文摘
海马功能和神经可塑性的变化异常参与神经性疼痛,导致痛觉过敏和学习和记忆的赤字。先前的研究从我们组表明,电针刺激Huantiao (GB30)和Yanglingquan (GB34)对神经性疼痛有明显的镇痛效果。然而,中央调控机制发生在海马体还有待调查。在这项研究中,行为和蛋白质组分析识别差异表达海马蛋白质参与electroacupuncture-induced镇痛。我们的结果显示两种调节(TMEM126A、RDH13 Luc7L)和表达下调的蛋白质(Mettl7A, GGA1 RTKN, RSBN1,和CDKN1B)。进一步验证蛋白质首次透露,海马TMEM126A扮演一个重要的抗炎治疗神经痛电针刺激。
1。介绍
认知障碍通常是伴随着痛苦的经验,大约73% -81%的慢性疼痛患者患有记忆赤字(1,2]。最近的临床研究报道客观认知障碍患者的周围神经性疼痛(3,4]。几项研究已经提供了证据表明海马的结构和功能异常基础与神经性疼痛相关的认知缺陷(5- - - - - -8]。海马体接收复杂的综合感觉和认知信息,包括疼痛信号。一些基因和蛋白质的变化如upregulation TNF -α、il - 1和海马的MCP-1扮演关键角色在啮齿动物的神经性疼痛伴随着认知障碍(9,10]。然而,海马蛋白质及其相关信号通路参与神经性疼痛仍然很大程度上是难以捉摸的。
在穴位电针刺激(EA) Huantiao (GB30)和Yanglingquan (GB34)是有效的缓解疼痛敏感和认知减退与人类和啮齿动物(神经性疼痛有关11- - - - - -13]。脊髓阿片类药物,5 -羟色胺,去甲肾上腺素、氨基酸、和胶质细胞/细胞因子的主要介质EA-induced神经性疼痛的镇痛14]。最近的研究集中在海马功能变化的角色在EA的有益作用疼痛状况。监管相关的海马蛋白质的氨基酸代谢和激活MAPK信号通路参与了EA在神经性疼痛的镇痛效果15,16]。然而,很少有研究关注海马体的分子功能的作用EA-induced镇痛和认知的改善。
蛋白质组学分析提供了有价值的策略探索疼痛糖尿病的发病机制,以及在这种情况下治疗靶点。我们假设一些关键基因或蛋白质在海马体中起着关键作用与EA治疗神经性疼痛。基于上述工作之前,本研究旨在探索分子机制EA-induced镇痛在海马体使用蛋白质组学和行为分析。
2。材料和方法
2.1。动物和材料
男性Sprague-Dawley (SD)大鼠(8 - 10周,200 - 220 g)从上海得到松弛实验动物有限公司(上海,中国)。老鼠们被安置在稳定的温度条件下(22°C)和12/12 h光/暗周期和免费的食物和水在福建中医药大学实验动物中心。SD大鼠随机分为虚假的操作组(假的),一个没有神经损伤模型组(SNI),和一个电针刺激组(EA)。10每组动物进行行为测试和分析,每组和四个动物被用于酶联免疫吸附试验(ELISA)和免疫印迹检测毕竟行为测试。所有动物实验协议是动物伦理委员会批准福建中医药大学(没有。fjtcm2019 - 006)。所有老鼠人道牺牲根据护理指导方针。老鼠有更多异氟烷麻醉并被实施安乐死减少动物的痛苦经历。
以下试剂和仪器:冯·弗雷丝(美国北医疗,CA);针灸针, 中国(苏州医疗用品厂);Tmem126a酶联免疫试剂盒(武汉博士德生物技术,中国);TMEM126A兔子帕布(A12823;ABclonal技术,中国);和GAPDH山羊帕布(ab9483;美国Abcam)。
2.2。没有神经创伤性神经性疼痛模型和EA的刺激
避免神经损伤坐骨神经进行麻醉根据先前描述的过程17]。SNI和EA组,右侧坐骨神经分支的老鼠暴露和选择性进行切割,或结扎。腓骨和胫骨,常见的神经分离,与以丝绸紧密的结扎和切断结扎远端。2毫米长度的每个神经,同时保留的腓肠神经的完整性。在虚假的操作组,只有坐骨神经分支被曝光,不执行任何神经遣散费和结扎。老鼠监测任何感染或手术后痛苦的迹象。
避免神经损伤手术后七天,EA组老鼠松散木架上的固定,允许自由运动的头和四肢。的穴位Huantiao (GB30)和Yanglingquan (GB34)在右边选择针灸电刺激。老鼠,GB30位于外侧的结第三和内侧三分之二的线连接股骨大转子的重要性与骶管裂孔GB34坐落在大萧条前和腓骨远端头部(18,19]。艺电刺激进行30分钟,每天一次连续三周。针插入在GB30和GB34被连接到一个G6805-1A多功能EA装置(上海医疗电子仪器有限公司,上海,中国),使用1 mA的刺激强度和2赫兹的频率。虚假的操作组和模型组进行实验协议每天在同一时间。
