Root-Securing Brain-Fortifying液体上调Caveolin-1在细胞模型通过抑制τ磷酸化与阿尔茨海默氏症

文摘

为了探索root-securing和brain-fortifying液体的影响——(RSBFL)介导caveolin-1 (CAV-1)磷酸化RSBFL Tau蛋白质和发现潜在机制的预防和治疗阿尔茨海默病(AD),从新生SD大鼠海马神经元孤立和DMEM-F12媒介被外源诱导培养β1-42建立细胞模型和广告。与此同时,pEGFP-C1-CAV1和CAV1-shRNA质粒转染到海马神经元为CAV-1超表达和沉默,分别。血清含有RSBFL准备广告模式的干预细胞。GSK-3 CAV-1的表达β,p-Tau正常海马神经元和广告模式在存在血清含有RSBFL评估。模型与广告诱导的海马神经元β1-42透露一个明显CAV-1抑制、增强GSK-3β活动,异常τ磷酸化。相比之下,治疗血清含有RSBFL可能上调CAV-1广告海马神经元( )通过改进p-GSK-3和减少p-GSK-3( ),以及抑制异常Tau蛋白质的磷酸化。因此,RSBFL对海马神经元有良好的保护作用通过增加CAV-1表达,抑制GSK-3β活动,减少过度异常Tau蛋白质的磷酸化。

1。介绍

阿尔茨海默病(AD)是一种先进的中枢神经系统退行性疾病和有两个主要特征包括神经原纤维缠结的形成(非功能性测试)的聚集过度磷酸化τ蛋白在神经元1)和老年斑的形成(SPs)的总量β淀粉样蛋白(β外)神经元。非功能性测试的数量AD患者的痴呆程度(密切相关2]。此外,过度的异常磷酸化τ主要是由糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)、Cdk5 MAPK和其他蛋白激酶。Thr231和Ser396公认为τ主要磷酸化网站的广告。此外,GSK-3β揭示了最高的亲和力和τ的最强的磷酸化蛋白质。目前,许多研究证实GSK-3的激活β能明显促进τ(磷酸化3,4]。中药预防和治疗获得了广泛关注的广告,这将有利于开发和利用天然产品的广告。然而,中国草药的潜在机制预防和治疗的广告仍不清楚。因此,GSK-3β可以被认为是广告的目标探索可能的机制在中药中的应用。

Root-securing brain-fortifying液体(RSBFL)组成的党参党参,枸杞,茯苓,Ziziphus jujuba轧机。var。spinosa,山楂Bunge的多种功能是清除自由基(5),调节免疫(6),和保护大脑神经(7]有助于预防和治疗的广告由于多糖的作用党参党参和枸杞。作为一个著名的公式与应用程序的历史超过20年RSBFL强化大脑和提高智力,许多相应的调查进行验证其功能和治疗功效。的多糖党参党参在这个公式可以执行D-gal-induced衰老小鼠抗氧化和抗衰老的效果(8],可以拯救记忆能力受损的老鼠由于铅的毒性和莨菪碱通过减轻脂质过氧化反应和加速自由基的清除9]。同样,多糖枸杞可以减少methylmercury-induced海马神经干细胞损伤和促进海马神经干细胞分化成神经元和神经元的生长10]。我们先前的研究已经证实,RSBFL能明显改善形态和树突棘的密度,促进CAV-1的表达,抑制过度异常Tau蛋白的磷酸化在海马神经元11]。同样,先前的报道也表明AD患者学习和记忆能力的损害与损失和直接相关的神经元细胞凋亡在大脑皮层和海马区域(12]。然而,潜在的分子机制仍需进一步探讨。在目前的研究中,pEGFP-C1-CAV1转染和shRNA-CAV1基因沉默在海马神经元细胞与广告受到外生模型β1-42感应被应用于发现的分子机制RSBFL预防和治疗的广告和提高学习和记忆能力通过衰减氧化应激和减轻自由基损伤。

