文摘

Spike-timing-dependent glutamatergic层的长期萧条(t有限公司)(L) 4-L2/3发展中皮层突触需要激活的星形胶质细胞内源性大麻素(央行),而谷氨酸释放到突触前NMDA受体(preNMDARs)。的确切功能preNMDARs在这种情况下仍然是难以捉摸的,强烈的争论。阐明他们的功能,我们表明,欧洲央行2-arachidonylglycerol浴应用(2-AG)诱发preNMDAR-dependent形式的化学诱导有限公司(eCB-LTD) L2/3少年躯体感觉皮质锥体神经元的老鼠。突触前Ca^{2 +}成像从L4带刺的星状轴突透露,动作电位(AP)诱发Ca^{2 +}瞬变期间显示preNMDAR-dependent扩大eCB-LTD归纳。然而,压敏电阻器的封锁^{2 +}通道(VDCCs)没有发现直接preNMDAR-mediated Ca^{2 +}轴突的瞬变。这表明astrocyte-mediated谷氨酸释放到preNMDARs不会导致直接Ca^{2 +}涌入,但这反而导致与突触前VDCCs间接互动,促进轴突的Ca^{2 +}涌入。这些结果揭示了剩下的一个主要的信号级联t有限公司在发展中皮质突触。

1。介绍

突触前NMDA受体(preNMDARs)突触传递的重要功能,信息处理和长期可塑性在大脑的几个区域1- - - - - -3]。特别是preNMDARs被认为是诱导所需spike-timing-dependent有限公司在发展中皮层突触(t有限公司)(4- - - - - -7]。最近,我们建议t有限公司在发展中鼠桶皮质需要eCB-dependent活化的星形胶质细胞,导致谷氨酸的释放到preNMDARs [8,9]。重要的是,我们表明,星形胶质细胞活动本身并不是足够的感应有限公司同时与星形胶质细胞的激活是必需的(突触前APs相伴8]。这表明,轴突APs与preNMDARs未知的方式导致t有限公司的感应。

在一定条件下,preNMDARs桶皮质还可以作为presynaptically释放谷氨酸受体功能。的APs后跟一个正确时间额外美联社可以诱导pattern-dependent有限公司L4-L2/3突触(10]。重要的是,由于这种形式的公司需要突触前谷氨酸释放,它绕过了星形胶质细胞活化的必要性。类似地,在视觉皮层的APs可以诱导preNMDAR在L4-L4连接依赖有限公司(11]。因此,preNMDAR-mediated有限公司总是需要突触前活动,而谷氨酸的来源(星形或突触前)可能会有所不同。这意味着应该有突触前重合检测机制包括突触前活动和preNMDAR激活。

尽管上述研究强调,有一个活跃的辩论preNMDARs的存在和功能。这场辩论主要是由于矛盾的发现在突触前Ca^{2 +}由preNMDARs信号。缺乏轴突Ca^{2 +}信号在剑头L5和L4发展中大脑皮层神经元对电离子透入疗法的天冬氨酸或MNI-glutamate释放,以及缺乏一个APV敏感组件在单个AP-evoked Ca^{2 +}瞬变反对preNMDARs[的存在12- - - - - -14]。另一方面,有足够的解剖和生理证据的存在preNMDARs [1,2]。然而,他们的机制功能仍然是难以捉摸的。有人猜测,要么直接突触前Ca^{2 +}通过preNMDARs涌入,突触前去极化由Na⁺通过preNMDARs涌入15)或metabotropic效应(16),可能preNMDAR函数的机制。preNMDARs的性质强烈依赖于他们的亚基组成,这对Ca可以影响渗透率^{2 +}电压特异性毫克^{2 +}块、亚细胞位置和闸门动力学。preNMDARs在皮质突触包含GluN2C GluN2D,或者GluN3A个子单元,使它们相对毫克^{2 +}麻木不仁的Ca的低渗透^{2 +}(17,18]。一致,直接突触前Ca^{2 +}通过preNMDARs涌入皮质突触从未被观察到。在皮质L5剑头的一小部分,配对的preNMDARs激活谷氨酸释放和高频美联社解雇原因轴突Ca的增强^{2 +}涌入(19]。相比之下,preNMDARs位于小脑中的平行纤维似乎渗透Ca^{2 +},直接preNMDAR-mediated Ca^{2 +}涌入报道(20.]。