2.3。行为测试
机械爪撤军阈值(佩恩表的编制者)评估0天,7、14、21日和28日参与EA刺激后使用·冯·弗雷细丝。根据上下方法,冯·弗雷丝不同强度(0.6克,1.0克,1.4克,2.0 g、4.0克,6.0克,8.0克,15.0 g和26.0 g)被用来确定老鼠佩恩表的编制者50%。快速爪子撤军或舔爪子的反应刺激被认为是一种积极的反应。评估佩恩表的编制者的协议是基于我们之前描述的一个研究[20.]。
新奇物体识别测试中执行一个树脂玻璃框( )在28天参与。习惯后,1天,老鼠被放置在盒子里20分钟没有对象被提出。四小时后,老鼠被放置在箱子里又允许探索对象A和B为5分钟。保持24小时的间隔后,进行认知测试在同一个盒子对新事物代替对象B c .老鼠被允许自由探索的对象为5分钟。探索时间之间的差异比熟悉的对象,在探索小说对象的总时间探索两个对象被用来评估认知功能。
2.4。蛋白质组学检测和分析
2.4.1。蛋白质的提取和胰蛋白酶消化
蛋白质组学检测和分析的所有方法都是根据我们团队的先前的研究如下21]。
海马组织样本的提取蛋白质裂解缓冲(蛋白酶抑制剂)8 M尿素,1%使用高强度超声波处理器。剩余的碎片被离心分离 10分钟在4°C。蛋白质浓度检测Bicinchoninic酸(BAC)工具包。
胰蛋白酶消化,蛋白质的解决方案是减少二硫苏糖醇为30分钟56°C,然后用碘乙酰胺孵化为15分钟37°C在黑暗中。其次,蛋白质样本稀释用毫克分子Triethylammonium碳酸氢盐(TEAB),直到尿素浓度< 2 M。最后,添加了胰蛋白酶在质量比(胰蛋白酶:蛋白质)1:50第一消化37°C一夜之间,然后在一个比1:100年第二消化。
2.4.2。串联质量标签(TMT)标签和质/ MS分析
胰蛋白酶消化后,肽被脱盐和vacuum-dried地层X C18 SPE柱。肽重组在0.5 TEAB和标志着TMT装备根据协议。
分离肽受到钠/碘同向转运来源。串联质谱分析(MS / MS)进行使用Q Exactive加(热)仪器、耦合网络ultraperformance液相色谱系统。
使用一个电喷射电压2.0 kV,完整的肽被发现在Orbitrap 70000质量分辨率。主要女士扫描范围是350 - 1600 。收集的数据是使用视扫描程序(DDA)处理。自动增益控制是设定在50000年,离子信号阈值为5000 /秒,最长时间的200年代,和动态排斥串联质量扫描的时间15秒,以避免重复扫描的前体离子。
2.4.3。数据库搜索
MS / MS数据分析使用MaxQuant搜索引擎(v.1.5.2.8),使用以下参数:老鼠UniProt第一次筛选;然后,反向库添加计算假阳性比率(玻璃钢);胰蛋白酶/ P指定为裂解酶,允许两个错过分裂;最低肽长度是7个氨基酸残基;肽修饰的最大数量是5;搜索的主要前体离子的质量公差是20 ppm,而主要搜索5 ppm;碎片离子的质量公差是0.02 Da;定量方法将TMT-10plex;和玻璃钢peptide-spectrum匹配识别设置为1%。
2.4.4。生物信息学注释
基因本体论(去)注释来源于UniProt-GOA数据库(http://www.ebi.ac.uk/GOA/)。InterProScan软被用来分析以下类别:分子功能,细胞成分和生物过程。KEGG在线服务工具被用来描述注释蛋白质,是使用KEGG映射器匹配相应的途径。WoLFPSort (https://wolfpsort.hgc.jp/)被用来研究亚细胞定位。KEGG数据库通路富集分析进行了使用双尾Fisher精确检验。途径是根据KEGG网站分类。
进一步进行了聚类分析功能性浓缩探索潜在的连接和特定功能的差异。首先,所有去类别数据收集浓缩后,根据他们的排序值,然后过滤获得的数据类别 。这个过滤使用函数值矩阵转化 。最后,值为每一个功能类别 - - - - - -改变了。集群成员使用热量地图可视化。
2.5。ELISA检测
Tmem126a浓度进行了分析使用酶联免疫试剂盒根据制造商的指示。简单地说,100年μl,分别复制井的标准和稀释样品在室温下孵化2 h。洗井后5次1×清洗解决方案,100年μl酶共轭试剂添加到每个井,井是在室温下孵化2 h。100年μl衬底的解决方案是添加,30分钟孵化后,100年μl停止的解决方案是添加到终止反应。合成的颜色是化验使用微量滴定板读者。
