文摘

有效的治疗仍缺乏对神经性疼痛(NP),一种棘手的痛苦。低强度聚焦超声(LIFU),无创,尖端神经调节技术,可以有效地增强抑制中枢神经系统(CNS)和降低神经兴奋性。我们调查的影响LIFU NP和氯化钾转运蛋白2 (KCC的表达₂)在大鼠的脊髓和周围神经损伤(句)腰椎4-lumbar 5(- 5)部分。在这项研究中,老鼠收到句手术在右小腿其次是LIFU刺激脊髓的- 5部分的4周,术后3天开始。我们用爪子取阈值(佩恩表的编制者的50%₅₀)来评估机械触诱发痛。免疫印迹(WB)和免疫荧光(如果)被用来计算表达式的磷酸化细胞外signal-regulated激酶1/2 (p-ERK1/2),钙/ calmodulin-dependent蛋白激酶IV型(CaMKIV)磷酸化环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(p-CREB),和关注₂在- 5部分脊髓后行为测试。我们发现,佩恩表的编制者₅₀减少( )3天LIFU post-PNI手术⁻和LIFU⁺组织和增加( )经过4周的LIFU刺激。的表达p-CREB和CaMKIV下降( )和关注₂增加( )经过4周的LIFU刺激,但p-ERK1/2 ( )是不受影响。我们的研究表明,LIFU能够有效地缓解NP行为与句老鼠通过增加关注的表达₂在脊髓背侧角神经元。一个可能的解释是,LIFU CaMKIV-KCC的激活可能会受到抑制₂途径。

1。介绍

神经性疼痛(NP)被定义为疼痛来自初级躯体感觉系统的损伤和功能障碍,要么在外围或中央层面(1]。许多研究已经开展了关于这种类型的疼痛,已经取得了一些进展,但仍有许多挑战在NP的临床治疗2]。主要临床表现包括自发性疼痛,持续性或阵发性疼痛,引起疼痛、感觉异常,麻木和刺痛2,3]。耐火材料和慢性疼痛,可以体现在各个方面,包括慢性下腰痛或坐骨神经痛,NP是一个严重的问题。它影响着全球-10%的人口6.9%,严重减少了病人的生活质量2),增加患者的经济负担的家庭和社会4- - - - - -6]。

NP的病因和机制是复杂的,不清楚。最近,越来越多的证据表明氯化钾的差别表明,对这些转运蛋白2(关注₂)在NP脊髓中起着重要的作用。KCC₂是一个离子转运蛋白存在于成熟神经元的中枢神经系统(CNS)和删除Cl吗⁻从细胞质到细胞外空间7]。周围神经损伤后(句),关注的表达₂神经元细胞膜上表达下调,Cl的浓度⁻([Cl⁻]_我)在神经细胞调节,从而减少神经传递素的抑制作用γ酸氨基丁酸(GABA) [8- - - - - -10]。GABA,主要的抑制性神经递质在成熟的中枢神经系统11),可以绑定到GABA受体(GABA-R)促进神经突触后膜的去极化和调解超极化和神经元的活动12]。功能障碍GABA-R最终减少抑制脊髓,导致超兴奋性低门槛的初级传入神经元和激活机械感觉输入。同时,初级传入神经元只应对高阈值(疼痛的)输入在正常情况下,造成机械触诱发痛和NP (13,14]。NP已成功诱导大鼠注射microribonucleic酸(microrna的),这妨碍了转录的关注₂或关注₂抑制剂(15,16]。所有的差别的结果表明,对这些关注₂后句在NP的发展中扮演着重要的角色17]。许多研究发现,增加关注的表达₂显著减轻NP行为(9,18- - - - - -20.]。因此,学习如何增加关注的表达₂后句治疗NP有巨大的潜在价值。

