文摘
作为内耳的一部分,前庭系统负责的平衡感,由三个半规管,小囊,小囊。越来越多的证据表明,经典之中Wnt / PCP的信号通路中起着重要作用的发展内耳的极性。然而,规范的角色Wnt信号极性的技工还不是完全清楚。在这项研究中,我们发现规范Wnt pathway-related基因表达在开发的早期阶段的小囊,并动态地变化。我们有条件地淘汰β连环蛋白,规范Wnt信号核心蛋白,发现毛细胞的纤毛取向无序与小囊中的毛细胞数量减少。此外,监管规范化Wnt通路(氯化锂和IWP2)体外也会影响头发细胞极性和表明Axin2可能在这个过程中发挥重要作用。总之,我们的结果不仅证实的规定规范Wnt信号影响的小囊中的毛细胞数量也在极性的发展为其提供证据的作用。
1。介绍
耳蜗和前庭是重要的听觉和平衡,分别。他们探测到声音和位置信号通过stereociliary束头发表面的细胞(高碳钢)[1- - - - - -4]。前庭系统包含囊状的斑疹,囊状的斑疹,和三个半规管嵴。平面的极性stereociliary包保证运动检测到适当的范围由前庭高碳钢(5]。在内耳,静纤毛排列在一个提升集群中,毗邻动纤毛(最高的6,7]。stereociliary束的方向相邻高碳钢非常相似。耳蜗相比,人造线(极性倒转,LPR)通过斑疹。斑疹分为两个区域:动纤毛的囊状的斑疹LPR面孔,而动纤毛的囊状的斑疹点远离LPR [8]。
在规范化Wnt通路,Wnt蛋白质结合细胞表面上的卷曲的抑制的活动β-catenin-degrading GSK-3组成的复杂、APC和轴蛋白。β连环蛋白在细胞质中积累,然后转移到细胞核,它控制胚胎发生和细胞命运通过t细胞因子/淋巴enhancer-binding因素(TCF /中位数)。规范化Wnt信号通路及其下游靶基因在细胞增殖发挥重要的监管作用[9- - - - - -13和分化14- - - - - -18]在内耳发育[19),以及在高碳钢的生存20.- - - - - -24)和螺旋神经节神经元(25]。在开发期间,Wnt信号的表达与年龄显著减少内耳(26]。规范化Wnt通路诱导至关重要Pax2-positive耳板细胞形成一个听觉囊(27]。在先前的研究中,我们发现,极性的细条纹在内侧地区发生早于外侧区域,符合增殖和分化在小囊高碳钢(28]。这使我们假设规范化Wnt信号通路参与极性小囊中的发展。在这里,我们发现Wnt pathway-related基因的表达差异在不同阶段的极地形成小囊。我们有条件地淘汰β连环蛋白,一个核心规范Wnt信号通路中的蛋白,在Sox2-positive细胞在小鼠体内。的数量和极性高碳钢也受到了影响。此外,小囊的极性是影响治疗规范化Wnt通路的激活剂或抑制剂在体外,我们发现Axin2可能是一个重要的角色在这个过程(图1)。
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2。材料和方法
2.1。动物协议
所有协议都是动物保健和使用委员会批准的复旦大学耳鼻喉科医院。健康的野生型C57BL / 6小鼠购自上海SLAC实验动物有限公司有限公司(上海,中国)。雌性和雄性小鼠交配在同一个巢E0上午10点并记录。他们分开的第二天上午10点E0.5并记录。反过来,E11.5记录12天,E12.5 13天,和E13.5 14天。我们还在E0.5丝锥进行检测。