在这里,我们假设的激活preNMDARs本身并不足以唤起探测Ca^{2 +}信号在L4发展中桶的剑头皮层,但与轴突APs是必需的。调查这一假设,我们使用一种化学有限公司由浴2-AG结合突触前Ca的应用^{2 +}成像。首先,我们表明,eCB-LTD取决于星形胶质细胞和preNMDAR激活。浴应用2-AG应该激活星形胶质细胞preNMDARs分布全球,因此,提高检测概率影响突触前Ca^{2 +}动力学。事实上,我们观察到一个APV-sensitive AP-evoked Ca的扩大^{2 +}瞬变。调查潜在的机制建议preNMDARs Ca^{2 +}渗透率和他们的主要功能是与压敏电阻器Ca交互机制^{2 +}通道(VDCCs)延长AP-evoked Ca^{2 +}在突触前剑头涌入。我们的数据与以前的结果一致,可以帮助协调明显矛盾的观察,从而更好的机械理解preNMDAR函数。

2。材料和方法

2.1。切片制备

实验的兽医办公室批准广东伯尔尼,瑞士。丘脑皮层的大脑切片包含躯体感觉皮质的桶领域是准备从12-21 d老Wistar鼠的(21]。老鼠被斩首,他们的大脑被很快删除成冷(0 - 4°C)含氧生理解决方案包含125毫米氯化钠,氯化钾2.5毫米,1.25毫米不₂阿宝₄25毫米NaHCO₃1毫米MgCl₂2毫米CaCl₂,25毫米葡萄糖。300片,μ米厚,被削减从组织块vibratome (Microm)和保持在37°C之前30分钟,然后在室温下使用。

2.2。电生理学

所有的实验都是在- 34°C。记录,片被转移到与含氧生理记录灌注室解决方案(同上)。躯体感觉皮质的桶领域被确定在L4的桶,可见trans-illumination之下。单极玻璃刺激电极放置在L4桶,和全细胞记录从L2/3锥体神经元的可塑性实验正上方对应的桶。细胞被发现使用红外梯度对比视频显微镜。记录电极的电阻4 - 7米Ω都是采用硼硅玻璃毛细血管。录音进行使用达冈bvc - 700 a放大器(达冈)。数据获取与ITC-16 AD-DA董事会(Instrutech)和使用Igor软件(Wavemetrics)。记录神经元的胞内解决方案包含130毫米葡萄糖酸钾,10毫米消息灵通的钾,磷酸肌酸钠10毫米,Mg-ATP约4毫米,0.3毫米Na-GTP, 4毫米氯化钠,10毫米葡萄糖酸钠与KOH (pH值7.3),和生物胞素0.2% (w / v)。

单组分EPSPs的锥体神经元之间的振幅1和5 mV被刺激诱发L4。获得一个稳定的基准10分钟后在0.1赫兹的刺激,神经的2-AG (10 - 20μ米)浴申请20分钟,而持续的细胞外的刺激。在冲洗,EPSPs记录了一个额外的40分钟。实验丢弃如果基线EPSP坡不稳定(> 10%变化之间的第一个15最后15 EPSP的基线期),或者如果锥体神经元的输入电阻膜电位改变> 15%的实验。

调查的影响星形胶质细胞在突触抑郁,全细胞膜片箝记录进行从星形胶质细胞相邻记录L2/3锥体神经元。记录星形胶质细胞的胞内解决方案包含135毫米KCH₃O₃消息灵通的年代,10毫米,10毫米磷酸肌酸钠,MgCl 4毫米₂,4毫米Na₂atp, 0.4毫米Na-GTP与KOH (pH值7.2)。星形胶质细胞的特点是低静止膜电位,被动应对当前注射正面和负面的,和较低的膜电阻(8]。对星形胶质细胞Ca^{2 +}夹实验,200μM OGB-1, EGTA 0.45毫米和0.14毫米CaCl₂被添加到星形胶质细胞胞内解决夹细胞内自由钙^{2 +}50 - 80纳米的稳态浓度(22]。

对轴突Ca^{2 +}从带刺的星状神经细胞成像实验,记录L4的桶皮层进行全细胞电流钳配置。细胞内的解决方案与Ca补充^{2 +}指示器俄勒冈州绿色Bapta-1 (OGB-1, 200年μM)和形态染料alexa - 594 (50μ米)。APs被超阈值的诱发体细胞当前注射(5 ms)以不同的频率。

Ionotophoresis谷氨酸(100μ米)通过高阻(> 100米Ω)应用程序执行玻璃吸管在电流钳AxoClamp 2 b放大器模式。一个小保留当前的谷氨酸是用于防止泄漏。短暂的女士(1)电流脉冲被用来iontophorese谷氨酸接近L4带刺的星状神经元的树突和轴突。