句之后,疼痛的刺激的差别会导致对这些关注₂表达式通过一系列细胞内级联的脑源性神经营养因子(BDNF),原肌球蛋白受体激酶B (TrkB)途径21,22]。钙/ calmodulin-dependent蛋白激酶IV型(CaMKIV)磷酸化的环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(p-CREB)和磷酸化细胞外signal-regulated激酶1/2 (p-ERK1/2)发挥重要作用的激活BDNF-TrkB通路级联的差别,对这些关注₂表达式[10,23,24]。里维拉在转基因老鼠证实TrkB受体的激活脑源性神经营养因子进一步抑制表达关注₂通过在转录水平 (23]。最近,研究还发现,伤害感受如句或炎症可以激活ERK-mitogen-activated蛋白激酶(MAPK)通路在脊髓背角,移植细胞内p-ERK1/2表达式通过Ras⟶p-ERK1/2级联反应,和抑制的表达关注₂在转录水平,最终导致NP (23,25,26]。因此,CaMKIV-KCC₂或p-ERK1/2-KCC₂通路起着至关重要的作用在句后NP发病机制(图1)。

目前,由于其复杂的机制,仍然没有满意的治疗NP (27,28]。在临床水平,传统的止痛药如三环类抗抑郁药、抗惊厥药物,非甾体类抗炎药(非甾体抗炎药),抗癫痫药物,和弱和强阿片类药物通常用于缓解症状,但疗效较差,许多副作用28- - - - - -30.]。因此,找到一个合适的康复方法NP将有很大的临床意义。作为一种非侵入性神经调节,低强度聚焦超声(LIFU)已经确认安全的调制与癫痫发作的大脑活动的病人和动物(31日),阿尔茨海默病和痴呆(32),创伤性脑损伤(TBI) (33),和抑郁34]。LIFU neuromodulatory机制包括机械,热,和空化效应35]。LIFU机械效应的神经调节中起着重要的作用,及其机制可能是细胞膜的双分子的结构声辐射力量通过机械振动拉伸,从而干扰细胞膜上的机械敏感离子通道并产生相应的生物效应(36,37]。有趣的是,王等人应用LIFU癫痫大鼠中枢神经系统的异常,发现它可以抑制癫痫放电通过激活gaba ergic神经元在中枢神经系统38]。

然而,脊髓刺激是否LIFU可以增强抑制作用和减轻NP仍不清楚。在这项研究中,我们松散的结扎右侧胫神经和腓总神经在老鼠模型来创建一个句。LIFU刺激后- 5脊髓节中,我们使用了50%爪取阈值(佩恩表的编制者₅₀)来评估老鼠的机械刺激阈值;世行如果被用来检测p-ERK1/2的表情变化,CaMKIV, p-CREB和关注₂在腰椎脊髓。

2。材料和方法

2.1。动物

我们一共获得了40名健康男性Sprague-Dawley (SD)大鼠(体重220 - 300克)从昆明实验动物中心(昆明,中国)用于实验。所有老鼠都有 在12 h反向光/暗周期在单独的笼子里每笼老鼠(5),免费获取食物和水。所有动物协议是昆明医科大学动物伦理委员会的批准。KMMU2020352)。

2.2。分组和实验设计

1周的适应后,所有老鼠被随机分为四组(每组10):正常组,老鼠接受了手术和治疗;虚假的集团,根据句老鼠的神经受到手术方法但不结扎;和LIFU⁻集团和LIFU⁺组大鼠接受句并行手术和LIFU刺激,除了超声(美国)放大器总是关掉LIFU治疗期间⁻组。

2.3。句NP的模型

我们开发了句模型使用选择性神经损伤(SNI)方法严格按照文献[39]。老鼠被腹腔麻醉(i.p)注入1%戊巴比妥钠(40毫克/公斤)。我们剃毛对膝关节的近端,1厘米的切口。肌肉分离坦率地说,一层一层地,其次是曝光正确的坐骨神经的三个分支:胫神经、腓总神经、腓肠神经。常见的腓骨和胫骨神经与4 - 0松散的结扎丝在三个地方1毫米的间隔。我们认真执行操作在结扎,以避免腓肠神经受伤。对坐骨神经的分支机构接触但不结扎在虚假的组大鼠。