Sox2克里尔和Ctnnb1液氧(exon2-6)老鼠复旦大学李由华为提供和维护在混合背景C57BL / 6 j和BALB / C。标准执行PCR基因转基因小鼠的后代。DNA被孤立的酝酿100年的尾巴尖μL直接PCR和蛋白质的混合物K(100: 2)在一夜之间55°C,然后在95°C 1 h。使用的引物如下:GA486 (TGCCACGACCAAGTGACAGCAATG)和GA487 Cre等位基因(ACCAGAGACGGAAATCCATCGCTC),预期的片段大小为300 - 400个基点;R15 (AAGGTAGAGTGATGAAAGTTGTT);猫和R16 (CAC GTC CTC TGT CTA TTC)的β连环蛋白基因敲除基因,与预期片段大小的~ 300和223个基点的突变体和野生型,分别。激活Cre,避免过早堕胎由于它莫西芬,他莫昔芬/孕激素混合物溶解在玉米油(西格玛奥德里奇,圣路易斯,密苏里州,美国;1毫升玉米油:10毫克三苯氧胺:20毫克孕酮)连续2天每天腹腔注射一次。第一天的剂量(E11.5)是0.1μg / g它莫西芬,剂量减半第二天(E12.5)。
2.2。胞果收获
怀孕的老鼠麻醉和杀害。胚胎迅速从子宫中取出,放入冷溶液1×磷酸盐(PBS; )。胞果是解剖显微镜。P1小鼠麻醉和死亡;然后,小囊是收获,耳石被显微镜和收获小囊。
2.3。组织培养在体外
新切割小囊是放置在杜尔贝科修改鹰的媒介DMEM / F12培养基(20%胎牛血清的边后卫,B27(1: 100),链霉素(100 U /毫升))。培养皿培养在37°C,浓度5%的股份有限公司2和湿度为95%。二甲亚砜(DMSO),氯化锂(氯化锂),或IWP2 24小时后补充道。我们对待文化规范Wnt通路的激活组催化剂氯化锂(2.5μ米/毫升)。规范化Wnt抑制剂IWP2 (1.0μ米/毫升)添加到抑制剂组。DMSO (1.0μ米/毫升)添加到组中。最后文化浓度依赖于胞果的生长。培养基是每24小时完全取代,和组织被固定在治疗后的第五天。对所有实验中,三个生物复制使用。
2.4。PCR和RT-qPCR
PCR反应协议如下:在94°C predenaturation 5分钟,32个周期94°C的变性1分钟,退火55°C 1分钟,在72°C 1.5分钟伸长,最后72°C伸长了10分钟。
使用RNeasy微RNA提取的胞果工具包(试剂盒、希尔登,德国),并使用GeneAmp互补脱氧核糖核酸合成®PCR系统9700(美国应用生物系统公司,培育城市,CA)逆转录:42°C 15分钟和5 s的85°C。qPCR反应协议如下:94°C 30年代,紧随其后的是45周期在94°C 5 s和60°C 30年代。每个样品一式三份运行进行分析的目的。PCR循环结束时,熔化曲线分析来验证预期的PCR产物的生成。引物序列在实验室设计和合成了TsingKe生物技术(中国,北京)基于信使rna序列从NCBI数据库获得,如下:
GADPH (F: GCAAGGACACTGAGCAAGA;接待员:GGATGGAAATTGTGAGGGAG)、Apc (F: GCCTGGATGAGCCATTTATAC;接待员:AGTTTCATTCCCATTGTCGT)、Wif1 (F: TTGTACCTGTGGATCGACG;接待员:GGCTTTCCTGAAATCATGTGT)、Camk2d (F: AGATCAAGGCCGGAGCTTA;接待员:CAGAGGCTGTGATACGTT)、Fzd6 (F: CTTCAGTGGCCTGTATCTT;接待员:CCATGTCATCTCCCAGGT)、Axin2 (F: AGAAGAGGAGTGGACGTGTG;接待员:AGCTGTTTCCGTGGATCTCA)、Vangl2 (F: TCTCTGGCCCTGACACATTT;接待员:ACTGAGGAAGAGGGGAGACT)、Prickle2 (F: ATGCCACCTTCTTCCTCCTC;R: AGTAGGTGACAAATGGCCGA)。
2.5。RNA-Sequencing (RNA-Seq)和蛋白质相互作用网络(PPI)