2.6。免疫印迹检测
避免神经损伤手术后,大鼠( 每组)被牺牲在28天为了执行分析海马蛋白质。蛋白质提取、钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶电泳(sds - page)和免疫印迹分析。蛋白质提取使用SDS样品缓冲均化,其次是离心 20分钟。上层清液的蛋白质浓度测定采用BCA蛋白质分析工具包(美国罗克福德皮尔斯),和60μg蛋白质被加载到各车道的10% sds - page凝胶。膜在一夜之间被使用TBS-T 5%的牛血清白蛋白。然后污点是探索使用以下主要抗体:兔子anti-TMEM126A抗体(1:500)和山羊anti-GAPDH一夜之间(1:1000)在4°C。然后,污点是孵化HRP-anti-rabbit /山羊(1:2000;美国圣克鲁斯,CA)抗体在室温下1 h。这些墨迹孵化在发射极耦合逻辑(皮尔斯)解决方案3分钟,然后接触到柯达X-OMAT AR电影(美国罗切斯特伊士曼柯达公司)为1.5分钟。光密度分析TMEM126A乐队使用Syngene软件执行(美国马里兰州基因Gnome, Syngene)。
2.7。统计分析
所有的数据呈现的 (SD)。分析了三个实验小组使用一个和双向方差分析(方差分析)和事后图基测试在SPSS 21.0(美国纽约SPSS,阿蒙克)。使用GraphPad Prism 7.0图形生成软件。
3所示。结果
3.1。EA破坏机械疼痛敏感性和记忆缺陷引起的神经性疼痛
如图1(一)与SNI模型组相比,EA组显示机械痛阈显著增加7天,14日和21的神经性疼痛( )。在没有神经损伤28天,如图1 (b),这部小说在SNI对象识别指数显著降低大鼠( )。这部小说与SNI模型组相比,对象识别指数在EA组显著增加( )。
(一)
(b)
3.2。海马蛋白质组变化SNI老鼠处理EA
与虚假的操作组相比,16个蛋白是调节和11个蛋白表达下调的海马体SNI模型组。与SNI模型组相比,17个蛋白是调节和36个蛋白质表达下调在EA组(数字2(一个)- - - - - -2 (c))。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
在27幸免神经损伤引起的调节蛋白,最重要的是调节或下调蛋白质,分别是跨膜蛋白126 (TMEM126A)和兴奋性氨基酸转运蛋白2 (SLC1A2 / EAAT2),主要是与持久的疼痛,认知障碍,免疫炎症调节(表1)。ELISA和免疫印迹结果表明,连续的EA, TMEM126A SNI组表达明显减少与虚假的集团相比,虽然TMEM126A表达显著调节,与蛋白质组学的结果(数据一致2 (d)和2 (e))。
进一步的蛋白质组学检测和分析表明,没有神经创伤性表达下调的蛋白质如TMEM126A RDH13, Luc71调节在EA组。此外,免于神经创伤性调节蛋白质如MettL7A GGA1, RTKN, rsBN1, CDKN1B EA治疗后显著下调(表2)。
3.3。分析生物过程、细胞成分和分子功能在SNI和EA组大鼠
生物过程的分析,四大监管流程,分别是细胞过程中,单个有机体过程中,代谢过程和生物的监管。最常见的细胞成分分析,蛋白质主要是与细胞和细胞器组件相关联。分子功能分析表明,最常见的分子功能绑定和催化活性(数字3(一个)和3 (b))。
(一)
(b)
(c)
(d)
根据亚细胞结构定位分析,主要的子目录(超过20%)SNI /假蛋白质核(33.33%)和细胞外(22.22%),而EA / SNI蛋白胞质(37.74%)和核(33.96%)(数据3 (c)和3 (d))。
3.4。功能性浓缩和聚类分析的SNI和EA组使用KEGG途径分析
进一步探索途径有显著影响的差异表达蛋白质,蛋白质是映射到KEGG数据库和浓缩水平计算使用Fisher精确检验值(]。如数据所示4(一)和4 (b)KEGG通路富集分析表明,M / S差异表达蛋白质主要富集在肾素-血管紧张素系统和叶酸生物合成途径。相比之下,E / M差异表达蛋白质主要富集在药物代谢,细胞色素P450,由细胞色素P450和外源性物质的代谢途径。
(一)
(b)
4所示。讨论
在我们的研究中,我们发现4周连续EA治疗大鼠显著增加他们的机械痛阈和改善认知缺陷引起的神经创伤性神经性疼痛。这是第一次,海马蛋白质组的结果已发表关于免于神经创伤性神经性疼痛大鼠重复处理EA刺激。总的来说,我们量化4804蛋白质使用TMT标记蛋白质组学方法。这些蛋白质,只有16人调节,而11中表达下调神经性疼痛的发展。
