文摘
圆形rna (circRNAs)高纯度在中枢神经系统和显著参与一系列大脑相关的生理和病理过程。缺血性中风是一种复杂的疾病由多种因素引起;然而,无论是脑源性circRNAs参与复杂的监管网络参与中风发病机理仍然未知。这里,我们成功构建了一个大脑中动脉闭塞的脑缺血损伤模型(MCAO)男性Sprague-Dawley老鼠。初步的定性和定量分析卒中后皮质circRNAs通过深度测序,进行rt - pcr和存在被用于验证。24858年circRNAs表示在老鼠大脑皮层,294 circRNAs差异表达在MCAO之间的侧大脑皮层和虚假的鼠群。集群、去和KEGG分析显示,充实的这些circRNAs及其宿主基因在许多生物过程和途径密切相关。我们选择106的294 circRNAs和构造circRNA-miRNA-mRNA交互网络由577海绵microrna mrna和696年的目标。总共15个关键潜在circRNAs预测参与一系列下游靶基因的转录后的调控,广泛涉及卒中后流程,如氧化应激、细胞凋亡、炎症反应,神经再生,通过内源性RNA竞争机制。因此,circRNAs似乎参与多层次调节多种机制的庞大网络的行为和事件发生后中风。 These results provide novel insights into the complex pathophysiological mechanisms of stroke.
1。介绍
缺血性中风后遗症,特点是高死亡率和伤残率,目前全球医学问题和公共卫生挑战1]。缺血性中风的启动因素是组织缺血,造成脑血管阻塞,产生缺血级联(2,3]。缺血级联是一个复杂的一系列事件受到多种因素的影响和分子(4,5]。焦脑灌注不足可能会触发一系列细胞生物能量学失败,诱导会(6),氧化应激(7),破坏微脉管系统(8),破坏血脑屏障功能(9),和缺血后炎症(10),最终导致细胞凋亡(11)和坏死(6)的神经元、神经胶质和内皮细胞。广泛的串扰发生在级联事件(6]。卒中后ATP缺乏会导致线粒体损伤,进一步结合再灌注损伤引发氧化应激在大脑组织。氧化应激,反过来,会加剧现有的线粒体损伤,导致细胞凋亡的启动缺血性凋亡诱导蛋白的释放的核心区域(11]。坏死神经元释放大量的有关分子模式识别的模式识别受体,并激活免疫细胞,如小胶质细胞释放炎性细胞因子(12]。这些炎性细胞因子也招募巨噬细胞启动所谓的炎症级联瀑布效应,进一步加剧大脑中组织损伤(13- - - - - -15]。值得注意的是,缺血级联可以促进或抑制对方。活性氧(ROS)攻击和氧化细胞膜磷脂。这些氧化磷脂被CD36,反过来促进toll样受体2的激活和下游的触发炎症反应(16]。因此,升高的炎症反应表现为协同作用促进活性氧的生产和加剧了氧化应激损伤(17- - - - - -19),而适度的炎症反应或炎症性因素,如肿瘤坏死因子-α和il - 1诱导细胞外超氧化物歧化酶,清除细胞外超氧化物阴离子(20.]。在这一系列的病理过程中,许多生物分子之间的相互作用在不同水平和时空表达导致一个复杂的级联,包括蛋白质的相互作用,基因coexpression和内源性RNA(龙头)竞争监管网络。集体缺血性中风数据提供一个新的视角。他们透露,多个通路参与的病理生理过程通过交织在一起的生物级联网络通过交互和监管的影响在不同分子时空levelof表达式(21,22]。因此,生化级联网络的综合评价与卒中后损伤应该推进我们基本的了解中风的病理生理过程。他们还将提供新的治疗策略的目标,以防止复杂疾病的进展。
圆形(保监会)RNA是一类非编码RNA分子,和每个成员都包含一个共价圆形结构形成的替代back-splicing [23]。他们最初发现于植物基因组和肝炎病毒。这些RNA分子是稳定的,即使在核糖核酸酶的存在R (24,25),因为他们拥有一个圆形结构和缺乏3后盖和多聚腺苷酸尾23,26]。此外,circRNAs之间高度保守的哺乳动物(23,27)和显示组织表达(28]。大脑组织,特别是大脑皮层和小脑,与哺乳动物circRNAs[地区高纯度29日,30.]。此外,保护中枢神经与他们的高表达模式[circRNAs是相互关联的29日]。这些属性提供潜在的应用在神经系统疾病的诊断和治疗。