2。材料和方法

2.1。隔离、标识和培养海马神经元

新生儿特殊无菌(SPF)雄性SD (SD)大鼠中提供的24小时的年龄在中国三峡大学实验动物中心。根据以前的研究方法(13),SD大鼠被牺牲在灭菌条件下,整个大脑都小心翼翼地收获,和海马组织隔离,放置在ice-chilled D-Hanks解决方案。消除微血管和切成小块后,小块的海马组织添加0.25%胰蛋白酶消化在37°C 20分钟,直到添加胎牛血清(的边后卫)终止消化。过滤后,细胞悬液收集和培养一个准备周全6-well板7×10的细胞群⁵细胞在DMEM-F12中有10%的边后卫。坚持后,神经细胞板的底部被种植在新鲜DMEM-F12中有10%的边后卫,B27 2%, 2毫米谷酰胺,100 U /毫升青霉素,链霉素100 U /毫升,neurobasal-A 37°C和5%的公司₂在湿润孵化室。栽培介质取代新鲜中每3天。培养的海马神经元通过免疫荧光和免疫印迹。

2.2。建设pEGFP-C1-CAV1质粒

根据基因序列的CAV-1老鼠基因银行(156 - 692536个基点),CAV-1的引物聚合酶链反应(PCR)扩增在上海Sangon生物技术有限公司合成有限公司(上海,中国)。从老鼠大脑通过总RNA提取的总RNA提取工具包(Magen、广州、中国)根据制造商的指示。提取的RNA的逆转录反应是由使用逆转录工具包(位于马里兰州Rockville GeneCopoeia, Inc .)、美国)获得cDNA根据制造商的协议。完全30μL的DNA被使用通用DNA纯化提取纯化工具包(TIANGEN生物技术有限公司、北京、中国)根据制造商的指示。pEGFP-C1向量和纯化CAV-1基因产物受到双重限制内切酶消化的EcoR我和萨尔即消化产品被电泳纯化和收获。CAV-1基因拼接到线性pEGFP-C1向量获得pEGFP-C1-CAV1。pEGFP-C1-CAV1重组质粒进行萃取,双消化EcoR我和萨尔,识别和序列分析。验证pEGFP-C1-CAV1质粒转移到海马神经元细胞来实验。

2.3。建设CAV1-shRNA向量

根据以前的报告(14),鼠CAV-1成分的发夹结构包括一个有义链AGTCAATCTTGACCACGTC GACGTGGTCAAGATTGACT和反义链,以及TCTCTTGAA的循环。通过慢病毒转染质粒构建。穿梭质粒LV3-NC CAV1-shRNA,和慢病毒包装质粒病毒包装在适当的比例增加了。解决方案包装病毒收集以备将来使用。病毒的效价测定通过计算产生焦点由于病毒感染是在荧光显微镜下。进行重复实验,最佳的转染方法和参数验证。

2.4。制备血清含有药物和细胞模型的建立与广告

2.4.1。包含药物血清的制备

完全60 SPF SD大鼠的年龄4个月被随机分为三组:正常的控制,RSBFL和多奈哌齐组每组20老鼠。RSBFL和多奈哌齐是购买从湖北民族大学的附属医院和中国卫材公司的老鼠受到定期与RSBFL填喂法和多奈哌齐剂量的31 g / kg·bw(相当于草量公式)和2.25克/公斤·bw每天,分别。正常对照组的老鼠受到每天相同体积的蒸馏水。药品监督管理局1星期后,血清收集从大鼠的腹主动脉动脉,以供将来使用。

2.4.2。细胞模型的建立与广告

一个β1-42(σ,圣路易斯,密苏里州,美国)和蒸馏水稀释,孵化37°C水浴对3 d的骨料做准备β1-42 125更易与L作为股票的解决方案。股票的解决方案是添加到培养海马神经元的最终浓度2.5更易/ L。海马神经元的生存能力受到β1-42治疗被MTT试验和评估β海马神经元1-42-induced p-Tau水平也是决定。

