积累α-Synuclein糖尿病大鼠小脑浦肯野细胞及其潜在的与炎症和氧化应激标志物的关系

文摘

目标。目前的研究是评价之间的关系进行等离子体氧化应激标志物如丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH),炎症标记pentraxin-3 (PTX3)和小脑的积累α-核蛋白在链脲霉素(STZ)诱导的糖尿病大鼠模型。方法。十二个老鼠纳入研究。糖尿病()是诱导与一腹腔内注射链脲霉素(STZ, 60毫克/公斤)。糖尿病48 h后验证了通过测量血糖水平。六大鼠作为控制。8周后,老鼠以牺牲生化和免疫组织化学评估。结果。在糖尿病大鼠血浆MDA水平显著高于控制老鼠(相比),而血浆谷胱甘肽水平在糖尿病组低于对照组()。此外,在糖尿病大鼠血浆pentraxin-3水平在统计学上高于控制大鼠()。小脑的分析α-核蛋白免疫组织化学显示显著增加α-核蛋白immunoexpression糖尿病组与对照组()。结论。由于慢性炎症和氧化应激增加期高血糖与糖尿病有关,可能会有α-核蛋白聚集在小脑和血清PTX3水平可能是评估作为一种重要的生物标志物的这种情况。

1。介绍

糖尿病(DM)是最常见的一种代谢疾病引起的胰岛素缺乏或电阻(1]。这种疾病可能包括所有类型的系统性与发病率的影响最频繁的神经系统并发症(2]。近年来,越来越多的证据表明,一个可能的2型糖尿病(T2DM)病人体内与神经退行性疾病如阿尔茨海默病(AD)和帕金森病(PD) (3- - - - - -5]。此外,它提出了氧化应激,先进的糖化终端产品(年龄)的形成,增加了醛糖还原酶活性,激活蛋白激酶C (PKC)参与2型糖尿病(神经退化的潜在的分子机制3,4,6,7]。

α-突触核蛋白(α-核蛋白)蛋白质局部突触前终端,结合突触囊泡膜并有助于泡贩运和可溶性NSF (N-ethylmaleimide敏感因素)附件蛋白质受体(陷阱)复杂的形成8- - - - - -10]。近年来,一些体内和体外研究表明高α-核蛋白水平可能导致其异常的聚合和神经元变性(8- - - - - -10]。组织病理学,α-核蛋白积累在中枢神经系统(CNS)形成路易小体在某些疾病如特发性帕金森病(PD)、路易体痴呆(精神的小黑裙),和多系统萎缩(MSA),称为alpha-synucleinopathies [11,12]。根据这些研究,α-核蛋白显示中枢神经系统病理积累在许多地区如大脑皮层、小脑、海马。此外,关系非常密切α-核蛋白、炎症和氧化应激已经报道(13,14]。

Pentraxin-3 (PTX3)是一种急性期蛋白质和pentraxin家族的一员,这是公认的在外围免疫和血管炎症损伤。最近,水平的提高PTX3在脑脊液(CSF)和血浆样本中发现了神经退行性疾病如帕金森病和广告(15]。

虽然有一些研究证明生物化学和组织病理学变化包括大脑皮层和海马在DM,仍有有限的数据对小脑之间的关系α-核蛋白积累、氧化应激和炎症在DM。考虑到这一点,本研究进行了评估等离子体氧化应激标志物如丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH),炎症标记PTX3和小脑的积累α-核蛋白在链脲霉素(STZ)诱导的糖尿病大鼠模型。

2。材料和方法

2.1。动物

十二个男Sprague-Dawley白化成熟大鼠8周的年龄,体重200 - 220克,被用于这项研究。动物喂养在铁笼,随意和安置在对温度控制的环境(°C)与12小时光/暗周期。实验过程是经当地伦理委员会批准(KAU-HADYEK / 2016 - 060)。所有动物研究严格符合动物实验对人类保健委员会的指导方针。

2.2。化学物质

所有化学品都从Sigma-Aldrich购买,Inc .(圣路易斯,密苏里州),除非另有注明。

2.3。试验协议

糖尿病是由腹腔诱导(i.p)注射STZ (Sigma-Aldrich Inc .);圣路易斯,密苏里州,美国)(60毫克/公斤在0.9%氯化钠,pH值调整到4.0和0.2 M柠檬酸钠)为6大鼠(糖尿病组,)。六大鼠作为对照组,不接受任何治疗。糖尿病被评估血糖水平验证24小时后使用葡萄糖氧化酶试剂条(勃林格曼海姆,印第安纳波利斯)。大鼠血糖水平250 mg / dL和更高的被纳入本研究。八周后,这些动物安乐死和血液样本收集的心脏穿刺确定血浆葡萄糖,MDA,谷胱甘肽,pentraxin-3水平。小脑被移除的α-核蛋白免疫组织化学。

