转录组分析显示条纹的Hcy代谢改变Vascularis Pendred综合征小鼠模型

文摘

目的。Slc26a4^{- / -}小鼠耳蜗的发展表现出强烈的缺陷和发展耳聋,而负责这些影响的潜在机制仍不清楚。我们的研究旨在探讨潜在的机制联系起来SLC26A4缺乏听力损失。材料和方法。RNA序列应用于基因差异表达分析的条纹vascularis从野生型和(SV)Slc26a4^{- / -}老鼠。去KEGG途径进行分析。应用定量rt - pcr验证候选基因的表达受到影响Slc26a4。使用ELISA和免疫荧光技术检测血清同型半胱氨酸(Hcy)水平,大脑和SV。结果。183调节基因和63 SV与表达下调基因被确定Slc26a4损耗。转录组分析显示,Slc26a4缺乏显著影响基因的表达与细胞粘附,跨膜运输和多细胞生物的生物起源。的SVSlc26a4^{- / -}老鼠表现出更高的表达Bhmt信使rna,以及同型半胱氨酸(Hcy)代谢改变。结论。的改变表现Bhmt结果在一个戏剧性的变化在多种生化反应和破坏的体液内淋巴中可能导致的听力损失Slc26a4基因敲除鼠。

1。介绍

Pendred综合症,表现为耳聋增大渡槽和甲状腺肿,是由基因突变引起的SLC26A4最普遍的原因之一,全球遗传性听力损失(1]。一项大规模研究显示,突变的SLC26A4这发生在大约5 - 10%感音神经性听力损失儿童各种不同的种族人群(2]。听力损失患者的发病Pendred综合症是可变的。有些病人可能在出生时听力损失,而其他人遭受波动,或进步听力损失在他们的童年,这可能提供了一个机会之窗治疗(3]。

调查Pendred综合征的潜在机制,研究人员创建了一个小鼠模型进行研究。的Slc26a4基因敲除小鼠遭受严重的听力损失和耳蜗畸形的出生。先前的研究观察Slc26a4基因敲除小鼠发现pendrin,编码的Slc26a4基因,位于外沟的根细胞,细胞上覆螺旋突出,纺锤状细胞纹vascularis耳蜗。与此同时,三个主要的变化发生在的内耳Slc26a4突变的老鼠。(1)缺乏pendrin导致酸化的内淋巴4]。Pendrin阴离子交换蛋白,类似于Cl^{- - - - - -}和HCO_{3 -}换热器内淋巴的参与流体调节(5]。在缺乏pendrin HCO_{3 -}分泌到内淋巴受到影响,导致内淋巴成为酸性并导致抑制Ca^{2 +}再吸收(4,6]。(2)scala媒体放大由于内淋巴的囊功能障碍。耳蜗内腔是由液体的平衡在前庭迷路和液体吸收分泌内淋巴的囊,从胚胎(E) 13.5和14.5天(7]。因此,内淋巴的囊功能障碍的液体吸收,由于Slc26a4突变,导致体积肿大的中道8,9]。(3)Kcnj10的表达降低,这内心整流K⁺通道亚基,位于中间细胞纹vascularis (SV),负责建立内淋巴的潜力(EP) (10,11]。Wangemann等人报道的缺失Kcnj10中间细胞Slc26a4突变小鼠在1 - 4个月大的时候,这种缺乏EP通道蛋白质会减少,这可能直接导致耳聋(12]。在这三种变化,SV是初始的病理和相关的听力损失的主要原因Slc26a4^{- / -}老鼠。然而,如何Slc26a4缺乏影响SV仍然未知的形态和功能。

在这项研究中,我们使用了RNA的转录组测序方法比较差异从野生型和SVSlc26a4突变的老鼠。我们发现Slc26a4缺乏显著影响SV基因所需的多细胞生物,生物转化。此外,SVSlc26a4^{- / -}老鼠表现出更高的表达Bhmtmrna,以及Hcy的显著减少,说明Hcy代谢的异常是一个新颖的机制SLC26A4影响听力。

2。材料和方法

2.1。动物

Slc26a4基因敲除小鼠从杰克逊实验室获得,Calca基因敲除小鼠来自Cyagen有限公司。所有的动物都维护在杂合子在SPF环境和适应实验情况下一个星期前的实验。所有实验程序依法进行指导的护理和使用实验动物,动物保健和使用委员会批准的上海交通大学附属第六人民医院(许可证号码:SYXK 2016 - 0020)。

2.2。RNA-seq

野生型和Slc26a4^{- / -}老鼠在好牺牲。从内耳的条痕vascularis分离,然后细胞溶解在试剂盒(表达载体)。总RNA分离根据制造商的指示。所有样本测序一个Illumina公司HiSeq2500平台在1500万100 - bp单读取/样品。质量控制序列库后,读取被修剪和映射运用基因组注释和人类基因组组装使用Tophat2 (hg19 / GRCh38)。读取映射到核糖体rna或线粒体基因组被移除。

2.3。实时定量rt - pcr

从野生型和总RNASlc26a4^{- / -}条痕vascularis与试剂盒提取试剂按照制造商的指示(表达载体)。一微克总RNA的反向转录使用ReverTra Ace®qPCR RT工具包(Toyobo fsq - 101)根据制造商的指示。SYBR rt - PCR试剂盒(Toyobo qpk - 212)被用于定量实时PCR分析。计算的相对mRNA表达不同的基因与控制相比基因Gapdh(编码GAPDH)使用2^{- - - - - -△△Ct}方法(表1)。