circRNAs有多个生物功能。首先,circRNAs窝藏大量miRNA-binding网站(25,31日)作为“microrna的海绵”,吸收大量的microrna分子,导致下游靶基因的调控表达(25,32,33]。此外,circRNAs参与许多复杂的疾病,如神经障碍、癌症、心脑血管病,通过龙头、机制(34- - - - - -37]。几项研究已经报道的重大ceRNA-dependent circRNAs参与中风的发展。例如,汉和同事表明circHECTD1的表达显著改变在MCAO老鼠和改善中风的结果通过抑制星形胶质细胞的激活和自噬32]。白等人证明circDLGAP4调节HECTD1通过microrna的表达——143年,影响血脑屏障的完整性为进一步调节脑缺血再灌注损伤(9]。circRNAs通过电抗器机制发挥复杂的监管作用。circRNA可以抑制多个microrna,只一个microrna不能调节几个下游靶基因的表达水平,但也可以由一个或多个circRNAs共同抑制,从而产生一个复杂的电抗器,监管网络。第二,circRNAs还可以促进或抑制其线性宿主基因的表达。举个例子,在circRNA合成、模反向拼接在circRNA合成与经典拼接宿主基因的mrna,影响父母的基因的表达(38,39]。另外circRNAs可以与U1小核糖核蛋白(snRNPs)和RNA聚合酶II对宿主基因的启动子区域采取行动,最终提高他们的转录24,40]。因此,circRNAs可能影响中风的病理生理学通过潜在的广泛的各种各样的网络监管机制。然而,综合监管网络circRNA参与应对目前缺血性知之甚少。
在这项研究中,我们用MCAO诱导脑缺血再灌注损伤的方法,分析了微分皮质circRNAs表达谱在MCAO和虚假的团体之间的皮质早期postischemia伤害(24小时)阶段使用高通量测序。发散rt - pcr和qPCR用来验证测序circRNAs back-splicing和差异表达circRNAs (DECs),分别。去KEGG富集分析应用于预测DECs参与疾病的宿主基因的参与信号转导途径和生物过程。我们进一步预测DECs及其针对性的mrna的microrna吸附,从而构建一个circRNA-miRNA-mRNA监管网络表达可能参与氧化应激反应,细胞凋亡,血管生成和卒中后炎症。总之,全面分析circRNAs中风发生和发展的作用,包括其宿主基因功能和电抗器,监管网络,提供新颖的见解对于中风的预防和治疗。
2。材料和方法
2.1。动物和组
2.1.1。实验大鼠
Sprague-Dawley雄性大鼠(8-9-week-old称重 )购买来自新疆疾病预防和控制中心。22个老鼠编号,随机分配到两组使用一个随机数生成器。总共11个老鼠都包含在MCAO组和虚假的操作组。老鼠的数量决定了用于实验测序和验证需求如下:RNA-seq五,三个TTC染色,和三个圆)染色。激光是用来标记每个老鼠的尾巴来最小化潜在的混杂因素。实验动物实验伦理指南后第一附属医院,石河子大学的学校医学(新疆,中国)。
2.1.2。模型
大脑中动脉闭塞(MCAO)在老鼠大脑生成依照隆等的方法。9,32]。老鼠与戊巴比妥钠麻醉(40毫克/公斤)和固定在仰卧位。常规皮肤消毒和准备后,一个小切口(~ 25毫米)是由左侧颈部中线的直言不讳地单独颈肌肉和暴露的内部和外部的颈动脉,以及颈动脉分叉。一个小切口在颈外动脉,和涂硅MCAO插头(嘉陵江生物技术有限公司,广州,广东省,中国)小心地插入通过颈内动脉大脑中动脉,直到轻微阻力阻止了栓塞。2 h后缺血,再灌注的插头被。MCAO手术导致了左大脑中动脉梗塞大鼠。排除的影响手术的neurobehaviors老鼠,我们建立了一个sham-operated组的手术都是相同的那些MCAO组,除了插头没有进入颈内动脉。
2.2。神经行为评估
得分是由调查人员在再灌注后24 h盲实验MCAO后使用隆分数和提升身体摇摆测试(EBST)评分标准,确保最大模型的有效性和成功(41,42]。MCAO模型组 , ,和重大苍白水肿明显缺血侧大脑的大脑检索的时候,作为一个有效的样本。排除neurobehavior脑出血的影响,入选标准为实验组大鼠还包括蛛网膜下腔出血的缺失。
2.3。组织学MCAO手续
2.3.1。2、3、去除氯(TTC)染色
后立即删除,大脑被冻结20分钟在-20°C。之后,整个大脑组织连续分为冠状切片2毫米的厚度。部分被浸在2% TTC染色染色溶液(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)为30分钟37°C和放置在4%多聚甲醛(Sigma-Aldrich) 24小时确定的规模和程度梗塞的面积。
2.3.2。苏木精和伊红染色())
打开胸腔时,左心房附件被割开,用生理盐水灌注。当污水变成粉红色,4%多聚甲醛(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)最初被用来修复大鼠的脑组织。脑组织取出,放置在4%多聚甲醛,固定24小时在4°C在石蜡包埋。接下来,石蜡包埋的脑组织被切成5μ米部分,用苏木精和伊红染色。图像的彩色石蜡切片在显微镜下得到(奥林巴斯、日本)。