2.4。LIFU刺激脊髓- 5部分

LIFU刺激开始句手术后第三天在09年的时间范围:00-15:00(图2(一个))。后管理轻度混合与异氟烷麻醉和戊巴比妥钠,我们固定的老鼠在桌子上和应用脱毛霜把皮毛背上,暴露- 5脊髓段。传感器固定在这段,皮肤上覆盖,换能器差距满一个超声耦合剂(Aquasonic;帕克实验室、费尔菲尔德,美国新泽西)没有泡沫。参数如下:正弦脉冲波的频率,4 MHz;工作周期(DC), 20%;脉冲重复频率(脉冲),0.8千赫;辐照强度、0.65 MPa;和治疗时间,20分钟/ d为4周。我们校准光束的照射强度使用水听器(曼0500; Onda, Sunnyvale, CA, USA).

2.5。组织准备

最后LIFU治疗和行为测试后,老鼠通过过量牺牲1%的戊巴比妥钠(40毫克/公斤),世行和组织是收获( )如果( )染色分析。白平衡,我们迅速收集- 5脊髓部分组织和存储在−80°C到使用。如果、老鼠和200毫升prechilled 0.9%生理盐水灌注(4°C),然后150毫升prechilled 0.1磷酸盐缓冲剂(pH值7.4)含有4%多聚甲醛(4°C)。我们收获- 5脊髓部分,固定在4%多聚甲醛在一夜之间在4°C,分别和脱水的片一个接一个24小时使用20和30%蔗糖0.9%生理盐水。嵌入的最佳切削温度后(10月)化合物,横断面切片(8 - 12μ米厚)用于如果或脊髓的苏木精和伊红染色())。

2.6。LIFU安全评估

我们执行)染色评估脊髓LIFU的安全。部分准备根据以下程序:固定30年代,在水中清洗5分钟,5分钟的苏木精染色解决方案,在1%酸性乙醇浸渍五次,与伊红染色解决方案2分钟,浸在酒精分级(从高到低浓度)每级5分钟,洗水15分钟,脱水和分级(从低到高的浓度)酒精,在树脂与二甲苯清理,安装。我们使用了一个数码显微镜观察)染色的结果。

2.7。测量机械触诱发痛

行为测试被调查者在受控的环境中执行对动物治疗也不清楚。每个老鼠都单独放在一个金属网笼( )适应环境,允许在测试前20分钟。我们使用了上下测试佩恩表的编制者的方法₅₀按照文献[40]。一系列•冯•弗雷(VF)丝(美国Stoelting、木材Dale, IL)与提升程度的刚度(1.4、2.0、4、6、8、10、15和26 g)被用来刺激侧表面足底句爪子。第一VF灯丝使用6克丝,和适当的力量被用来弯曲长丝5 s。舔、取消或删除爪子被认为是一种积极的反应。根据正面或负面的反应,我们应用一个灯丝在更大或更低程度的力量。佩恩表的编制者₅₀计算如下:

佩恩表的编制者₅₀测试执行presurgery 1天,1天/执行和pre-LIFU刺激周LIFU刺激期间。

2.8。西方墨点法(WB)分析

脊髓组织(0.1 g)解剖,通过我们变均匀,细胞溶解与radioimmunoprecipitation化验(里帕)缓冲区(里帕: )30分钟在冰上,离心机在12000 r / min 30分钟在4°C;然后,我们在上层的收获。总蛋白浓度是通过bicinchoninic酸(BCA)量化分析工具(生物医学,北京),和所有的样本都统一到30μ克/ 10μ(总蛋白,30 l。样品μg)解决了6%、10%、和12%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds - page)和转移到聚乙二烯二氟化物薄膜(PVDF)(美国马MilliporeSigma,伯灵顿)。我们封锁了膜5%脱脂牛奶在室温下(RT) 2 h,然后孵化他们一夜之间主要抗体在4°C温柔的颤抖。这些抗体包括单克隆抗体(mab)对CaMKIV (1: 2000;Abcam,剑桥,英国),p-CREB (1: 1000;细胞信号技术(CST),丹弗斯,妈,美国),p-ERK1/2 (1: 2000;春秋国旅),和关注₂(1:1000年,春秋国旅),以及3 -磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH);1:50000;美国ABclonal技术、沃本MA)β肌动蛋白(1:2000;圣克鲁斯生物技术、达拉斯、TX,美国)。二次抗体膜被孵化,辣根过氧化物酶,(合)标记anti-rabbit / anti-mouse免疫球蛋白G(免疫球蛋白)HRP-linked抗体(1:2000;春秋国旅),在rt,最后90分钟,我们可视化和量化蛋白质乐队使用增强化学发光(发射极耦合逻辑;Tanon,中国上海)和一个ImageJ软件(美国国家卫生研究院(NIH)的贝塞斯达,医学博士,美国)。蛋白质是规范化的基础上β肌动蛋白或GAPDH浓度。

2.9。免疫荧光染色(如果)

如果,每个片被磷酸盐(PBS) 10分钟RT然后孵化山羊血清和0.03% Triton x - 100 5% 0.1 PBS 2 h。然后,我们孵化主要关注抗体的片₂和p-CREB(分别为1:100和1:800;春秋国旅),以及抗体NeuN(1: 1000年,Abcam),一夜之间在4°C。二次抗体(anti-rabbit免疫球蛋白(重+光(H + L)链],F (ab)2片段(Alexa萤石488共轭);anti-mouse免疫球蛋白(H + L链),F (ab594)2片段(Alexa萤石共轭)被用于孵化2 h RT在黑暗中。与PBS三10分钟后洗,我们孵化与4部分 ,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI;中国,北京,Solarbio)。荧光显微镜下图片被抓获(奥林巴斯(Olympus Corp .)、东京、日本)。我们使用ImageJ软件(美国国家卫生研究院(NIH)的贝塞斯达,医学博士,美国)量化的密度积极的地区。

2.10。统计分析

数据了 (SD)。我们使用SPSS 23.0版(美国纽约阿蒙克的IBM公司)统计分析。GraphPad棱镜软件8.0版本(GraphPad软件公司,圣地亚哥,美国)是用于生成图表。验证所有数据正态分布后,我们用单向方差分析分析佩恩表的编制者(方差分析)₅₀,白平衡,如果数据。 被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。)- 5脊髓部分染色观察LIFU刺激的安全

我们没有看到肿胀或核碎片的神经元,嗜中性粒细胞浸润或出血,横向放大率(图3(一个)×40;图3 (b)×100)脊髓节。

3.2。LIFU减轻机械触诱发痛模型大鼠句

如图2(一个),我们使用佩恩表的编制者₅₀评估LIFU刺激对大鼠句的影响在不同的时间。前一天LIFU刺激,佩恩表的编制者₅₀显著降低了 (LIFU⁻集团), (LIFU⁺集团) 和 ,分别为(P< 0.05),但两组之间没有统计上的显著差异( )。LIFU刺激后,佩恩表的编制者₅₀逐渐增加,最终成为LIFU更高⁺集团( )比LIFU⁻集团( )经过3周的LIFU刺激( )和保持稳定的LIFU刺激。然而,它仍然是在正常和虚假的操作组( ),没有显著差异( ;图2 (b))。

3.3。LIFU刺激增加了关注₂- 5脊髓节表达

4周后LIFU刺激,老鼠都牺牲了,- 5脊髓节收获WB(图4(一)如果(图)5(一个))分析。结果表明,表达式的关注₂LIFU蛋白质的老鼠⁺组调节LIFU相比⁻集团( )。没有区分正常和虚假的组( ;数据4 (b)和5 (b))。