2.5。与广告模型细胞的药物干预

建立模型与广告在DMEM-F12培养细胞中有10%的边后卫,B27 2%, 2毫米谷酰胺,100 U /毫升青霉素,链霉素100 U /毫升,neurobasal-A 37°C和5%的公司₂在湿润孵化室,然后分成5组包括正常神经元培养媒介的正常控制(数控),正常神经元培养介质加10%血清没有任何药物的空白(B),正常神经元培养中加上加10% RSBFL-containing血清(RSBFL),正常神经元培养中加上加上10% donepezil-containing血清(也),和正常神经元培养中加上加10%血清没有任何药物的广告模式(Mod)组。干预后RSBFL——或者donepezil-containing血清12 h,细胞收获CAV-1评估,GSK-3β免疫印迹,τ蛋白表达。

2.6。免疫印迹

提取的蛋白质在每组海马神经元被免疫印迹分析。蛋白质是由BCA量化分析工具(博士德生物工程有限公司,武汉,中国)根据BCA (bicinchoninic酸)方法。蛋白质分离的4 - 6%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds - page),然后转移PVDF膜。膜被5%的脱脂牛奶。目标蛋白质;探讨了p-Tau (Thr231)和caveolin-1 (Abcam,剑桥,英国)和p-Tau (Ser396) p-GSK-3β(Ser9) p-GSK-3β(Tyr216)和GAPDH(圣克鲁斯生物技术、圣克鲁斯、钙、美国),以及序贯二次抗体。发射极耦合逻辑发光用于成像,最后分析了乐队的光学密度凝胶成像系统(Bio-Rad实验室、大力神、钙、美国)。

2.7。统计分析

图像分析系统Image-Pro +软件被用于半定量的分析结果从免疫印迹和免疫荧光。合成数据都表示为平均值±标准偏差(M±SD)。组织是由之间的数据比较用单因素方差分析(ANOVA)通过SPSS 18.0软件。统计上的显著差异,在统计上的显著差异被认为是P< 0.05和P分别为< 0.01。

3所示。结果

3.1。建设和优化pEGFP-C1-CAV1质粒的转染

pEGFP-C1-CAV1重组质粒被成功构建根据上面提到的方法。在海马体神经元后使转染pEGFP-C1-CAV1重组质粒,转染率的5μL质粒到7.5μL脂质体转染细胞可能导致最强的荧光强度最大的人口(图1(b1)),紧随其后的是2.5的比率μL质粒到3.75μL脂质体(图1(a1))和7.5μL质粒到11.25μL脂质体,见最弱的荧光强度和大量的细胞死亡(图1(c1))。转染率的5μL质粒到7.5μL脂质体可能导致最好的细胞状态,明显的光环和清晰突出网络(图1(b2))。虽然转染至2.5的比率μL质粒到3.75μL脂质体也可能导致更好的细胞状态和屈光度,神经网络较弱(图1(a2))。的转染率为7.5μL质粒到11.25μL脂质体可能导致最弱的细胞状态,打断了神经网络和突起和光环消失,甚至很大程度上减少神经元数量(图1(c2))。因此,优化转染条件应该比5μL质粒到7.5μL脂质体。

3.2。建筑和CAV1-shRNA质粒的表达

如图212 h转染后,海马神经元显示优秀的地位,良好的屈光度,明显突起,密集的网络(图2(一个)),没有显著差异与未转染的细胞相比,表明慢病毒没有明显的毒性海马神经元在当前状态。这些结果证实,CAV1-shRNA成功由慢病毒转染和感染有足够能力(效价9×10⁸你/毫升)最好的莫伊10的价值。与此同时,构建质粒显示优秀的目标海马神经元的表达。100年我可能导致最高GFP表达最强的荧光强度和荧光细胞(图的最大数量2 (b)),这表明转染效率最高。同样,莫伊10显示在转染效率无显著差异(图2 (c))相比,100年的我。相比之下,我的1表现出明显不足的生物活性的病毒颗粒由于弱EGFP表达和荧光强度,和最小的荧光的细胞群(图2 (d)),表明转染效率低。