这些差异表达蛋白主要参与肾素-血管紧张素系统和叶酸生物合成;例如,ACE2和色氨酸hydroxylase-2 (TPH2),神经性疼痛模型中表达下调大鼠。最近,一些研究已经表明,中央ACE2和TPH2参与疼痛的持久性和认知能力下降。ACE2损害认知功能缺陷被发现,增加氧化应激,减少海马BDNF水平(29日]。ACE2-positive神经元的数量显著减少糖尿病神经性疼痛和抑制性神经元的凋亡有关,如gaba ergic中间神经元,在脊髓背角30.]。Tph2 shRNA表达区神经元诱导的差别明显对这些Tph2区和5 -在脊髓背角,衰减神经创伤性触诱发痛(31日]。
根据比率的差异蛋白表达和相关的值,我们发现最突出的调节或下调蛋白质,分别是跨膜蛋白126 (TMEM126A)和兴奋性氨基酸转运蛋白(SLC1A2 / EAAT2)。五个已知人类EAAT亚型中,胶质的运营商,EAAT2影响最大间隙期间释放的谷氨酸神经传递。脊髓EAAT2中起关键作用的感应和神经性疼痛的维护。坐骨神经损伤(CCI)诱发疼痛的初始upregulation EAAT2在术后1 - 4天,在7 - 14天(差别之后,对这些32]。此外,upregulation EAAT2也明显的差别,对这些神经性疼痛(33]。对目前的研究中,海马的upregulation EAAT2可能被视为一个中央保护机制或一个反馈调节机制,防止神经损伤后谷氨酸积累的不良后果。因此,抑制EAAT2表达式使用EA可以减轻机械触诱发痛。
进一步的蛋白质组学数据的分析发现了神经创伤性表达下调的蛋白质。其中包括TMEM126A,调节EA组,ELISA和免疫印迹证实的结果。TMEM126A编码线粒体蛋白在高等真核生物中发现,提供线粒体能量是很重要的。一系列的研究已经证实,听觉神经病变是TMEM126A-associated视神经萎缩的一个关键特性34- - - - - -37]。TMEM126A是CD137配体结合蛋白,夫妻在巨噬细胞TLR4信号转导通路。它扮演着一个重要的角色在炎症免疫调节,增加细胞表面的蛋白质,如CD54的表达,MHC II, CD40和CD86。细胞表面TMEM126A表达式被发现增加LPS诱导巨噬细胞在24 h后,虽然CD137L表达下降(22,23]。最近的研究表明,海马1小胶质细胞表面标记CD86的表达+和小胶质激活增加慢性周围神经损伤引起的神经性疼痛时(8,38]。此外,TLR4的表达水平/ NF -κB信号pathway-related蛋白质调节神经性疼痛模型小鼠的海马(39]。
令我们吃惊的是,我们发现没有神经创伤性神经性疼痛表达下调TMEM126表达式,而TMEM126A EA后调节治疗。这项研究首次证明TMEM126A的角色在中央的EA镇痛的影响。结合上述的研究结果,我们推测,EA发挥镇痛作用可能通过调节TMEM126A的表达。这可能抑制海马小胶质细胞和小胶质M1标记的表达,可能减少海马神经炎症。在以后的实验研究,我们打算建立一个小鼠模型的表达水平改变了TMEM126A基因或使用TMEM126A shRNA进一步分析海马底层EA-induced镇痛机制。
5。结论
总之,使用TMT标签方法加上质/女士,我们表明,避免神经损伤和EA刺激驱动重要改变海马蛋白质的水平,尤其是inflammation-regulated蛋白质EAAT2和TMEM126A等。我们的结果可以提供的候选蛋白生物标志物的诊断和治疗神经损伤。
数据可用性
使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。
伦理批准
我们的研究是通过动物研究委员会福建中医药大学(没有。fjtcm2019 - 006)。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
所有作者的文章和批准提交的版本。Degui锣和Xiangmei Yu同样这项工作。
确认
本研究联合支持由中国国家自然科学基金(81774385,81774385),福建省科技平台建设项目的科技部门(批准号2018 y2002),关键项目的“中药现代化研究”国家重点研究和开发计划(2019 yfc1710301),和福建省自然科学基金(2018 j01879)。