2.4。α-核蛋白免疫组织化学

40μ米厚的横截面被切片机(徕卡2145)先生从paraformaldehyde-fixed小脑和石蜡包埋组织。部分是孵化与H₂O₂(10%)为30分钟,消除内源性过氧化物酶活性和屏蔽10%正常山羊血清(英杰公司)在室温下1小时。随后,部分被孵化主要抗体(α-核蛋白,bios Inc .);1/100)24 h在4°C。抗体检测与Histostain-Plus执行批量装备对兔免疫球蛋白(表达载体),和3、3′-diaminobenzidine (DAB)被用来想象最终的产品。所有部分都洗在PBS和拍摄奥林巴斯c - 5050数码相机安装在一个奥林巴斯BX51显微镜。棕色细胞质染色细胞被得分为阳性α-核蛋白疣状。的数量α-核蛋白(+)细胞被系统地评估得分至少100浦肯野细胞每10领域领域组织部分的放大100倍。

2.5。测定脂质过氧化(MDA)

脂质过氧化是决定血浆样品中通过测量丙二醛(MDA)水平与硫代巴比土酸活性物质(16]。短暂,三氯乙酸和TBARS(硫代巴比土酸活性物质)试剂添加到等离子体样品,然后混合,在100°C的环境为60分钟。在冰上冷却后,样本在3000转离心20分钟和上层清液的吸光度是阅读535海里。MDA含量计算从标准校准曲线使用tetraethoxypropane和表达为μM。

2.6。测量血浆谷胱甘肽(GSH)的水平

血浆样品测定谷胱甘肽含量spectrophotometrically Ellman表示的方法17]。在这种方法中,硫醇与5,5′-dithiobis (2-nitrobenzoic酸)(DTNB)和形成一个彩色的阴离子与最大峰值在412海里。谷胱甘肽水平计算从标准校准曲线,表示为μM。

2.7。评价血清PTX3水平

等离子体pentraxin-3 (PTX3)水平测定在每个100μL样本标准ELISA装置在450 nm使用PTX3工具包(Uscn生命科学公司,武汉,中国)。PTX3重复测定水平根据制造商的指导。PTX3试验的检测范围是0.078 - 5 ng / mL。

2.8。统计分析

数据分析使用统计软件SPSS对Windows, 16日版的社会科学统计软件包SPSS全球总部公司,芝加哥,美国)。统计比较使用Mann-Whitney建成测试。结果意味着±SEM。的值被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

表1显示血糖的变化,MDA,谷胱甘肽,PTX3水平在糖尿病老鼠和控制。血浆葡萄糖水平STZ-induced糖尿病组明显高于对照组()。等离子体氧化压力参数的分析揭示群体之间的显著差异。在糖尿病大鼠血浆MDA水平显著高于控制老鼠(相比),而血浆谷胱甘肽水平在糖尿病组低于对照组()。此外,在糖尿病大鼠血浆pentraxin-3水平在统计学上高于控制大鼠()。小脑的分析α-核蛋白免疫组织化学显示显著增加α-核蛋白immunoexpression糖尿病组与对照组()(图1)。


	葡萄糖 (mg / dL)	谷胱甘肽 (μ米)	MDA (μ米)	PTX3 (ng / mL)	α-核蛋白immunoexpression (%)

控制()
糖尿病大鼠 ()

数据表示为±SEM。
,对照组相比,糖尿病大鼠。

(一)

(b)

(c)

(d)

4所示。讨论

最重要的结果在我们的研究中,氧化应激标记(MDA)和炎症标记(PTX3)显著高与高血糖大鼠与STZ诱导,与此有关的是,有趣的是,α-核蛋白immunoexpression更大小脑的高血糖的老鼠。目前的研究是第一个节目α-核蛋白聚集在糖尿病大鼠的小脑浦肯野细胞模型。

人们普遍认为α-核蛋白存在于神经元的突触前膜组织。然而,最近的研究表明,它是在线粒体发现强烈。尽管的生理功能α-核蛋白并不是完全理解,据报道在突触可塑性可能的功能,神经递质释放,神经元分化,调节神经元生存能力(18,19]。各种各样的研究表明α-核蛋白在浦肯野细胞积累各种神经退行性疾病如帕金森病和小黑裙20.,21]。