总RNA提取的胞果(E13.5 P1,野生型C57BL / 6小鼠),然后提交给Otogenetics公司(美国亚特兰大,佐治亚州)RNA-Seq化验。我们评估了RNA的完整性和纯度使用安捷伦生物分析仪(美国安捷伦科技,圣克拉拉,CA)。总RNA的互补脱氧核糖核酸生成使用Clontech智能PCR互补脱氧核糖核酸合成的装备(Clontech实验室,Inc .,山景,CA,目录# 634891)。Denville Bioruptor (Diagenode Inc .,新泽西,美国)被用来片段cDNA、安捷伦生物分析仪是用于分析和SPRIworks HT(目录# B06938;美国贝克曼库尔特,帕萨迪纳市,CA)被用来准备Illumina公司库。质量、数量和大小分布的Illumina公司库确定使用TapeStation(安捷伦科技)。
大卫数据库(https://david.ncifcrf.gov/)是一种常用的数据库进行基因分析。使用大卫KEGG通路富集分析,结果的TXT文件下载进行后续分析。Bonferroni测试,值< 0.05组被认为重要,Log2 (fold_change) 1和1之间的值被排除在分析之外。字符串(https://string-db.org/)是用于分析蛋白质间的相互作用。许多信号通路在小囊的发展发挥了重要的作用。为了更好地理解Wnt信号通路的作用,我们只包括Wnt pathway-related基因分析。
2.6。电子显微镜
小囊一夜之间在4°C和2.5%戊二醛固定,然后用2%的丹宁酸和1%锇酸处理。分级乙醇系列用于脱水样品,和液体有限公司2(EM CPD300;徕卡,位于德国)被用来干他们。一个e - 1045溅射涂布机(日立、东京、日本)用于外套标本与100盟。230年11月一个NanoSEM扫描电子显微镜(范,晚宴过后,或者美国)被用来扫描样品。
2.7。包埋疣状
小鼠胚胎在E18.5收获。耳泡切割冷PBS和固定在4%多聚甲醛(美国电子显微镜服务,哈特菲尔德,PA) 1 h在4°C。与PBS洗涤后,小囊驴血清,解剖和屏蔽10%和0.1%在PBS Triton-X 30分钟在室温下,其次是孵化主要抗体稀释在PBS驴血清含5%,0.1% Triton-X隔夜在4°C。第二天,洗后与PBS广泛,组织与二次抗体在孵化1:1000稀释0.1% Triton-X100 (PBS)在室温下2小时。广泛的PBS洗涤后,样本安装在不变色荧光在盖玻片上安装介质(安捷伦科技)。我们使用鼠标反β血影蛋白(1:500;目录# 612562;BD生物科学)主要抗体和Alexa萤石568驴Anti-Mouse免疫球蛋白g (1: 1000;表达载体,卡尔斯巴德、钙、美国)二级抗体。FITC-conjugated phalloidin (1: 1000;英杰公司)被用来可视化肌动蛋白的静纤毛感官高碳钢。
2.8。量化和统计分析
包埋疣状图像获得使用蔡司LSM800共焦显微镜(蔡司、从、德国)40×放大,和整个小囊形象被压扁了原始图像的重叠部分使用Photoshop CS4 (Adobe Systems)。的总体轮廓小囊是缝合共焦图像,和感觉上皮细胞的面积测量使用禅宗图像处理系统(蔡司)。高碳钢在合成图像的数量计算使用Photoshop CS4手动(Adobe Systems)。手机号被LPR在两个区域划分,定义为外侧和内侧区域。头发束取向在三个得分 区域中间的小囊,定义为字段1,字段2,3(图2(一个))。将头发束角测量基于动纤毛的位置(顶端表面spectrin-negative),通过定义0°前顶点和90°外侧,并使用ImageJ64量化(美国国家卫生研究院,马里兰州贝塞斯达)。一个动纤毛能找到直接在电子显微镜标本。使用Matlab和屏幕量角器画图表的角分布。统计分析进行了使用棱镜8 (GraphPad软件公司,圣地亚哥,美国)。小动物——一张长有,未配对的学生的 - - - - - -测试是用来确定统计学意义。 被认为是显著的。数据显示为 。
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3所示。结果