2.3。Ca^{2 +}成像

双光子激发荧光显微镜,红外femtosecond-pulsed钛蓝宝石激光器(媚态鸡尾酒,Spectraphysics)耦合到一个用自制激光扫描显微镜配备水浸客观(W63x HCX APO紫外线指数,0.9 NA,徕卡)。激发红外激光和荧光发射光分离在670 nm(励磁过滤器670 dcxxr AHF Analysentechnik)。发射光谱是由一个二向色镜分开在560海里(560 dcxr分束器,AHF)和相应的带通(HQ525/50 HQ610/75, AHF)和infrared-block过滤器(700 sp-2p AHF)和检测使用nondescanned背后的检测目标。染料是兴奋 。另外数据是使用激光扫描软件虚拟仪器(国家仪器)23]。轴突Ca^{2 +}成像进行帧扫描模式( )3赫兹1分钟时间和重复每5分钟。星形Ca^{2 +}信号是由星形胶质细胞含有Rhod2-AM dye-containing解决方案的压力喷射进入大脑切片用10×客观视觉控制。染料制备、50μg Rhod2-AM溶解在5μl 80% DMSO溶液和20%普朗尼克酸F127 ( ;σ)和稀释1:19日在HEPES-buffered解决方案包含125毫米氯化钠,氯化钾2.5毫米,10毫米消息灵通的。这个过程导致的特定吸收Rhod2星形胶质细胞的注射区域。帧扫描( )2分钟时间在3赫兹,重复每5分钟包含一个星形胶质细胞,进行之前,期间和之后浴2-AG的应用。

2.4。数据分析

另外电生理数据分析使用程序Igor Pro (Wavemetrics)。EPSP斜率测量作为一个线性时间点之间EPSP的上升阶段对应于20 - 60%的EPSP峰值振幅。EPSP斜率的变化是评价20 - 40分钟结束后配对时期和规范化基线EPSP的斜率。轴突和星形胶质细胞成像数据分析了在Matlab中使用另外的程序。感兴趣的区域包含轴突段自动检测,荧光提取的痕迹。相对荧光变化计算 ,在哪里随着时间的推移表示荧光基线荧光。AP-evoked Ca^{2 +}瞬变是规范化和平均。单一指数符合Ca的衰变^{2 +}瞬变产生了不同条件下的衰减时间常数。

2.5。统计分析

统计分析是使用配对或未配对的学生 - - - - - -测试(单比较)或方差分析与事后Bonferroni调整(多个比较相同的控制)。统计学意义是断言 。数据了 。

2.6。组织学

在实验期间,细胞生物胞素和固定在4%多聚甲醛。片开发avidin-biotin-peroxidase方法和安装在封面幻灯片为重建Neurolucida [24,25]。

2.7。化学物质

化学物质得到下列来源:2-AG和非Sigma-Aldrich, 1 - (2, 4-dichlorophenyl) 5 - (4-iodophenyl) 4-methyl-n - (piperidin-1-yl) 1 h-pyrazole-3-carboxamide (AM251) d-AP5从提升科学、(+)5-methyl-10 11-dihydro -⁵马来酸H-dibenzo [d] cyclohepten-5, 10-imine (mk - 801),并从Tocris L-glutamic酸,吸收FK506 Abmole生物科学。

3所示。结果

3.1。Endocannabinoid-Dependent有限公司需要激活的星形胶质细胞和preNMDARs

t有限公司在鼠桶L4-L2/3兴奋性突触皮层取决于2-AG星形胶质细胞的激活,形成postsynaptically。这个合成发生在突触被激活后大约50毫秒的时间窗内突触后的一代。星形胶质细胞激活导致谷氨酸的释放到preNMDARs与突触前APs引发减少释放概率(8]。进一步理解突触前信号级联导致t有限公司,Ca^{2 +}成像在突触前剑头t有限公司感应是最好的方法。然而,这在技术上具有挑战性,因为它需要成像的突触前溥敦发现突触连接,同时控制AP发射前和突触后神经元。作为一种替代方法,我们测试了,如果直接bath-application 2-AG导致突触抑郁症没有L4-L2/3突触,突触后活动为L5-L5突触(类似于之前描述的4]。我们进行全细胞膜片箝记录从L2/3少年老鼠和躯体感觉皮质锥体神经元的激活L4带刺的星状细胞外刺激神经元轴突的L4。记录基线EPSPs 10分钟后,我们bath-applied 2-AG (10μ米)20分钟,持续刺激突触前为0.1赫兹。我们观察到的长期萧条EPSPs 2-AG冲刷后10 - 30分钟( , , 时间在EPSP斜率的影响的学生的搭配 - - - - - -测试;图1(一))。这种形式的公司是突触前规范化EPSP振幅的降低与减少变异(图的归一化系数1 (b))。

