胞表位,不是HLA-DR3-restricted。控制特异性肽,我们使用了类II-associated不变的肽链,夹97 - 120,LPKPPKPVSKMRMATPLLMQALPM, SKMRMATPLLMQA和夹105 - 117。破伤风类毒素肽TT 1272 - 1284是一个promiscuitive HLA-DR3 / DR52a粘合剂。

2.4。ELISPOT试验

我们测量频率的干扰素(IFN)γ分泌有关酶联免疫斑点(酶联immunospot)测定t细胞使用如前所述[15]。微量滴定过滤板(微孔)涂在一夜之间有了反干扰素-γ单克隆抗体(mAb)(克隆1-D1K;10μg / ml, Mabtech,瑞典)。洗后和阻止板块与培养基(RPMI 1640补充5%胎牛血清和抗生素,所有从Gibco),新鲜的或刚解冻PBL MG患者和HD孵化20 h在复制人类乙酰胆碱受体抗体的存在与否或控制(1μg / ml)。伴刀豆球蛋白A (5μg / ml;σ)是作为积极的控制。使用生物素化的反干扰素-γ马伯(克隆7-B61;Mabtech)、streptavidin-alkaline磷酸酶(Mabtech)和BCIP /电视台作为衬底(σ)抗原干扰素-γ分泌T淋巴细胞是可视化和统计解剖显微镜。结果计算和分配的数字干扰素-γ分泌活动在10⁶PBL -事件的相应的数字每10⁶PBL没有抗原。

2.5。统计分析

学生的t以及进行统计分析。p < 0.05被接受的价值意义。

3所示。结果与讨论

在MG患者t细胞反应是异构的。而单一的个体没有任何检测干扰素-γ分泌与乙酰胆碱受体t细胞刺激后片段(表1),其他人表现出明显的反应(数字1和2)。没有与AChR-antibody状态的响应。例如,患者MG-8 AChR-antibody消极而表现出乙酰胆碱受体的t细胞反应的蛋白质片段。因此,一些高清大概AChR-antibody负给正t细胞反应。分析所有捐助者的平均反应时,可检测的均值(积极的)反应,或中位数积极回应,重组的碎片α和亚基诱导t细胞反应毫克高于HD(表1)。然而,统计分析只能确定趋势,没有统计学意义。


集团	捐赠	性 (f / m)	年龄 (年)	AChR-Ab (nmol / l)		每10点⁶出版广播公司
						重组片段				肽
					没有	α	α	α	ε	ε	ε	ε	剪辑	剪辑	TT
					抗原	1 - 103	1 - 209	327 - 398	1 - 221	116 - 130	201 - 215	236 - 250	97 - 120	105 - 117	1272 - 1284

毫克	MG-1	f	70年	135.6	1	0	0	0	0	留言。	留言。	留言。	留言。	留言。	留言。
	MG-2	f	62年	0.5	11	0	0	0	0	留言。	留言。	留言。	留言。	留言。	留言。
	MG-3	米	48	10.2	2	160年	560年	416年	680年	留言。	留言。	留言。	留言。	留言。	留言。
	MG-4	米	66年	0.0	10	0	0	36	0	留言。	留言。	留言。	留言。	留言。	留言。
	MG-5	米	50	2.2	5	151年	160年	320年	409年	留言。	留言。	留言。	留言。	留言。	留言。
	名爵6	米	64年	0.4	12	2	0	28	0	留言。	留言。	留言。	留言。	留言。	留言。
	MG-7	f	66年	0.0	38	39	0	5	0	留言。	留言。	留言。	留言。	留言。	留言。
	MG-8	米	71年	0.0	2	88年	20.	10	158年	留言。	留言。	留言。	留言。	留言。	留言。
	MG-9	米	58	2.8	13	5	5	0	13	0	0	0	0	0	0
	MG-10	f	82年	8.1	6	18	5	0	0	0	3	5	0	0	0
	MG-11	f	25	76.9	20.	18	0	13	0	0	0	0	0	0	0
	MG-12	f	36	1.7	39	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
	MG-13	f	53	1.5	1	13	20.	20.	26	33	20.	20.	39	0	26
	MG-14	f	38	46.0	3	0	0	0	11	43	0	0	0	0	0
	MG-15	f	32	22.2	134年	111年	0	156年	0	33	78年	0	0	0	0

平均响应			54.7	20.5	19.8	40.2	51.3	66.8	86.4	15.5	14.3	3.5	5.6	0.0	3.7
SD			16.4	38.5	33.9	57.5	146.5	129.7	197.0	19.6	29.0	7.3	14.7	0.0	9.8
意思是积极回应						62.7	128.3	118.0	216.0	36.1	33.3	12.3	39.0	0.0	26.0
SD						60.7	219.7	150.9	274.1	6.2	39.6	10.3
中位数积极回应						38.0	19.8	41.5	91.8	32.5	19.5	12.3	39.0	0.0	26.0