3.1。Wnt信号是活跃在E13.5小囊
我们以前的研究表明,E13.5是极性的形成的关键时期在小囊28]。两个集群的高碳钢相反纤毛开始出现在小囊,逐渐形成LPR。Wnt信号通路对胚胎发育很重要,扮演各种各样的角色在开发过程中在不同的时间点。因此,我们的研究的主要目的是了解Wnt pathway-related基因的表达在早期的小囊。
Wnt5a、Wnt7a Wnt11,β连环蛋白和卷曲的规范/经典之中Wnt信号通路中的重要基因。我们发现这些基因在rt - pcr的小囊。我们的研究表明,这些基因表达的胞果E13.5老鼠(图3(一个))。
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3.2。Wnt信号变化的早期发展的小囊
探索Wnt信号途径活性的变化在早期发展的小囊,RNA的小囊P1和E13.5 RNA-Seq分析提取。
我们的研究结果表明,Wnt pathway-related基因差异表达。E13.5相比,调节基因在P1 Apc, Axin1, Axin2, Camk2d, Rac1, Fzd1, Fzd6, Dvl1, Wif1, Smad4, Wnt7a, Nkd1, Sfrp2, Ryk, Siah1a, Camk2g, Ctnnd2, Rspo3, Ppp3cb, Map3k7, Tcf7l1, Prkacb, Porcn, Cxxc4, Prkaca, Vangl1, Ppp3ca, Senp2, Prickle2, Nfatc1, Nfatc3, Nlk, Fzd4, Rock2, Prkcd, Prkce, Prkcz, Ctbp2, Prkci,小鹿斑比,Mapk8, Csnk2a2, Frat1, Prickle1, Ppard, Gsk3a, Tle1, Tle4, Gpc1, Pygo2 Sdc3, Sdc4。表达下调的基因包括Camk2b Psen1、Ruvbl1 Trp53, Ccnd1, Cacybp, Rhoa, Sfrp5, Csnk1g1, Csnk2b, Sdc1, Bcl9, Gpc2, Gpc3, Lgr5就,Ccnd2, Cby1, Dkk2, Rbx1, Myc, Wnt7b, Ppp3r1, Frat2 Serpinf1, Rhoc(图3 (b))。规范化Wnt信号有一些代表基因,如Apc, Axin2, Wif1。Wnt pathway-related基因的蛋白质相互作用网络显示他们的排名(图3 (c))。最后,我们RT-qPCR用于验证和发现一些典型Wnt pathway-related基因的表达水平不同E13.5和P1(图3 (d))。
3.3。有条件的淘汰赛β连环蛋白影响的数量和极性前庭高碳钢
椭圆囊斑的实验组和对照组 ( )和 ( ),分别 (图2 (b))。在对照组( ),高碳钢的总数 ,与 和 分别在内侧和外侧区域,而在实验组( ),高碳钢的总数 与 和 在内侧和外侧区域,分别 (图2 (c))。在对照组,β连环蛋白基因敲除小鼠仍然显示相对清晰的lpr,两边的高碳钢有大致正常的方向(图2(一个))。然而,值得注意的是,一些高碳钢的方向LPR附近,在提交1和提交2地区,是无序(图2 (d))。
3.4。Wnt信号调节在体外导致胞囊的极性变化
确定的角色Wnt信号通路在高碳钢的极性小囊,我们监管Wnt信号通路活动在体外使用Wnt /β连环蛋白抑制剂(IWP2)和Wnt /β连环蛋白激活剂(氯化锂)29日]。根据日常的观察胞囊的生长,最终文化浓度分别为2.5和1.0μ米/毫升为氯化锂和IWP2分别。
使用扫描电子显微镜,我们发现小囊的极性影响抑制剂和激活剂治疗。相对于对照组(数字4(一)和4 (b)),激活组LPR的位置被改变(图4、“B”)和高碳钢的极性的外侧和内侧LPR添加催化剂后打扰。抑制组,高碳钢的极性的外侧和内侧LPR干扰(图4,一个“B”)。环形直方图的头发束取向也显示(图的差异4 (c))。