近年来,高血糖和小脑的神经退化研究在实验模型3,22- - - - - -24]。在这些研究中,与STZ诱导糖尿病大鼠模型,还有拜等人发现星形胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)的标志和S100B水平高于高血糖的老鼠和他们相关报道许多中枢神经系统神经退行性变化区域如小脑、海马和大脑皮质(22]。除此之外,一个重要的氧化应激之间的关系,炎症和神经退行性变的在DM经常强调最近的研究;事实上,这种情况已经被命名为3型糖尿病(25]。与此相关的研究报道糖尿病患者(帕金森病的发生率增加6),并提议的糖基化α-核蛋白蛋白质由于高血糖导致积累路易小体(26]。先前的实验研究提到增加氧化应激和炎症之间的密切关系和积累α-核蛋白。例如,王等人的研究使用ob / ob和db / db小鼠糖尿病模型和观察到单剂1-methyl-4-phenyl-1, 2, 3, 6-tetrahydropyridine注射(MPTP药物)扰乱了不仅在胰腺和肝脏胰岛素信号还在中脑。此外,他们揭示了单节的α-核蛋白聚集在胰腺和中脑黑质。他们建议这种情况与系统性和中央炎症和神经毒性与高血糖(27]。然而,谢等人的一项研究报道,1-acetyl-6, 7-dihydroxyl-1, 2, 3, 4-tetrahydroisoquinoline (ADTIQ)水平升高STZ-induced糖尿病老鼠和转基因α-核蛋白基因PD小鼠模型和海拔是直接相关的积累α-核蛋白。因此,他们推测,高血糖症和帕金森病之间的关系可能与ADTIQ [28]。根据先前的研究,在我们的研究中,我们观察到显著更高α的小脑-核蛋白immunoexpression STZ-induced高血糖的大鼠与对照组相比。

增加代的活性氧(ROS)高血糖被公认为临床糖尿病相关并发症的主要原因。在糖尿病,不仅生产过剩的活性氧,还减少了抗氧化防御机制,如谷胱甘肽代谢受损和改变抗氧化酶活动导致高血糖诱导细胞损伤的病理生理学29日,30.]。MDA被记录为一个关键生物标志物的脂质过氧化反应和氧化应激29日- - - - - -33]。增加糖尿病患者的血浆MDA水平建议之间的关联和氧化损伤在糖尿病的高血糖水平。海拔在脂质过氧化作用也是一个失败的迹象在细胞抗氧化防御机制,如谷胱甘肽(29日- - - - - -33]。谷胱甘肽、三肽,被认为是在所有哺乳动物组织中氧化还原平衡的生物标志物。它保护细胞免受氧化性损伤通过维护SH组蛋白质减少状态和排毒活性氧(ROS)也作为辅酶在各种酶促反应。有几个临床和实验研究揭示了MDA升高,谷胱甘肽水平降低DM (31日- - - - - -33]。在我们的研究中,血浆MDA水平是相当高的糖尿病组,而谷胱甘肽水平降低与对照组相比。与之前的研究结果相一致,本研究的结果表明,暴露在长期高血糖持续时间可能提高脂质过氧化,抑制谷胱甘肽水平的消费增加NADPH由于多元醇通路的激活葡萄糖。

的急性期糖蛋白PTX3之前一直追究其与许多慢性疾病包括DM的关系(34,35]。此外,据报道,急性期蛋白的水平增加各种神经退行性疾病(36,37]。例如,李等人已经观察到在特发性帕金森病病人血清PTX3水平高,发现PTX3之间显著相关水平和运动功能和日常生活活动38]。根据以前的研究的结果结合当前实验的结果,我们可以推测,PTX3,除了急性期蛋白,可能被认为是一个可能的生物标志物增加炎症的慢性系统性和神经退行性疾病的时期。

综上所述,我们所知,我们的研究是第一个证明α-核蛋白聚集在小脑和增加血清PTX3水平STZ-induced糖尿病模型。总之,由于慢性炎症和神经毒性增加的高血糖与糖尿病有关,可能会有α-核蛋白聚集在小脑和血浆MDA,谷胱甘肽,PTX3水平可以作为重要的生物标志物评估这种情况。然而,未来的实验和临床研究需要澄清在DM小脑神经退化的潜在的分子机制。

伦理批准

作者声明,所有程序中执行研究涉及人类受试者按照道德标准机构和/或国家研究委员会1964年赫尔辛基宣言及其后来的修正案或类似的道德标准。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突。

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国际神经病学研究

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