2.4。总RNA提取和circRNA测序
五大鼠MCAO组和5 sham-operated组编号M01-5 (MCAO组)和S01-5 (sham-operated组),分别,这符合选择的标准。与戊巴比妥钠麻醉后,老鼠被斩首,大脑皮层分离在冰和存储在液氮中。使用试剂盒总RNA提取试剂盒(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA),执行和质量控制使用一个安捷伦2100仪器。Ribo-Zero rRNA删除工具包(美国WI震中,麦迪逊)和核糖核酸酶R是用来去除核糖体RNA和线性,分别从高质量的总RNA。总RNA序列进行Illumina公司平台,和原始测序数据处理删除适配器和低质量的序列。高质量的清洁数据比较和老鼠参考基因组注释(ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-95/fasta/rattus_norvegicus/)使用BWA工具43]。为了避免假阳性预测由一个单一的软件,和CIRI find_circ软件被用来扫描测序数据及其交叉结果作为自信circRNA预测(44,45]。
2.5。识别和量化circRNAs
候选人circRNAs选择的基础上,高,中,低表达模式定性和定量验证。rt - pcr与不同引物用于扩大该地区包含back-splicing结来验证circRNAs屈圈法的特征。总RNA reverse-transcribed用随机引物(WI Promega,麦迪逊,美国),和逆转录酶是GoScript™酶混合(Promega)。引物对扩增被Sangon合成生物技术(上海)有限公司,有限公司(上海,中国)。引物序列见表1。EmeraldAmp马克斯PCR反应混合液(RR320A、豆类、日本)是用于PCR与下列参数:初始变性在94°C 3分钟,其次是35周期94°C的30年代,60°C 30年代,30年代的72°C。
存在引物和逆转录反应用于rt - pcr是一样的。执行中存在放大使用结核病绿色®预混料交货Taq™工具(RR820A、豆类、日本)。存在条件如下:50°C 2分钟,然后在95°C初始变性10分钟,其次是40 95°C的周期为15和65°C 30年代。解离曲线开始于60°C。
2.6。DECs筛选和验证
我们标准映射到基因组的测序数据,确定为circRNAs使用特定的软件。标准化的数据被表示为拼接读取每十亿映射(SRPBM)值。的circRNAs随后检查两组之间的差异表达使用DESeq2包r .筛查标准设置为| 和值< 0.05。DECs被确定使用中存在如上所述。
2.7。去KEGG富集分析
GO注释进行了使用一个集群的DECs的筛选。KEGG通路分析使用的DECs KOBAS在线分析数据库(http://kobas.cbi.pku.edu.cn/)。在这项研究中,我们分析的DECs明显的宿主基因,下调从集成RNA-seq数据决定,和一个< 0.05被认为是具有统计学意义的价值。
2.8。circRNA-miRNA-mRNA监管网络的建设
关键微分circRNAs、吸附microrna和目标mrna筛选使用TargetScan软件与至少一个8 mer种子的筛选标准匹配的序列和上下文的分数 。深度测序的microrna和mrna进行使用Illumina公司平台(数据没有显示)。circRNAs和吸附microrna的表达模式以及他们有针对性的mRNA,分析,和microrna的mRNA数据符合circRNA / microrna和信使rna / microrna的表达模式互补的保留。Cytoscape 3.6.1软件应用于构造circRNA-miRNA-mRNA监管网络。
2.9。统计分析
所有的数据的 。集团意味着比较单向方差分析其次是LSD测试使用R包和GraphPad Prism 6.01 (GraphPad, Inc .,拉霍亚,CA,美国)。分析进行了一式三份,所有的实验都重复三次。 被认为是具有统计学意义。所有的存在反应进行了三个生物复制,和表达水平相对于GAPDH表达式计算使用方法。
3所示。结果
3.1。MCAO模型的成功建立和评估脑损伤后缺血和再灌注