3.3。广告通过建立细胞模型β1-42刺激

如图3(一个)之后,β1-42更易与2.5的最终浓度/ L与初级孵化海马神经元,海马神经元的生存能力显示逐渐减少刺激时间的延长时间的方式。海马神经元的生存能力为79% 2.5更易/ L的存在β1-42的孵化时间12小时,而海马神经元的生存能力是减少到少于60%的孵化时间24-36 h(图3(一个))。

一个β1-42可能诱发主要海马神经元的损伤诱导时间的增加。海马神经元在正常的情况下,显示良好的折射,强大的三维意义上,全身体积,明显的胞体周围的光环,连续扩展突出更多的分支机构,互联网络(图紧密相连3(b1))。后β1-42感应6 h,细胞的边界变得模糊,开始揭示聚合和收缩;与此同时,海马神经元的突起减少(图3(b2))。后β1-42感应12 h,明显的细胞收缩,聚合,细胞连接中断,部分坏死细胞观察(图3(b3))。后β1-42感应24 h,严重的海马神经元的损伤,减少甚至消失的光环,更多的细胞死亡,进一步降低细胞观察海马神经元的连接(图3(b4))。

的扩展β1-42孵化时间,p -的表达海马体神经元蛋白质增加,达到了最高水平的诱导时间12 h;相反,p -的表达海马体神经元蛋白质显示一个明显的减少诱导时间的24日,这可能是由于海马神经元的坏死(数字3 (c)和3 (d))。

基于上述综合考虑,最终的浓度β1-42应该2.5更易/ L。感应温度37°C和感应72 h时间可能导致海马神经元的聚合和成功建立广告单元模型的诱导时间12 h。

3.4。CAV-1 RSBFL对表达的影响,p-Tau, GSK-3β在海马神经元

海马神经元细胞受到空白控制、RSBFL和多奈哌齐治疗的最佳剂量的10%在准备血清培养的CAV1-shRNA pEGFP-C1-CAV1,分别。此外,海马神经元细胞没有任何治疗方法被用作正常控制。如图472 h后,海马神经元培养,GFP的表达出现在海马神经元与pEGFP-C1-CAV1重组质粒转染。虽然每组显示高荧光强度和大量的荧光细胞转染效率高,从RSBFL组海马神经元细胞显示优秀的荧光强度和荧光细胞。

同样,如图572 h后,海马神经元培养,海马神经元转染CAV1-shRNA透露CAV-1基因的沉默和CAV-1和p-GSK-3的表达明显降低(P< 0.01)以及p-GSK-3的表达明显增强 ,p - ,和p - 。相比之下,海马体神经元与pEGFP-C1-CAV1转染质粒调节CAV-1和p-GSK-3展出(P< 0.01)和p-GSK-3使之抑制(P< 0.01),p -(P< 0.05),p -(P< 0.05)与正常相比海马神经元。

根据统计分析,CAV-1基因沉默了一个理想的效果。另一方面,血清含有SRBFL可以挽救的表达CAV-1 CAV1-shRNA和导致减少和增强GSK-3磷酸化β分别在Ser9 Tyr216场所,以及导致磷酸化的增加τThr231 Ser396场所。这些结果表明,RSBFL可以促进CAV-1的表达,抑制GSK-3的活动β,减少τ的磷酸化。

3.5。影响RSBFL CAV-1的表达,p-Tau, GSK-3β在广告的细胞模型

模型建立后12 h,细胞形态和GFP荧光倒置的荧光显微镜下观察。的表达水平CAV-1 GSK-3β,并在收集p-Tau海马神经元被免疫印迹评估。如图6海马神经元的形态,在不同的时间点后模型建立了12 h在倒置显微镜下观察到。每组60 h转染后,海马神经元透露一个优秀的增长状态,再突出,和一个错综复杂的网络,没有显著差异。最强的GFP荧光观察空白组(图6 (b))。相比之下,海马神经元RSBFL和多奈哌齐组显示增长疲软状态和可怜的荧光由于β1-42感应(图6 (c)- - - - - -6 (f)),但从RSBFL组海马神经元的荧光是略高于从多奈哌齐组。在模型组海马神经元表现出严重的解体和荧光海马神经元只有零星可见(图6 (h))。同样,模型组海马神经元的大量显示中断突起,瓦解细胞体,可怜的增长状态(图6 (g))。