接下来,我们确认2-AG L2/3皮质星形胶质细胞的激活。批量加载与Rhod2-AM星形胶质细胞,是优先被星形胶质细胞,可以测量细胞内Ca^{2 +}动力学在bath-application 2-AG(图1 (c))。我们观察到在Ca的数量显著增加^{2 +}由2-AG瞬变( 来 , , 时间对钙的影响^{2 +}瞬态数量由学生的搭配 - - - - - -冲洗后测试)衰变回到基线水平(图1 (d))。这个实验证实了以前的结果显示,央行调节星形Ca^{2 +}动力学(8,26]。一个星形胶质细胞注入了一个解决方案,加强细胞内Ca^{2 +}集中到一个恒定的水平在相邻废除了eCB-LTD锥体神经元( , , 时间在EPSP斜率的影响的学生的搭配 - - - - - -测试),而控制细胞内溶液注入到星形胶质细胞导致eCB-LTD ( , , 时间在EPSP斜率的影响的学生的搭配 - - - - - -测试;比较控制和Ca^{2 +}夹, 单向方差分析;数据1 (e)和1 (h))。因此,类似于t有限公司,增加Ca^{2 +}信号在星形胶质细胞所需eCB-LTD的感应。

然后,我们测试了在eCB-LTD NMDARs的参与。Bath-application APV阻塞2-AG介导有限公司( , , 时间在EPSP斜率的影响的学生的搭配 - - - - - -测试),而注入MK801 eCB-LTD(突触后细胞没有影响 , , 时间在EPSP斜率的影响的学生的搭配 - - - - - -测试;APV vs MK801相比, 单向方差分析;数据1 (f)和1 (h))。这些结果表明,星形胶质细胞的下游信号所需eCB-LTD突触前NMDARs的激活。

在皮质突触PreNMDAR-dependent有限公司(10)和eCB-mediated有限公司在海马的兴奋和抑制性突触(27,28需要激活的Ca^{2 +}依赖蛋白质磷酸酶钙调磷酸酶(29日]。为了测试一个类似的参与在我们的例子中,我们阻止钙调磷酸酶活动孵化吸收FK506的大脑切片(50μ米)和非创伤(25μM)至少1 h实验开始前和20μ米和10μM,分别在实验。在L4 EPSPs被细胞外刺激诱发,2-AG洗过了20分钟如上所述。在阻止钙调磷酸酶活动的条件,没有eCB-LTD诱导( , ,图1 (g))。这些结果表明,钙调磷酸酶参与eCB-LTD的感应。

总之,我们的实验表明,eCB-LTD和t有限公司分享类似的感应机制,因为两者都依赖于星形胶质细胞激活preNMDARs的央行和激活。钙调磷酸酶的参与表明,海拔在突触前Ca^{2 +}对这些形式的有限公司至关重要。

3.2。突触前NMDARs拓宽AP-Evoked Ca^{2 +}瞬态在L4白斑星状轴突

我们试图调查preNMDAR激活的功能结果,因此Ca的潜在来源^{2 +}有限公司所需L4带刺的星状轴突时激活谷氨酸释放2-AG激活星形胶质细胞。我们加载L4带刺的星状和Ca神经元^{2 +}指示器俄勒冈州绿色Bapta-1 (OGB-1, 200年μM)和形态染料alexa - 594 (50μ米)跟踪轴突L2/3(数字2(一个)和2 (b))。帧扫描1分钟时间(3 Hz)从轴突的延伸进行测量当地的Ca^{2 +}信号之前和期间浴2-AG的应用。一个不良诱发美联社导致刻板的Ca^{2 +}瞬态轴突的隔间。浴应用2-AG没有造成大量的自发的,当地的Ca^{2 +}瞬态轴突的可能是假设从激活preNMDARs(数字2 (c)和2 (d))。我们发现总共有12个自发的Ca^{2 +}在60分钟的观察时间(瞬变 细胞在2-AG的存在)。这个数字并不不同于自发的事件之前2-AG应用程序(8事件40分钟)。然而,比较突触前AP-evoked Ca的时间进程^{2 +}瞬变前后2-AG应用程序显示一个AP-evoked Ca的延长^{2 +}信号在2-AG的存在(图2 (e))。从这个实验我们得出结论,谷氨酸释放星形胶质细胞不激活preNMDARs以类似的方式是轴突谷氨酸释放激活突触后NMDARs,导致清晰和明显的Ca^{2 +}在突触后刺瞬变(30.]。这个结果与观测一致,谷氨酸离子电渗疗法或释放到突触前剑头不会引起Ca^{2 +}涌入(13,14]。我们再次确认这些发现的电离子透入疗法谷氨酸(100毫米)在L4带刺的星状神经元的树突和剑头(图3)。我们观察到明显增加^{2 +}在树突棘,但相比之下,我们不能发现任何Ca^{2 +}海拔在轴突间( 细胞)。此外,单一AP-evoked突触前Ca^{2 +}信号就没有通过阻断NMDA受体的影响。Bath-application APV并未改变峰值振幅的Ca^{2 +}瞬变( , , , 通过学生的搭配 - - - - - -测试),也不是它的衰变( , , , 通过学生的搭配 - - - - - -测试;图4)。因此,preNMDARs没有造成直接的Ca^{2 +}流入到剑头,他们也没有为正常AP-evoked突触前Ca^{2 +}缺乏2-AG动力学。