系统地研究基因和信号通路激活脑的病变分,我们成功构建大鼠MCAO模型能够模拟早期中风。神经行为,大鼠MCAO组显示无法伸直前肢脑梗死后,和他们没有渴望掌握或落在地面上。相比之下,虚假的组没有显示脑梗死的迹象。前肢能够自然伸直,老鼠有强烈的欲望去抓地上(数字1(一)和1 (b))。隆和EBST成绩进一步表明一个更明显的神经行为赤字MCAO组(图1 (c)、表S1)。氯化三苯基四唑(TTC)染色进行整个大脑,大脑和明显的形态学变化观察组织从MCAO组与虚假的组。脑梗死区域MCAO后水肿和苍白的颜色,而相应的大脑部分区域在虚假的组是红润的颜色没有明显的梗塞的病变(图1 (d))。中风后,皮质是最敏感的组织,被分显著影响。因此,我们执行)染色术后大鼠大脑皮质。梗塞的地区在MCAO大鼠显示病变,包括结构松弛,vacuolar-like变性伴有核凝固,减少神经元的数量(数字1 (e)和1 (f))。神经行为学和形态学检测结果清楚地表明,大鼠MCAO组的典型特征和脑缺血和再灌注损伤的表现。因此,实验模型成功地模拟脑缺血和再灌注损伤,支持其效用在随后的实验。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
3.2。识别和描述circRNAs MCAO的皮质和虚假的组
确定的数量和类型circRNAs表达鼠皮层和识别这些回应大脑分的病理变化,我们进行深度测序circRNAs从10皮层MCAO的样本和虚假的老鼠。总的来说,420636508年和520236256年原始读取生成的脑皮质MCAO和虚假的组,分别。超过99.45%和99.65%的清洁读取可以映射到老鼠基因组后删除适配器和低质量的序列(表S2)。改善circRNA识别的准确性,CIRI和find_circ软件被用来预测circRNAs和circRNAs被都被选中。总共24858 circRNAs被发现,其中只有18.74%的人知道circRNAs和已知的circRNAs(表的信息S3)。促进未来的研究在大脑皮层circRNAs,我们统一更名为命名法和注释的小说circRNAs克隆在这项研究中(表S4)。circRNA读取不同染色体上的分布是决定(图S1A)。circRNA分布在染色体与染色体基因密度,与Y染色体基因密度和最低比例最低的分布式circRNA读取(图S1A)。在长度方面, 是最常位于其实地区,而 主要是源于基因间和内含子区域(图印地)。
为可靠的DECs屏幕,每个样品的测序数据进行一致性和色散。箱形图显示,样本的表达水平相对集中,且没有明显的异常值,表明测序数据重现性好,可用于随后的DECs(图的分析2(一个))。筛选实验表明只有1%的circRNAs两组之间的明显差异表达。作为火山地块(图中描述2 (b)),99%的circRNAs显示无意义的微分表达式。294 DECs进一步聚类分析显示,两组之间的差异表达特征是重要的,并在同一组DECs(图有相似的表达特征2 (c))。与sham-operated组相比,有158 - 136表达下调circRNAs MCAO后的大鼠皮层(表S5)。106年,属于circRNAs coexpressed在两组之间。
(一)
(b)
(c)
验证的准确性circRNA测序数据,我们分类排序circRNAs高,中期,和低表达组。三circRNAs每组随机选择了rt - pcr和存在分析。确认通常圆形九选circRNAs特点,不同引物是专门设计用于放大circRNA地区横跨back-splice结序列(数字3(一个)和3 (b))和PCR产品预期的大小被成功使用不同的引物为每个circRNA(图放大3 (c))。进一步定量分析选择circRNAs显示一致的表达中存在的趋势和测序读(图4),的可靠的测序数据的说明。
(一)
(b)
(c)
3.3。宿主基因去KEGG DECs的通路富集分析
因为circRNAs密切相关的宿主基因的表达和功能(46),宿主基因的功能分析是必要的,以确定的特定角色和监管网络互补circRNA。去分析宿主基因mrna转录的DECs披露基因浓缩的前20项为每个分支的生物过程(BP)(图5(一个)和表S6(图)、分子功能(MF)5 (b)和表S7),和细胞组件(CC)(图5 (c)和表S8)。高纯度的条款在本研究中都是与脑缺血和缺氧的压力的变化密切相关,大脑和神经发育和神经紊乱。其中,术语“钙离子跨膜运输英国石油公司的分公司,““钙通道曼氏金融部门的监管活动,”和“CC的钙通道复杂分支”相关的钙离子跨膜运输。钙离子跨膜运输的中断是直接与线粒体损伤的病理生理过程,包括缺血级联,卒中后氧化应激和炎症反应。此外,术语“蛋白质泛素化”在英国石油公司的分支,在曼氏金融分支机构“ubiquitin-protein转移酶活动”,和“Cul3-RING泛素连接酶复杂”的CC分支与蛋白质泛素化相关,认为是一个关键过程在缺血性卒中后级联反应,具有强大的连接病理生理过程,如细胞凋亡、自噬和炎症。KEGG分析进一步表明,这些宿主基因影响了神经的生理活动。高纯度前20键KEGG通路包括肾上腺素的信号在心肌细胞,营地的信号通路,cGMP-PKG信号通路(图5 (d)和表S9)。在这些途径中,营地,cGMP-PKG PI3K-Akt,中风和MAPK信号是重要的发展和进步。这些结果充分表明,circRNAs高度参与中风的发病机理。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.4。circRNA-miRNA-mRNA监管互动网络的建设