3.4。LIFU刺激减少CaMKIV的表达和p-CREB p-ERK1/2的但不是- 5脊髓段句老鼠

句激活MAPK通路,导致高表达CaMKIV p-ERK, p-CREB [41]。在这项研究中,世行(数字4 (c)- - - - - -4 (h))表明,CaMKIV的表达、p-ERK1/2 LIFU p-CREB增加⁻组。LIFU治疗4周后,CaMKIV的表达和p-CREB与LIFU相比有所下降⁻集团( ;数据4 (f)和4 (h))。如果还显示,p-CREB的表达减少LIFU刺激后4周与LIFU相比⁻集团( ;图5 (d))。有趣的是,没有统计LIFU之间的差异p-ERK1/2表达式⁻和LIFU⁺CaMKIV团体,也没有任何显著差异,p-ERK1/2或p-CREB表达式之间的正常和虚假的组( ;数据4 (d),4 (f),4 (h))。

4所示。讨论

氯化钾(K⁺cl⁻)转运蛋白2(关注₂氯化)是唯一的阳离子转运蛋白表达的哺乳动物的神经元。它扮演了一个重要角色在维持低(Cl⁻]_我GABA的功能,这是必要的_一个和甘氨酸受体(GlyRs)和调节脊髓抑制(8,10]。在鞘内应用的关注₂抑制剂(2 - [[(2 s) 2-butyl-6 7-dichloro-2-cyclopentyl-1-oxo-3H-inden-5-yl)氧),或DIOA), heat-evoked撤军延迟和无害的刷刺激显著降低(16,42]。我们的实验数据表明,关注₂句组中表达下调,佩恩表的编制者₅₀也在这一组低于正常的和虚假的操作组。所有结果表明句的差别导致了对这些关注₂表达式,它削弱了GABA_一个/ GlyR-mediated抑制然后导致NP (43]。所有上述变化是NP的开发和维护的重要因素。为了进一步研究NP的机制,我们发现加强关注₂功能药物恢复脊髓抑制和减少触诱发痛(9]。在我们的研究中,疼痛行为改善(图2 (b)),和关注₂表达式是调节(图4 (b)4周后)LIFU刺激。因此,关注的表达₂在脊髓NP的发病机制中扮演了重要的角色,和upregulation的关注₂表达式可能会缓解NP。

的差别在句后,对这些关注₂密切相关的激活BDNF-TrkB通路和细胞内的级联反应由CaMKIV p-CREB, p-ERK [21- - - - - -24]。鞘内应用TrkB拦截器的差别极大地提高了对这些关注₂表情脊髓背角神经元的膜炎症引起的疼痛(44]。在Kitayama的研究,短核RNA)被用来降低锌transporter-1 (ZnT-1),导致BDNF-TrkB通路的抑制,downregulation p-CREB, upregulation关注₂,改善提取阈值(19]。p-ERK阻滞剂鞘内注射后,引起的慢性NP铂也明显减轻大鼠(45]。Lopez-Alvarez和李应用电针刺激刺激大鼠慢性收缩损伤(CCI),发现它可以有效地提高关注₂表情,机械撤出阈值,和热延迟撤军(18,20.]。因此,抑制由CaMKIV BDNF-TrkB通路和级联反应,p-CREB,和p-ERK upregulation的关注₂表达,能有效地缓解NP。在这项研究中,我们与LIFU刺激脊髓,证实LIFU治疗NP的功效。据我们所知,本研究首先使用LIFU刺激脊髓为了调节NP。

此外,我们发现CaMKIV和p-CREB表达下调(数字4 (f),4 (h),5 (d)),关注₂调节(图4(一)和5 (b)LIFU刺激后)。Upregulation的关注₂表达式可以减少神经(Cl⁻]_我,增加GABA的影响,加强对脊髓中间神经元的抑制作用,使脊髓感觉神经元的痛阈降低和病理性疼痛的行为是松了一口气7,46]。因此,我们推测,LIFU可能减轻病理疼痛由于句通过抑制CaMKIV KCC p-CREB表达式和移植₂表达在神经元。