因此,为了研究这一现象的具体2-AG诱导AP-evoked Ca的扩大^{2 +}详细的信号,我们测量单一AP-evoked Ca^{2 +}瞬变引起在0.1赫兹,刺激频率对应用于有限公司实验(而不是刺激在0.003赫兹,在前面的成像实验)在带刺的星状轴突之前和期间浴2-AG(数据的应用5(一个)和5 (b))。我们平均归一化和相应的Ca^{2 +}瞬变的比较。我们确认2-AG扩大AP-evoked Ca^{2 +}瞬变(图5 (b))。相比之下,在APV面前,2-AG没有影响突触前Ca^{2 +}信号(图5 (b))。安装一个指数衰减的AP-evoked Ca^{2 +}瞬态显示明显慢衰减的2-AG相比的影响存在APV 2-AG (2-AG:规范化 , , 对时间的影响成对的学生的 - - - - - -测试;2-AG + APV:规范化 , , 对时间的影响成对的学生的 - - - - - -测试;2-AG控制与2-AG + APV, 单向方差分析;图5 (c))。规范化的衰减时间常数的分布显示,2-AG扩大了AP-evoked Ca^{2 +}瞬态轴突调查的53%(8 15轴突;平均变化 ),而对其他没有影响(7 15;平均变化 ;图5 (d))。这个观察表明,并不是所有的轴突和剑头由星形胶质细胞活化的影响,主张区分星形神经支配和/或preNMDARs synapse-specific表达式。CB1受体拮抗剂AM251 (5μ米)废除的影响bath-application AP-evoked 2-AG的Ca^{2 +}瞬变(AM251:规范化 , , 对时间的影响成对的学生的 - - - - - -2-AG测试),不包括非特异性效应。此外,重复实验没有任何药物应用程序没有影响AP-evoked Ca^{2 +}瞬变(没有药物:规范化 , , 对时间的影响成对的学生的 - - - - - -测试)证明长期稳定的实验设计,排除任何时间轴突Ca的变化^{2 +}由于Ca缓冲^{2 +}指标。

2-AG诱发释放谷氨酸可能激活神经元树突NMDARs的记录,这可能会影响体细胞膜电位,美联社一代,和体细胞美联社属性。以前,这种somato-dendritic NMDAR激活影响突触前Ca^{2 +}信号在小脑星形细胞(12]。但是,当我们分析了体细胞静止膜电位,美联社振幅,和美联社宽度的soma成像带刺的星状神经细胞,我们发现没有2-AG对体细胞参数(图6)。因此,我们可以排除的作用somato-dendritic NMDARs突触前Ca^{2 +}动力学。因此,我们的实验显示APV-sensitive突触前Ca^{2 +}组件,它表现在扩大AP-evoked Ca^{2 +}瞬变。

最近,这是表明特定的突触前活动模式,组成的一阵APs在100赫兹以上,其次是一个美联社在50到200毫秒后,能诱导有限公司这种形式的公司需要preNMDARs的激活,但并不依赖于星形胶质细胞激活(10]。我们测试是否这种活动模式也导致了APV-sensitive突触前Ca的扩大^{2 +}信号。一阵APs在100 Hz后跟一个美联社50毫秒后唤起一个轴突Ca^{2 +}瞬态更迅速衰减后用APV(图7(一))。Ca之间的区别^{2 +}基线条件下瞬变和APV透露一个APV-sensitive Ca的存在^{2 +}这种突触前刺激模式组件(APV峰基线差异: , , 成对的学生的 - - - - - -测试;数据7 (b)和7 (c))。Ca^{2 +}瞬态诱发3 APs仅在100 Hz没有APV-sensitive Ca^{2 +}组件( , , 成对的学生的 - - - - - -测试)。因此,额外的美联社随后50毫秒后3 APs的破裂导致显著( 通过单向方差分析)额外的突触前Ca^{2 +}涌入,APV被废除。的存在这个延迟4的要求^th美联社表明preNMDARs与压敏电阻器的交互机制由额外的美联社。

总之,我们的实验表明,激活preNMDARs原因放缓AP-evoked衰变的Ca^{2 +}瞬变,导致额外的轴突^{2 +}涌入,内在联系的存在突触前美联社。源的谷氨酸激活preNMDARs可以源自2-AG激活星形胶质细胞或由专门的突触前谷氨酸溢出APs的破裂。