进一步缩小候选人范围的DECs和构造一个生物意义circRNA监管网络,我们删除circRNAs低表达或低频率。总共有106 DECs coexpressed两组被用来构造一个龙头、监管网络。我们使用TargetScan软件选择规范的网站类型(8 mer)和上下文 预测microrna circRNAs以及吸附的mrna microrna的目标受到严格的筛选标准。因此,吸附microrna 651和10822目标基因被确定(表S10和S11)。
提高信心的比例筛选microrna mrna,我们进一步减少的数量microrna circRNAs和吸附的mrna microrna的目标。借助表达式的分析数据circRNAs, microrna, mrna,我们消除一些microrna和mrna表达模式,不符合逆表达式的关系,导致减少候选microrna的数字和目标基因577年和696年,分别。106 circRNAs circRNA-miRNA-mRNA监管网络窝藏,577 microrna和696 mrna最终构造(图6、表S10)。信使rna序列的数据显示,> 90%的696 mRNA被大脑皮层中高度表达,和腺苷三磷酸酶Na+/ K+运输单元α2,最高度表达的基因有490991个。有285和25 mrna和阅读 10000年>,分别。只有68 mrna < 1000读,白介素17 B受体表达水平最低,与365年读(表S11)。我们另外执行组织富集分析使用TissueEnrich (https://tissueenrich.gdcb.iastate.edu/)计划在696年选择基因,他们的大多数高纯度皮层(图S2)。
我们排名的基础上circRNAs吸附microrna和miRNA-regulated基因的数量。十大circRNAs circ_Wdr17_10拥有最丰富的基因信息,circ_Kalrn_2, circ_Bicd1_2, circ_intergenic_3243, circ_Atp6ap2_4, circ_Ankle2_1, circ_Bcat1_2, circ_Camta1_9 circ_Tmprss4_1, circ_Tbcd_12。作为一个例子,circ_Wdr17_10吸附216 microrna mrna和454年的目标。这些关键circRNAs关联到一个大范围的关键功能基因参与缺血性损伤,如HIF-1,bcl - 2,MMP-9,以应对中风microrna的吸附和目标基因的调控。我们的监管网络从而验证circRNAs参与中风通过吸附microrna的直接监管和从一个全面的和多方面的角度有针对性的mrna。
3.5。生物学途径15关键circRNAs MCAO-Induced中风和其监管角色
我们进一步筛选的关键DECs参与详细的病理生理过程中的生物学途径卒中后使用106 circRNAs表达式组成的监管网络,577 microrna和696 mRNA。总共15 circRNAs, 14个microrna和16 mrna,生成一个精确circRNA-miRNA-mRNA监管网络(图7),指的是现有文献后终于选择microrna与mrna参与中风。其中,15 circRNAs可能参与一系列的生物事件,如抗凝剂反应,氧化应激,血管扩张,血管再生,神经再生,卒中后炎症反应,血脑屏障损伤,脑水肿,大脑缺氧,细胞凋亡,轴突生长,通过他们的链接和吸附microrna miRNA-mediated mrna。绑定的microrna的信使rna, circRNAs吸附microrna在“一个到多个”和“多个”模式。例如,circ_Camtal_9同时吸附mir - 320 - 3 - p, mir - 129 - 5 - p, mir - 140 - 5 - p, miR-34a-5p, mir - 145 - 5 - p, mir - 182,和miR-18a-5p,而三个circRNAs circ_Dgkb家族(circ_Dgkb_10、circ_Dgkb_13 circ_Dgkb_14) coadsorb mir - 124 - 3 - p。