高清	HD-1	米	47	留言。	2	0	5	10	13	留言。	留言。	留言。	留言。	留言。	留言。
	HD-2	f	26	留言。	3	0	10	0	3	留言。	留言。	留言。	留言。	留言。	留言。
	HD-3	f	30.	留言。	1	0	0	0	0	留言。	留言。	留言。	留言。	留言。	留言。
	HD-4	f	32	留言。	19	56	0	39	0	留言。	留言。	留言。	留言。	留言。	留言。
	HD-5	米	79年	留言。	4	5	3	0	13	0	0	3	0	0	0
	HD-6	f	64年	留言。	49	0	43	0	135年	50	10	0	35	0	165年
	HD-7	f	53	留言。	1	4	11	0	11	11	0	11	0	7	7
	HD-8	f	48	留言。	6	0	0	0	0	0	0	0	0	6	0
	HD-9	米	60	留言。	95年	0	0	0	0	0	0	0	0	63年	0

平均响应			48.8		20.0	7.1	7.9	5.5	19.3	12.1	2.0	2.6	7.0	15.2	34.4
SD			17.5		32.1	18.3	13.7	13.1	43.8	21.7	4.5	4.5	15.7	26.7	73.1
意思是积极回应						21.4	14.1	24.8	34.7	30.3	10.0	6.5	35.0	25.3	86.0
SD						29.8	16.2	20.3	56.2	27.9		5.7		32.2	111.7
中位数积极回应						5.0	10.0	24.8	12.5	30.3	10.0	6.5	35.0	7.0	86.0

ELISPOT试验进行的描述文本。结果被分配IFN-gamma-secreting事件的数量在10⁶PBL -事件的相应的数字每10⁶PBL没有抗原。负面结果抗原(现货数量没有超过现货数量与抗原)被定义为零。毫克,重症肌无力患者;高清,健康的捐赠者;留言。,not done.

(一)

(b)

(c)

(d)

图1

干扰素的频率, - - - - - -分泌活动每10⁶PBL在单一捐赠者。ELISPOT试验进行的描述文本。结果被分配的数量干扰素- - - - - - -分泌活动在10⁶PBL -事件的相应的数字每10⁶PBL没有抗原。负面结果抗原(现货数量没有超过现货数量与抗原)被定义为零。灰色酒吧、平均响应±SD;黑条,意味着积极响应±SD;十字架,中等积极回应;毫克,重症肌无力患者;高清、健康的捐赠者。注意高标准差由于异构反应的单身人士(见表1)。注意不同的Y轴尺度使用四个不同的重组片段。(一)片段α1 - 103;(b)α1 - 209;327 - 398 (c)α;(d)ε1 - 221。

(一)

(b)

(c)

图2

(一)平均响应,(b)意味着积极的响应,和(c)的平均响应干扰素-的数量 - - - - - -分泌活动在10⁶PBL -事件的相应的数字每10⁶PBL没有抗原。负面结果抗原(现货数量没有超过现货数量与抗原)被定义为零。毫克,重症肌无力患者;高清、健康的捐赠者。

片段ε1 - 221显示最高的响应。合成肽的亚基诱导反应较低。最引人注目的差异观察MG和HD与ε201 - 215包含一个占主导地位的t细胞表位(表1)[7]。符合这一发现,他和他的同事已经证明了t细胞增殖反应合成肽的刺激亚基在194年高达15%的MG患者包括ε- 209 (2]。

AChR-specific t细胞反应和paraclinical数据之间的相关性(性别、年龄、或anti-AChR血清抗体效价)没有观察(见表1)。动物模型的MG,实验性自身免疫性重症肌无力(EAMG),加特纳等人调查的致病性t细胞的决定因素ε亚基(8]。虽然干扰素-γt细胞分泌的活性ε观察亚基肽,这些细胞未能诱导EAMG转移。因此,这些T淋巴细胞被证明是不致病的。还有待决定如果这观察反映了EAMG模型的特点或者不致病的,εsubunit-specific MG患者的T淋巴细胞存在。如果是这样的话,猜测他们可能导致神经肌肉接点的完整性(8]。

我们得出这样的结论:干扰素-γELISPOT方法可能会提供一个有价值的工具来衡量AChR-specific t细胞反应毫克。在MG患者阳性T淋巴细胞特定抗原表位的乙酰胆碱受体ε亚基可能在MG治疗干预的目标。

数据可用性

数据支持这项研究的结果可以提供的通讯作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

我们感谢贝蒂娜嗨,优秀的技术援助。我们感谢沃尔夫冈Wienhold和亚瑟Melms提供试剂。

引用

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国际神经病学研究

突出对乙酰胆碱受体t细胞反应ε亚基在重症肌无力

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