3.3。preNMDARs与压敏电阻器^{2 +}渠道

的扩大AP-evoked突触前Ca^{2 +}瞬态直接可以由于preNMDARs,这可能有助于Ca^{2 +}期间涌入AP-evoked轴突膜去极化的后续救援毫克^{2 +}块。在这个场景中,preNMDARs将函数作为古典巧合探测器,类似于突触后NMDARs所建议。然而,它已经表明,在发育早期preNMDARs可能包含GluN3A亚基,将在很大程度上对Mg^{2 +}块和Ca渗透率较低^{2 +}(18]。的另一种功能preNMDARs可能导致轴突膜去极化的Na⁺流入或施加metabotropic效应在激活。两种机制激活压敏电阻器Ca^{2 +}通道(VDCCs)以外的膜去极化引起的轴突美联社和导致额外的Ca^{2 +}涌入。区分直接Ca^{2 +}与VDCCs涌入通过preNMDARs和交互,我们执行轴突的Ca^{2 +}成像如上所述,并阻止VDCCs(图8)。体细胞APs引发一个一致的轴突^{2 +}瞬态中被废除的存在VDCC-blockers Cd^{2 +}(100μ米)和镍⁺(50μ米)即使体细胞美联社波形保持不变( , , , 通过学生的搭配 - - - - - -测试Bonferroni调整为多个比较)。后续继续体细胞美联社刺激2-AG浴应用程序期间,但仍存在Cd^{2 +}/倪⁺没有发现一个AP-evoked Ca^{2 +}通过preNMDARs瞬态( , 通过学生的搭配 - - - - - -测试Bonferroni调整为多个比较)。这个观察表明,轴突膜去极化不需要分块preNMDARs从一个假定的Mg^{2 +}块来呈现他们为Ca渗透^{2 +}。相反,我们认为需要功能性VDCCs preNMDARs可以延长轴突Ca与它们进行交互^{2 +}涌入。

4所示。讨论

NMDARs ionotropic谷氨酸受体的突触传递至关重要,信息处理和突触可塑性。虽然传统认为是主要位于postsynaptically,越来越多的解剖和生理证据表明NMDARs也有重要作用在突触前网站(2,31日- - - - - -38]。我们调查的功能在少年L4-to-L2/3 preNMDARs glutamatergic连接在躯体感觉皮质。首先,我们表明,活化的星形胶质细胞神经2-AG导致突触前有限公司(eCB-LTD)的一种形式,取决于星形胶质细胞Ca^{2 +}信号和preNMDARs的激活,从而显示一个重叠的感应机制与t有限公司(8]。记录突触前Ca^{2 +}动态感应期间eCB-LTD允许我们调查preNMDAR激活功能的后果。与其他的研究中,我们没有发现证据直接Ca^{2 +}期间通过preNMDARs涌入eCB-LTD感应或谷氨酸电离子透入疗法13,14]。相反,我们的结果表明,preNMDARs导致长期活动的激活VDCCs导致额外AP-evoked Ca^{2 +}通过这些渠道涌入。因此,我们得出这样的结论:preNMDARs有间接影响的作用在突触前Ca^{2 +}瞬变与VDCCs交互。这些发现可以调和的一些有争议的结果关于preNMDARs和符合他们的影响力的电生理学证据t有限公司。

4.1。感应的信号级联t有限公司在发展中皮质突触

这里给出的化学诱导eCB-LTD股票一样的信号级联t有限公司中找到。在t有限公司,欧洲央行2-AG由突触后AP燃烧形成的突触前谷氨酸释放紧随其后。突触后backpropagating美联社唤起突触后增加Ca^{2 +}通过VDCCs被认为主要磷脂酶C (PLC),这是后来由突触前谷氨酸释放激活绑定metabotropic谷氨酸受体类型5(受体)6,7]。在eCB-LTD突触后信号级联是规避。然而,欧洲央行通路下游生产是一样的:在这两种情况下,星形胶质细胞的激活2-AG导致星形胶质细胞Ca的增加^{2 +}活动是必要的。此外,preNMDARs t有限公司和eCB-LTD所需。preNMDARs target-cell-specific方式表达只在突触的子集。这表明preNMDAR-mediated可塑性仅限于特定的神经元连接(19,39- - - - - -41]。因此,我们只发现了一个2-AG诱导Ca的扩大^{2 +}瞬态研究轴突剑头的一个子集。

突触前美联社eCB-LTD感应是一个重要的组件,因为没有与preNMDAR激活AP之间的相互作用,在突触前Ca没有变化^{2 +}信号。这是符合我们之前的观察,当有限公司是直接电刺激诱导的星形胶质细胞(从而绕过神经信号的必要性),该公司仍然需要在星形胶质细胞激活(突触前美联社解雇8]。这个观察现在可以解释说,因为只有与VDCCs preNMDAR的交互,由轴突激活AP,改变突触前Ca^{2 +}动力学。这反过来可能会导致钙调磷酸酶调制和有限公司。有趣的是,取得了非常相似的结果。在第一项研究显示欧洲央行和preNMDARs参与t有限公司,它已经表明,欧洲央行只应用了有限公司如果是搭配突触前活动(4]。此外,eCB-mediated有限公司在海马体的抑制性突触,也需要钙调磷酸酶活性,股票要求美联社射击在突触前神经元的诱导27]。