我们的研究结果表明,circ_Ryr2_23 circ_Gucy1a2_7、circ_Camta1_9 circ_Smad4_4,和circ_Dlgap3_1大脑缺氧反应中扮演关键的角色,通过访问Hif-1神经元氧化应激,联盟和VEGF信号通路(图7)。circ_Snap91_4、circ_Nav2_4 circ_Dntb_10, circ_Camta1_9监管卒中后炎症反应通过吸附mir - 320 - 3 - p, mir - 129 - 5 - p, mir - 103 - 3 - p, mir - 140 - 5 - p, miR-34a-5p, mir - 345 - 5 - p,以及他们有针对性的社会炎症蛋白质,TRL-4, PD-L1, Nurr1 Snrk, AQP4。此外,circ_Dlgap3_1 circ_Tasp1_7、circ_Herc3_2 circ_Chd2_24有针对性的抗凋亡蛋白,bcl - 2,以及凋亡蛋白酶激活因子1,支持他们参与凋亡过程中风后。尽管监管网络是复杂的,动态的,他们的功能是最终与生物学途径密切相关中风,如氧化应激、神经与血管的再生,炎症,血脑屏障完整性,大脑缺氧和脑水肿。
4所示。讨论
MCAO模型被广泛用于缺血性中风的研究。先前记录后,MCAO模型制备方法(32),我们准备了一个大鼠MCAO模型表现出显著的神经行为特征(赤字 和 )。只有雄性老鼠选择使用在我们MCAO后研究考虑到雌激素对脑损伤有不可忽视的影响。在TTC染色实验中,大鼠MCAO组缺血性梗塞苍白显示不同的地区。)染色后,脑梗死模型大鼠显示结构松弛的大脑区域组织,细胞无序安排、神经元数量减少,和明显的(空泡变性和固缩)栓塞样改变。神经行为评分的结果和组织学分析足以支持成功的模型建设及其潜在效用的分析验证。
有限的研究集中在角色的circRNAs中风。段和同事进行高通量测序整个大脑组织梗塞的一边在大鼠MCAO后4天47]。李等人。48]分析circRNAs丘脑梗塞的一边组织7和14天灶脑梗死后老鼠,和Mehta集团使用微阵列检测整个大脑的变化circRNA表达模式在6、12、24小时post-MCAO再灌注后小鼠(49]。伍特斯和他的同事们展示了一个明确的相关性中风严重性在早期阶段,特别是在24小时发作,中风恢复(50),他们验证的重要性早期中风损伤变化和干预中风管理(51]。在RNA-seq实验中,通常至少每组3生物复制工作。然而,这个样本数量不是固定的,可能需要更多的复制根据感兴趣的问题,系统中的方差被检查,以及统计力量,设计者希望实现(47- - - - - -49]。在这项研究中,应用形态学方法来保证工作的准确性和代表性样本,最后每组5生物复制质量测序数据的过滤后被发现(图2(一个))。在目前的研究中,我们应用高通量circRNA测序检测皮质circRNA表达模式在大鼠MCAO后24小时。最敏感的大脑区域脑缺血海马和皮层,和数据挖掘的circRNAs皮质因此损害价值建立机制和自我修复卒中后。大量的研究表明,24小时的时间点是最严重的时间点脑缺血和再灌注损伤后神经损伤(50,52- - - - - -55]。我们发现24858 circRNAs,其中20199是小说和4659是已知的。最终,294 DECs筛选。九circRNAs拥有不同的测序读是随机挑选的,所以和他们back-splice连接验证了与不同引物PCR扩增。随后qPCR分析证实,这些九circRNAs的表达趋势一致的高通量测序数据,支持我们的circRNA测序结果的可靠性。
circRNAs可以影响宿主基因的表达在两个方面。circRNA back-splicing机制在合成与合成mrna的古典剪接机制[竞争38,56]。circRNAs另外增强宿主基因转录与U1小核糖核蛋白交互和RNA聚合酶II在启动子区域(24,40]。因此,澄清的具体角色circRNAs在卒中后,我们去执行和KEGG circRNAs宿主基因的分析,两组之间的显著改变。BP和曼氏金融分支机构的分析,浓缩类别包括泛素化的蛋白质,钙离子跨膜运输、Rac脒基核苷酸交换因素的活动,和蛋白质复杂脚手架的活动。钙离子跨膜运输异常造成的二次伤害,如氧化应激损伤、炎症反应、细胞凋亡、坏死,卒中后(57]。钙离子的稳态变化有直接影响的形成和恢复半影,和半影的存在表明治疗救助理论上卒中后(58]。蛋白质泛素化和自噬Rac信号可能导致凋亡和炎症卒中后(59,60]。KEGG分析,宿主基因circRNAs也丰富的营地,分子,MAPK, PI3K-Akt,和低氧诱导因子信号通路相关的病理生理机制,如氧化应激损伤,线粒体损伤、炎症、细胞凋亡和卒中后神经再生。确定的信号通路和细胞生物过程类似于以前的研究报道在中风(47- - - - - -49]。我们发现DECs在脑缺血/再灌注的早期阶段可以调节宿主基因表达卒中后皮质的二次伤害,提供一种新颖的方向来进行二次损伤机制研究。