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3.5。Axin2却降低了激活和抑制组织信使rna
根据RNA-seq结果和共同Wnt通路基因,RT-qPCR进行检测规范Wnt信号pathway-related基因(Apc, Wif1 Axin2)和卡式肺囊虫肺炎核心基因(Prickle2和Vangl2)在体外培养的小囊探索极性变化的可能机制(图5)。我们发现Wif1减少抑制剂组的表达和激活组增加,而APC降低催化剂组的表达。卡式肺囊虫肺炎核心基因(Prickle2和Vangl2)两组没有明显变化。有趣的是,Axin2的表达在两组降低,表明Axin2可能是一个重要的角色影响胞囊的极性。
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4所示。讨论
胞果是感官平衡的器官。适当的小囊函数取决于头发的极化束位于HC表面。这种细胞极化也被发现在许多上皮细胞类型,包括呼吸气道,侧脑室。胞果的平面极性被描述在三个层面:亚细胞,细胞,tissue-wide [8]。在内耳组织极性只存在于前庭器官。高碳钢,其面向stereociliary包指向LPR在哺乳动物的小囊。LPR在E15在小鼠胚胎(30.]。我们先前的研究发现,高碳钢(E13.5)出现横向extrastriolar地区晚于内侧extrastriolar地区(E11.5)。因此,E13.5是极性的形成的关键时期(28]。在这项研究中,我们对胞囊或E13.5之前,通过添加抑制剂或激活在体外或者通过敲门了β连环蛋白在活的有机体内。结果表明,规范化Wnt信号通路在极性小囊的发展发挥了作用。
Wnt信号是胚胎发育的标志,具有多重功能的发育时间点。Wnt信号通路包括规范和不在经典里的形式。Wnt信号通路研究耳蜗的早期发展。Wnt信号受体(Fzd 1、2、3、4、6, Ryk, Ror2,和Lgr5就)可以发现在老鼠的耳蜗E14.5 [31日- - - - - -36]。Wnt7a的表达,Wnt5a、Wnt2 Wnt10b, Wnt4, Wnt7b, Wnt8, Wnt11可以检测到在耳蜗E15和E1737),有研究表明一个潜在的规范之间的交替和不在经典里的信号通路38,39]。我们的研究还显示权威和经典之中Wnt pathway-related小囊中的基因在早期的发展过程中,和大多数Wnt通路基因也不同的两个时间段E13.5和P1。这些极大地改变基因可能导致有效的增殖,分化,或神经支配。当氯化锂添加到激活Wnt通路在体外Sox2-positive耳蜗细胞的扩散域(E12.5)显著扩大,表明规范化Wnt通路调节的增殖和分化高碳钢在耳蜗的早期发展(14]。此外,过度的β连环蛋白启动增殖耳蜗感觉上皮内的感觉前驱细胞(40]。因此,我们假设Wnt通路可能扮演相同的角色在小囊的早期发展。这是确认在活的有机体内当我们有条件地淘汰β连环蛋白的胞果高碳钢影响麦克风。此外,我们发现头发细胞的极性的变化。
的确,Wnt通路也扮演着重要的角色在内耳极性监管。高碳钢的极性耳蜗主要是反映在他们的融合和扩展,一个相同的纤毛方向在所有高碳钢,v型stereociliary包与一个统一的方向41]。在前庭器官,静纤毛排列和动纤毛位移是依照亚细胞的极性。高碳钢是支持细胞包围,所有高碳钢在这项研究显示方向协调。关于组织极性,纤毛束的高碳钢存在两岸的LPR的脸,或远离LPR。Wnt / PCP通路的作用,经典之中Wnt通路,内耳极性也已经有了很广泛的研究(34,42- - - - - -44]。经典之中Wnt /卡式肺囊虫肺炎主要包括Wnt信号通路蛋白,如Wnt4 Wnt5A, Wnt11 [45]。