类似的突触前ionotropic谷氨酸受体的相互作用由星形胶质细胞激活和影响突触释放最近被证明(42]。在这种情况下,轴突AMPARs被证明是由星形胶质细胞激活和去极化导致轴突,扩大轴突美联社,从而影响Ca^{2 +}动力学在突触前的网站。此外,一些研究已经表明,体细胞去极化会导致额外的轴突去极化,使分级,模拟释放发射器(43,44]。重要的是,我们并没有发现影响2-AG体细胞膜电位和美联社属性,从而排除这样一个影响轴突的Ca^{2 +}在我们的实验中信号。

应该注意的是,一个有趣的互动与突触前Ca突触后NMDAR激活^{2 +}动力学也被描述(45]。在海马CA3-CA1突触,流出的钾通过突触后NMDARs提供逆行信号突触前小结,可促进突触前AP-evoked Ca^{2 +}瞬态,增加神经递质释放。然而,我们认为它不太可能类似的机制涉及到突触后NMDAR激活可以解释我们的观察。首先,实验MK801 pre -或突触后神经元表明t有限公司(5,8)和eCB-LTD(本研究)需要突触前,不是突触后,NMDAR激活。这些结果支持的发现t有限公司在发展中视觉皮层L4-L2/3突触细胞类型特异的删除NMDARs打乱了专门从突触前神经元L4 (40]。因此,证据,而非突触后NMDARs参与L4-L2/3有限公司是相当强劲。此外,当potassium-mediated CA3-CA1轴突逆行信号是研究了Ca^{2 +}瞬态扩大由突触后NMDARs只是观察和重复美联社射击在缺乏细胞外毫克^{2 +}(45]。相反,在我们的实验中,Ca的2-AG-mediated扩大^{2 +}瞬态在L4剑头单美联社解雇发生在1 mM细胞外毫克的存在^{2 +}。在我们的实验条件下,射流通过突触后NMDARs钾可能由于Mg最小^{2 +}这些受体。最后,我们注意到,并非所有L4剑头是显示2-AG诱导突触前Ca的扩大^{2 +}瞬态。这类似于观察是什么在L5开发大脑皮层兴奋性剑头(35]。这表明,并不是所有的L4剑头包含preNMDARs。如果突触后NMDARs将负责突触前Ca^{2 +}瞬态扩大如此缺乏的影响在一些剑头很难解释,由于突触后NMDARs广泛表达最多glutamatergic突触(46- - - - - -49]。

最近表明,突触前的APs美联社在50 - 200之间的一个女士后来也可以触发有限公司(p-LTD称为模式依赖有限公司)10]。APs的突触前破裂可能足以导致溢出presynaptically释放谷氨酸preNMDARs,发现p-LTD不再需要支持的星形胶质细胞激活,但仍取决于preNMDARs。大概,一个美联社发生延误时presynaptically释放谷氨酸来自前preNMDARs破裂已激活。一致的,当我们进行突触前Ca^{2 +}成像,我们能够表明p-LTD突触前活动模式诱发一个APV-sensitive Ca^{2 +}组件,而一阵3 APs独自一人没有。因此,preNMDARs不同可以激活依赖于突触前活动的模式,只有为一个额外的Ca^{2 +}在一定条件下涌入。

在这种情况下一个有趣的问题是哪种类型的VDCC preNMDARs调制的吗?先前的实验表明,l型和r和衣架VDCCs是必需的,因为可以诱导t有限公司在这些通道阻断剂的使用一阵3突触后APs后跟一个突触前美联社在-10 ms (6]。单身postprepairings敏感这些VDCCs阻滞剂暗示作用在突触后信号级联(6,7]。因此,N, P / q型VDCCs可能与preNMDARs交互。

我们的数据符合的想法preNMDAR-mediated去极化的终端由轴突Na⁺流入通过受体发挥作用与VDCCs preNMDARs之间的相互作用。一个类似的结论的重要性NMDAR-mediated Na⁺涌入了preNMDARs在自发的突触释放的影响[15]。这种preNMDARs ionotropic效应进一步发现presynaptically MK801应用支持的,作为一个开放的通道阻滞剂和防止通过NMDAR离子流,有效阻断t有限公司(5,50]。同样,突触前MK801应用程序也会影响的直接调制通过preNMDARs [19]。这功效MK801阻碍preNMDAR效应使metabotropic作为最近建议为这些受体(海马有限公司16,51)不太可能因为缺乏MK801块被视为一个标志metabotropic NMDAR函数(但另一种解释方式见下面)。