circRNAs充当“microrna的海绵”,对众多的下游靶基因起到监管作用[25,32,33]。在这项研究中,一种新型电抗器,监管网络,窝藏15 circRNAs 14 microrna,和16个mrna,最后由指DECs的表达特点和实验miRNA-mRNA交互数据,已经发表在神经损伤和修复领域。这种监管网络可能是参与一系列的生物事件,如抗凝剂反应,氧化应激,反应,血管舒张,神经再生,卒中后炎症反应,血脑屏障损伤反应,脑水肿,大脑缺氧,细胞凋亡,轴突的生长。
stroke-induced最重要的因素是脑缺血和缺氧。特别是,线粒体损伤造成的缺氧能大大提高ROS水平,这引发氧化应激和进一步加剧氧化应激cascade-induced神经损伤。HIF-1a似乎深入参与低氧代谢的规定,和upregulation HIF-1a在缺氧条件下激活mir - 182表达,抑制氧依赖性的HIF-1a降解酶的激活,PHD2富士康,导致不可逆的激活的正反馈循环,促进HIF-1a [61年]。我们推测circ_Dlgap3_1 circ_Smad4_4专门吸附mir - 182和他们导致的增强版本差别明显对这些mir - 182和HIF-1a的激活。此外,upregulation circ_Camta1_9的2.11倍在缺氧条件下导致miR-18a-3p吸收的增加,从而促进其目标基因的表达HIF-1a(62年]。强烈的氧化应激刺激ROS清除机制,circ_Gucy1a2_7和circ_Ryr2_36差别明显对这些超过4倍卒中后可能导致释放吸附miR-7a-5p Keap1的差别和随之而来的对这些基因的转录后的水平。减少Keap1表达促进Nrf-2进入细胞核和激活Nrf-2通路,进而进行清除ROS在大脑中保护脑组织从氧化应激损伤63年- - - - - -66年]。
神经炎症反应在缺血性中风扮演双重角色。严重的炎症反应会引发炎症因素的“瀑布效应”,导致进一步的细胞损伤,细胞凋亡,血脑屏障破坏和脑水肿,而适时的和适度的炎症反应产生一种保护作用对中风。地,一个先天免疫的重要调节器,激活了NF -κb通路通过下游MyD88通路引发卒中后炎症风暴(67年,68年]。在这里,我们表明,调节circ_Camta1_9多个microrna的结合位点,可能会影响一些炎症相关的基因,如地,PD-L1,AQP-4,Nurr1。circ_Camta1_9 circ_Dtnb_10可能一致行动作为分子海绵mir - 140 - 5 - p,下调表达,促进卒中后地水平,从而加剧炎症(67年]。此外,circ_Camta1_9可能上调PD-L1表达式通过吸附miR-34a-5p [69年]。交互的PD-1 PD-L1抑制Treg-mediated neutrophil-derived MMP-9中风后释放。这种抑制作用降低了缺血后血脑屏障的破坏,白细胞浸润,脑损伤(70年]。Nurr1是孤儿核受体广泛分布于脑组织作为强有力的炎症调节器nonneuronal细胞,如小神经胶质细胞和巨噬细胞(71年]。Nurr1-CoREST轴在神经炎症过程中,可能扮演重要的角色在终止炎症反应通过清除p65从目标启动子(71年]。本研究的数据表明,upregulation circ_Camta1_9和circ_AABR07049790.1_16抑制卒中后炎症通过吸附mir - 145 - 5 - p和随之而来的upregulation Nurr1 [72年]。
我们确定几个circRNA主机PI3K-Akt通路中的基因丰富,表明卒中后circRNAs特异表达有可能采取行动PI3K-Akt信号通路。在生物信息学分析,多个circRNAs影响PI3K-Akt通路中被确认。保监会_Nav2_4 circ_Gucy1a2_7,保监会_Snap91_4,保监会_Camta1_9预测调节PTEN通过吸附mir - 320 - 3 - p目标(73年]。PTEN抑制轴突和轴突再生通过抑制PI3K-Akt通路的激活74年]。此外,mir - 320 - 3 - p还可以针对igf - 1 (75年]。igf - 1调节大脑可塑性的影响神经突生长、突触形成,神经元兴奋性,和神经递质释放76年]。circRNAs原始的DGKB基因(circ_Dgkb_13 circ_Dgkb_14和circ_Dgkb_10)集体目标通过mir - 124 - 3 - p SOX9,从而影响轴突崭露头角的卒中后(77年]。