这些蛋白质激活DEP领域近年来的蛋白质,进而激活下游同源paleogenesis卡式肺囊虫肺炎核心蛋白质,独立的积累β连环蛋白。混乱的头发束是一种常见的Wnt / PCP通路突变体的表型内耳。的耳蜗Wnt5a突变是更广泛和更短,与stereociliary依照亚细胞极性(包错位35]。敲门后Vangl或卷曲的,这是核心的卡式肺囊虫肺炎基因,我们观察到出现了干扰邻近细胞的极性相对一致,而其亚细胞极性保持完整(34,46]。此外,Testin Celsr1, Pk2影响卡式肺囊虫肺炎蛋白分布在门厅细胞极性(44,47,48]。人们普遍认为,卡式肺囊虫肺炎轴建立了经典之中Wnt信号组织极性。因此,值得调查规范是否Wnt信号极性的小囊中扮演一个角色。
我们的研究结果表明,Wnt基因表达在不同的日子小囊Wnt /规范密切相关β连环蛋白通路,比如Axin2。因此,我们怀疑规范化Wnt通路在调节极性也起着重要的作用。规范化Wnt通路与极性的规定在其他器官和动物。当地的激活规范Wnt通路调节神经元极性和轴突的结果(49]。此外,我们先前的研究发现,Rack1参与细胞膜的本地化核心蛋白Vangl2极性,这是与斑马鱼平面细胞极性形成,主要由得罪Wnt /β连环蛋白信号通路(50]。β连环蛋白是蛋白质的核心规范Wnt通路控制下游靶基因的表达。与条件基因敲除的小鼠β背神经折叠的连环蛋白将展览脊柱裂aperta,尾轴弯曲,和尾巴截断(51]。类似的极性变化发生条件基因敲除的小鼠的肾脏β连环蛋白(52]。然而,很少有研究规范化Wnt通路在内耳的极性发展的背景下,尤其是在门厅。Ankrd6不对称地分布在胞囊和调节极性通过抑制Wnt /规范化β连环蛋白信号通路(53]。一些研究人员认为,Wnt /β连环蛋白通路是重要的在地上假说,提出解释LPR在门厅的形成54];然而,这在哺乳动物没有得到证实。Sox2表示整个发展中神经系统和在头发细胞类型的形成过程中发挥作用55]。我们淘汰了β连环蛋白Sox2-positive细胞,发现小囊极性随后影响:有些高碳钢无序的方向靠近LPR在横向和striolar地区。改变极性也发现在体外激活和抑制规范化Wnt通路。改变极性也发现在体外激活和抑制规范化Wnt通路后,和卡式肺囊虫肺炎核心基因均无统计学差异(Vangl2和Prickle2) IWP2治疗或氯化锂治疗在RNA水平,与对照组相比。然而,Axin2出人意料地在两个治疗组下降。Axin2,支架蛋白糖原合成酶激酶3,是负的Wnt信号调节器。此外,Axin2反馈回路和许多在Wnt通路的研究是非常重要的,这可以帮助限制Wnt-initiated信号(56]。Axin2参与发展的恒牙,头发,眉毛和调节颅顶的缝合关闭在头骨开发(57,58]。研究毛细胞,毛细胞的子集来源于Axin2-expressing鼓膜的边界细胞,和Axin2细胞能够分化成头发细胞样的细胞(59]。这些发现可能表明Axin2小囊中的值极性,这需要进一步的研究来阐明。
5。结论
在这项研究中,我们调查了Wnt pathway-related基因的表达变化在早期发展的鼠标小囊。条件基因敲除的β连环蛋白在活的有机体内,我们的数据显示,5月毛细胞数量和主要作用是揭示stereociliary束取向产生影响。结合在体外结果,我们认为规范化Wnt通路控制HC极性在哺乳动物的小囊发展是很重要的。我们的发现可能对前庭极性刺激未来的研究发展。
数据可用性
所有数据用于支持本研究的发现可以从相应的作者。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
Di邓,小青钱,陈Binjun同样这项工作做出了贡献,分享第一作者。
确认
这项研究得到了国家自然科学基金(国家自然科学基金委)(批准号。81771017,81771017,81970889)。