同样,如图7海马神经元与pEGFP-C1-CAV1重组质粒转染和诱导β1-42建立广告细胞模型。与正常组相比,CAV-1和p-GSK-3的表达显示显著增加,但p-GSK-3的表达表现出显著减少(P< 0.01)。多奈哌齐与对照组相比,RSBFL可以加强CAV-1的表达(P< 0.05)。另一方面,广告单元模型表现出减少的表达CAV-1 (P< 0.05)和p-GSK-3(P< 0.01)和p-GSK-3表达的增加(P< 0.01),以及增强Tau蛋白的磷酸化Thr231 Ser396场所(P< 0.01)。

基于上述分析,使用RSBFL干预和多奈哌齐可以提高GSK-3的磷酸化β现场Ser9和减少GSK-3的磷酸化β现场Tyr216以及抑制Tau蛋白的磷酸化Thr231和Ser9网站。

4所示。讨论

阿尔茨海默病是一种常见的神经退行性疾病,主要表现为过度异常Tau蛋白的磷酸化,从而导致神经原纤维缠结的形成(非功能性测试)和老年斑(SP)应用蛋白质代谢紊乱,造成的自由基损伤,神经细胞凋亡15),进一步导致认知障碍。先前的研究已经发现,氧化应激中发挥着越来越重要的作用在神经退行性疾病和衰老过程,可能会导致增加的发病率广告(16)和神经功能障碍,最终导致神经元凋亡17]。基于先前的发现,Tau-associated病理变化可以观察到在缺乏明显的沉积β。此外,τ基因敲除的小鼠可以防止β由于低毒性τ的表达水平18,19]。另一项研究表明,GSK-3βτ的关键蛋白激酶可以使磷酸化细胞内应用,从而有效地抑制的产生β(20.]。这些研究表明,氧化应激和过度磷酸化τ蛋白可能AD的发病机制中发挥非常重要的作用。目前,中药有一定的理论和实践基础对抗广告通过抑制神经细胞凋亡的潜在机制,提高学习和记忆能力,衰减NO-induced神经毒性,减轻氧化应激,减少自由基损伤,抑制炎症。因此,我们试图发现的分子机制RSBFL预防和治疗的广告通过减轻氧化应激,减少自由基损伤,提高学习和记忆能力。

有格的et al。21后发现β25 - 35,β1-42孵化与鼠主要神经元,Aβ25 - 35不揭示神经元的形态学上的重大改变,而β1-42会导致神经元的形态学改变。因此,我们使用无菌triple-distilled水稀释β1-42最终浓度2.5更易/ L。稀释的β1-42孵化在37°C 72 h形成聚合状态和被用来诱导海马神经元的损伤12 h。这个细胞模型可以表示在AD的发病机制和神经毒性作用的诱导过程异常Tau蛋白质的磷酸化。因此,该模型是一个成功的广告单元模型在体外。此外,报告还展示了一种多孔结构由于质膜在细胞的收缩,这窝泡也命名为小窝。骑兵是小窝的标记蛋白(22]。当CAV-1过表达,β应用程序和β分泌酶可以本地化的小窝,导致下降β淀粉样蛋白的产量,从而表明CAV-1的保护作用[23]。头et al。24)也发现,海马区域揭示过度异常磷酸化Tau蛋白质和高水平的β在CAV-1基因敲除小鼠,其特点是类似于广告的病理变化;因此,CAV-1淘汰赛加速神经细胞退化和老化。如果鼠标主要神经元CAV-1淘汰赛遭受CAV-1质粒的转染的神经元可能导致明显降低β的水平。Trushina et al。25)也发现,与CAV-1基因敲除小鼠异常行走,减少了体育活动,和其他异常现象,这是由于τhyperphosphorylation海马组织。Gaudreault et al。26]AD患者和正常对照组进行了比较,发现表达下调CAV-1蛋白质在AD患者海马地区,接近一半的水平在正常的人。在目前的研究中,CAV-1基因的沉默在正常海马区域的差别可能导致对这些CAV-1,因此相应地导致τ在Thr231磷酸化水平的增加和Ser396网站。相反,过度的CAV-1可以减少τ的磷酸化Thr231和Ser396网站。在我们的研究中,RSBFL可以促进CAV-1 upregulation海马神经元,这与我们之前的动物实验是一致的。