细胞凋亡是细胞死亡的主要病理生理模式中风之后,尤其是在半影立即毗邻缺血性核心(11]。在我们的研究中,apoptosis-related信号通路的同时丰富和KEGG分析。bcl - 2是一种抗凋亡蛋白,抑制细胞色素C的释放在凋亡过程中线粒体通过抑制巴克斯和贝克。释放细胞色素C与凋亡protease-activating因子- 1和pre-caspase-9 apoptosomes形式,启动下游凋亡过程(11]。bcl - 2可以调制mir - 148 a - 3 - p和mir - 181 a - 5 - p,分别为(78年- - - - - -80年]。我们circRNA_miRNA目标预测结果表明,circ_Tasp1_7 circ_Herc3_2可以有效地结合mir - 148 a - 3 - p和mir - 181 a - 5 - p,分别。上述数据表明,circ_Tasp1_7和circ_Herc3_2扮演监管角色进入bcl - 2信号通路在细胞凋亡。我们另外预测upregulation circ_Chd2_24可以通过吸附miR-23a-3p移植细胞凋亡protease-activating因子- 1。虽然具体机制尚未建立,mir - 124也调节antiapoptosis bcl - 2蛋白和Bcl-xl卒中后,对凋亡的影响81年]。此外,中国保监会_Nav2_4 / mir - 129 - 5 - p / HMGB1信号通路在本研究的基础上,预测他们的互动表达模式和发现HMGB1的直接目标mir - 129 - 5 - p (82年,83年]。HMGB1是一个重要的染色体外的蛋白质释放核受体结合形成先进的糖化终端产品和影响中风后的炎症过程。最后,对神经行为评分和circRNA表达之间的关系,我们进行了一项临床研究,分析之间的关系的表达关键circRNAs和中风疾病的严重程度和预后。临床试验的结果将发表时完成。
缺血性中风是一个复杂的多因素疾病中,缺血级联反应不是一个单一的线性过程,但往往涉及到平行或与其他交互机制和事件(3,4,17]。一系列重大事件,如缺氧、氧化应激、线粒体损伤、炎症、坏死,细胞凋亡,不仅相互使役动词,但也产生相反的神经保护或伤害的生物效应,最终影响疾病的预后和结果,根据各种因素的联合行动21,84年]。我们的实验显示显著差异表达模式circRNAs缺血性中风。这些circRNAs参与各种机制和缺血性事件的级联通过宿主基因在转录水平的规定,影响poststroke-related信号通路参与主要病理机制,电抗器,机制,调节下游靶基因的转录后的水平。针对中风的动态复杂性发展,探索复杂网络涉及多个分子的机制和途径,以及各种监管水平和因素,可能会提供一个更广泛的角度全面了解这种疾病。
5。结论
我们的发现集体展示表达模式的改变无数circRNAs卒中后皮质的老鼠。第一次circRNA-miRNA-mRNA的潜在角色和下游监管网络通路参与氧化应激、炎症反应、细胞凋亡和再生在中风发展已经突出显示。的变化和功能的全面调查circRNAs缺血性中风后应该帮助阐明分子机制中风和允许发展的有效的治疗选择。
数据可用性
为本研究可以发现生成的数据集在短期读取存档(SRA)的国家生物技术信息中心(NCBI) bioproject PRJNA690203数量(下https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA690203/)。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关的出版。
作者的贡献
Chengtan王、杨育英Mengsi徐贡献同样这项工作和分享第一作者。
确认
本研究支持的资助的培训青年科技骨干人才兵团区域创新指导程序(没有。2021 bb002)和中国自然科学基金会(没有。31760662和31760662)。
补充材料
以下是网上。图S1: circRNA读取的分布。图S2:组织选择基因的浓缩。表S1:神经行为评分和性能的选择大鼠MCAO组和虚假的集团。表S2:总结从大脑皮层组织映射数据。表S3: circRNA_known。表S4: circRNA_newname。表S5: DE-circRNAs。表S6: Biological_Process_enrich。表S7: Molecular_Function_enrich。 Table S8: Cellular_Component_enrich. Table S9: KEGG_pathway_enrich. Table S10: cyto-scape_circRNA-miRNA-mRNA. Table S11: expression of select mRNAs.(补充材料)