有趣的是,LIFU刺激并没有改变的表达的脊髓p-ERK1/2句老鼠(图4 (d))。虽然确切的底层机制是未知的,有几种可能的解释。首先,在NP鼠模型,BDNF-TrkB通路可以激活CaMKIV通过增加钙的浓度^{2 +}通过PLC在神经元γ知识产权₃通路,而p-ERK通过TrkB-Ras通路激活(22,26]。第二,CaMKIV激活依赖于钙的浓度^{2 +}在神经元。的机械部队LIFU会影响电压门控钙和钠离子通道(VGCCs VGSCs)质膜(35,47),导致细胞内钙瞬变^{2 +}浓度的变化在不同的细胞(48]。这种机制可用于治疗如间充质干细胞(MSC)导航(36),在大脑中神经调节(47),或与肿瘤免疫治疗我们(49]。因此,我们建议LIFU可能影响CaMKIV激活通过干扰的瞬时浓度Ca^{2 +}在神经元,但不影响p-ERK1/2表达式。然而,具体的作用机制尚不清楚,需要进一步的研究。

作为一种无创性neuromodulatory方法,LIFU有许多优点,如更高的空间分辨率,更大的穿透深度,没有组织损伤(50]。作为一个非热能的形式,LIFU垃圾热影响当地组织。当周边集中我们(空斑形成单位; ; ; )用于体外照射肌肉和肾脏组织,这些组织的温度增加了1.1°C和0.7°C,分别为(36]。在这项研究中,我们切断脊髓- 5和执行)染色观察脊髓LIFU的安全。我们的结果显示没有肿胀,核分裂的神经元,中性粒细胞浸润或出血(数字3(一个)和3 (b))。因此,这些结果表明,LIFU治疗脊髓是一个安全的方法。

总的来说,我们的研究表明,(i) LIFU刺激脊髓能有效地提高周围神经损伤引起的神经性疼痛的行为,在NP的临床治疗方面具有潜在应用价值;(2)LIFU刺激脊髓可能影响CaMKIV的表达,分子和关注₂;和(3)刺激脊髓LIFU是安全的。

5。限制

我们的研究有一些局限性。首先,我们建立了治疗期很短,没有评估我们治疗的长期疗效。第二,我们选择只有一个时间点来衡量CaMKIV的表达,p-CREB, p-ERK和关注₂。第三,我们发现LIFU可能影响CaMKIV的表达,p-CREB和关注₂,但我们没有探索的具体机制影响上述蛋白的表达。因此,需要进一步的实验。

6。结论

我们发现LIFU能有效地缓解NP与句老鼠通过增加关注的表达₂在脊髓背侧的角落。此外,LIFU调节KCC的表达₂,可能通过抑制CaMKIV-KCC的激活₂途径。

缩写

NP:	神经性疼痛
LIFU:	低强度聚焦超声
句:	周围神经损伤
KCC2:	氯化钾转运蛋白2
CaMKIV:	钙/ calmodulin-dependent蛋白激酶IV型
p-CREB:	磷酸化环磷酸腺苷反应元件结合蛋白
p-ERK1/2:	磷酸化细胞外signal-regulated激酶1/2
GABA:	γ氨基丁酸酸
脑源性神经营养因子:	脑源性神经营养因子
TrkB:	原肌球蛋白受体激酶B
中枢神经系统:	中枢神经系统
dps:	天时间均
佩恩表的编制者50:	爪子提取阈值的50%。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

作者希望承认李进教授的语言支持。这项研究得到了国家自然科学基金(号。81960421,81660381,82060421)。我们要感谢LetPub (https://www.letpub.com)的语言帮助在准备这个手稿。