τ揭示了microtubule-associated蛋白质含量最高。在生理状态下,τ可以与微管蛋白结合,促进微管蛋白的聚合成微管和抑制蛋白质分解。τ还可以进一步与微管结合,促进他们的组装增强稳定(27]。过度磷酸化τ蛋白是由于打断了磷酸化和去磷酸化之间的平衡。在τ蛋白的磷酸化过程,GSK-3β被认为是最强大的激酶(28]。先前的研究已经报道,复杂的广告大脑中可以观察到神经元组织患者,和GSK-3β表现为一个活跃的状态。因此,成对的螺旋纤维(公积金)的形成可能与GSK-3的活动状态β,这表明过度异常磷酸化τ蛋白可能与GSK-3有关β活动(29日]。几个在τ蛋白磷酸化网站可以通过GSK-3被激活β导致过度异常磷酸化(30.]。哈和约翰逊(31日发现GSK-3β活动可以提高细胞内钙离子浓度的增加,因此顺序增加p-Tau水平。此外,miR-12-3p的函数直接针对CAV-1可以抑制异常hyperphosphorylationτGSK3通过调节CAV-1-PI3K / Akt /β信号通路在广告32]。然而,是否RSBFL-induced upregulation CAV-1可以影响GSK-3β活动还不清楚。通过我们的系统调查,在海马神经元,广告β1-42可能导致一个大的裂缝数量的突起,严重的细胞体解体了,可怜的增长状态。另一方面,RSBFL治疗可以执行在海马神经元受到保护的作用β1-42感应,从而大大提高细胞生长状态,通过抑制GSK-3推迟细胞衰老和细胞凋亡β活动。同时,RSBFL治疗可以减少异常Tau蛋白的磷酸化Thr231和Ser9网站,这也进一步表明RSBFL功能抑制过度的异常磷酸化τ和减少在广告p-Tau细胞的表达水平。这些结果表明,RSBFL可能完成保护海马神经元和发挥正常生理功能通过调制磷酸化和去磷酸化之间的平衡,维持微管的稳定性、调节细胞骨架的平衡。新的证据显示,内质网(ER)压力将导致广泛的Tau蛋白的磷酸化。τ的过度异常磷酸化蛋白质也会导致ER应激,这是一种病态的反馈循环(33]。因此,中药的抗氧化活性可能在广告有治疗作用。因此,RSBFL可能上调CAV-1表达和抑制GSK-3β活动,从而减少过度异常Tau蛋白的磷酸化和执行广告的神经保护作用。

总之,移植CAV-1表达,减少GSK-3β活动,抑制过度的异常磷酸化τ蛋白可能的分子机制之一RSBFL预防和治疗的广告。此外,RSBFL能否执行预防和治疗的广告通过抑制神经细胞凋亡在海马组织中需要进一步探讨。

的利益冲突

这些作者声明没有利益冲突。

确认

这个项目是国家自然科学基金支持的过分讲究的中国没有。81260521)Depei元,楚天学者计划,湖北高等学科组体育教育和健康促进,杰出青年科技创新团队(T201624)从湖北省级教育部门,和创新创业基金会从武汉体育大学陈宁。与此同时,作者要感谢陈教授Xianbing实验指导和帮助。

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