4.2。相互矛盾的数据preNMDARs的存在

到目前为止,一些研究寻求功能的证据preNMDARs在大脑皮层和得出的结论,不存在这些受体(13,14]。我们目前的结果与早期的发现,提供了另一种解释这个明显的争议。我们的研究表明,preNMDARs不同于古典的功能作为突触后NMDARs描述符合探测器的作用。突触后NMDAR激活需要Mg的缓解^{2 +}块backpropagating美联社supralinearly增强突触后Ca^{2 +}涌入(30.]。相比之下,我们发现几乎没有证据直接preNMDAR-mediated Ca^{2 +}信号。这是符合几个研究的亚基组成preNMDARs发展在大脑皮层突触。在发展中视觉皮层,preNMDARs包含NR3A单元呈现这些NMDARs对Mg^{2 +}和小Ca^{2 +}渗透(18,40]。这两个属性同意我们的发现,没有一个突触前美联社,没有实质性的Ca^{2 +}通过preNMDARs涌入。突触前Ca的缺乏^{2 +}信号iontophoresing谷氨酸的释放到突触前剑头或MNI-glutamate被其他人解释为缺乏preNMDARs [13,14]。然而,我们的研究结果表明,在轴突preNMDARs Ca的效果^{2 +}信号只相当微妙而变得明显在突触前APs特定模式的存在,从而解释明显缺乏preNMDAR活动在其他的研究中。类似的结果被别人当执行Ca^{2 +}成像实验glutamatergic突触上皮层中间神经元:只有长时间轴突与持续激活的APs显然发现了Ca的APV-sensitive组件^{2 +}瞬态(19]。在其他中枢突触,直接的Ca^{2 +}涌入已通过preNMDARs观察表明有一个synapse-specific微分单元组成preNMDARs [20.]。

重要的是,最近的结论t有限公司要求后而非突触前NMDARs不仅仅是基于- Ca^{2 +}成像数据,也缺乏L4-L2/3 t有限公司在转基因小鼠中L2/3 NMDARs是选择性地破坏14]。虽然我们无法解释这种明显的差异,应该注意的是,另一个实验中使用转基因小鼠L4 NMDARs被选择性地破坏还显示而不是破坏L4-L2/3 t有限公司(40),从而说明了潜在的发展,物种特异性,和特定大脑区域差异,这些实验中观察到。

最后,药理学证据最近卡特和Jahr [14]表明的作用机制NMDARs metabotropic参与t有限公司。这个结论是基于应用mk - 801细胞外地无力阻止t有限公司,以及缺乏glycine-site拮抗剂7-CK和5块,7-DCK。发现细胞外mk - 801不阻止t有限公司是截然对立的研究表明有效t有限公司由细胞块应用mk - 8015,50]。再在这方面,重要的是要注意的药理preNMDARs可能不同于“古典”的突触后NMDARs (NR1和NR2包含的)。整合NR3A亚基(大概在triheteromeric NR1-NR2B-NR3A受体(18)可能改变受体药理学(例如,MK801),可能解释这种矛盾的结果(52]。然而,我们的研究结果不能区分ionotropic或metabotropic角色preNMDARs [53]。如果preNMDARs metabotropic函数,它们可以发挥他们的效果直接与VDCCs互动促进Ca^{2 +}大量涌入的失活或突触前K⁺渠道,这两个可以拓宽美联社当地,从而增强突触前Ca^{2 +}涌入(54),这将对钙调磷酸酶所需的信号激活。

5。结论

总之,我们存在的证据显示功能preNMDARs L4-L2/3带刺的星状轴突的突触在发展中鼠桶皮层。他们的功能是感觉从星形胶质细胞释放谷氨酸或溢出的增强突触前活动,然后调整当地的轴突Ca^{2 +}涌入。这个灯可以通过导致当地膜去极化或影响VDCCs metabotropic行动或其他突触前离子电导。要么机制会影响随后的轴突APs通过修改AP-induced Ca^{2 +}动态,从而导致诱导有限公司的行动方式的说明preNMDARs是剩下的理解缺失的片段之一t有限公司在发展中皮质突触的信号级联。

数据可用性

数据可以在请求从相应的作者。

的利益冲突

作者声明没有竞争的经济利益。

作者的贡献

F。N和R。M进行实验。F。N, R。M, T。N分析和设计实验。R。M和T。N写的手稿。 T.N prepared figures. All authors reviewed the manuscript. Florian B. Neubauer and Rogier Min contributed equally to this work.

确认

我们感谢娜塔莉Nevian Neurolucida重构和优秀的技术援助。这项工作是支持的荷兰科学研究组织(m . 863.12.006)和瑞士国家科学基金会(T.N.,格兰特PP00P3_128415)。