2.4。疣状

野生型和Slc26a4^{- / -}老鼠在好牺牲。cochleae隔绝颞骨,PFA固定4%,蔗糖脱水30%,切成冻结部分。部分permeabilized 0.1% Triton x - 100在PBS和屏蔽1% BSA在PBS。样本与anti-Hcy孵化(PAD984Ge01,克隆云)在4°C在室温下过夜,然后二次抗体或DAPI 30分钟。的条纹vascularis从侧壁解剖及其肌动蛋白结构被phalloidin染色显示。样本检验和数据获得LSM 710共焦激光扫描显微镜(卡尔蔡司、从、德国)20或63 x放大。

2.5。酶联免疫吸附试验

从野生型和血浆和脑匀浆Slc26a4^{- / -}老鼠准备和坚持在-20°C到分析。Hcy水平使用酶联免疫试剂盒测定同型半胱氨酸(CED984Ge Clone-Cloud)根据生产的指令。吸光度是评估ELISA酶标阅读器在450 nm和pg / ml表达的结果。

2.6。ABR阈值测试

听力条件发现老鼠的听觉脑干反应(ABR)阈值。老鼠用于ABR测试完全麻醉的氯胺酮和甲苯噻嗪。初始剂量的氯胺酮和甲苯噻嗪是85和15毫克/公斤,分别。刺激一代和biosignal采集参数可用类似于一项研究[13]。听觉刺激了扬声器提前10厘米的老鼠的头,头部的电极针在顶点位置和参考,和接地电极定位后到外部听觉运河。基调的爆发是由TDT RP2.1实时信号处理器,(10毫秒时间0.5 - ms上升/下降时间每隔21.1 / s) 4、8、16、24、32 kHz SigGen软件。生物信号的电极导致RA4PA前置放大器从Tucker-Davis技术(TDT)系统第三;美国FL Alachua)。诱发ABR反应被不仅前置放大器放大20 x (TDT)和平均1000次。语气开始爆发的强度在90分贝和下降了10 dB的步骤,除了在阈值5分贝。阈值确定基于正负波的可见性和再现性。阈值被定义为最低的声级,产生一个可再生的反应。

2.7。统计分析

结果被表示为 ,群体之间的统计学意义决定使用一个未配对 - - - - - -测试或Mann-Whitney测试。软件8.0 GraphPad棱镜用于所有分析,和一个 被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。戏剧性的形态变化条痕VascularisSlc26a4^{- / -}老鼠

Slc26a4^{- / -}老鼠通常有较大的内耳内淋巴的囊的障碍。相比于Slc26a4^{+ / +}老鼠、内耳的耳蜗内腔、孤立的从6周Slc26a4^{- / -}老鼠,显著扩大。此外,SV可以通过中间的色素细胞可视化(14),侧壁出现深和更明显Slc26a4^{+ / +}小鼠相比Slc26a4^{- / -}(图1(一))。

SV的内层是由边际细胞内淋巴(面临的10]。因此,我们使用了肌动蛋白染色phalloidin,概要文件在SV这些边缘细胞的结构。事实上,增大边缘细胞的Slc26a4^{- / -}老鼠,而边际细胞Slc26a4^{+ / +}老鼠正常大小和组织(15)(图1 (b))。

3.2。转录调控的条痕Vascularis所致Slc26a4删除

确定的角色SLC26A4在耳蜗的功能、野生型和Slc26a4^{- / -}老鼠牺牲和SV小心地隔离。对sv的总RNA提取,然后发送从每个样本生成下一代测序和数据平均24 mb的干净的读取,低质量的过滤后,这些清洁读取被映射为参考。每个数据集包含24 mb的读和映射率为92 - 93%。此外,我们清点的数量确定的基因表达和计算他们的比例和分布数据库中的全部基因数量为每个样本。相关基因表达水平的样本是一个关键的标准来确定实验是否可靠和样本选择是否合理,和主成分分析来评估基因表达水平(图2(一个))。

火山和散点图显示差异表达成绩单的褶皱变化> 2Slc26a4缺乏组与野生型相比组(183调节基因和63个表达下调基因)(数据2 (b)和2 (c))。

3.3。基因本体论差异基因的分析

为了更好地理解这些差异表达基因的相关功能Slc26a4介导耳蜗功能,基因本体论(去)分析是用于执行浓缩(数据分析和分类3(一个)和3 (b))。去分析确定丰富生物过程与“生物粘附,”“蜂窝组件组织或生物起源,”“多细胞有机体的过程,”和“发展过程,”表明一个强大的多细胞生物,生物起源过程发生在Slc26a4介导的耳蜗内稳态的维护。此外,丰富细胞组件相关的“膜”,“细胞器,”“细胞外区域,”和“membrane-enclosed腔”是确定这意味着不同的细胞成分参与Slc26a4介导的耳蜗功能。丰富的分子功能被定义为与“结构分子的活动,”“催化活性,”和“分子传感器活动,”表明细胞器结构的形成和细胞内信号转导的主要分子功能Slc26a4。

3.4。分析重要KEGG通路

我们下一个使用微分KEGG基因通路浓缩,和结果表明,基因涉及“ECM-receptor交互途径,”“粘着斑通路,”“aldosterone-regulated钠重吸收途径,”和“味觉转导途径”大大丰富,表明损失Slc26a4基因可能导致跨膜细胞通讯和交通中断SV(数字3 (c)和3 (d))。

集体,去和KEGG通路分析提出一个重要的角色SLC26A4在调节细胞外结构形成,细胞间或者cell-to-ECM粘连,跨膜运输。

3.5。选择基因的验证

几个重要的调节和表达下调基因所示的热图(数字表示4(一)和4 (b))。定量rt - pcr结果验证了微分选定的候选基因的表达,包括Padi1,Arrb1,Ace2,Gpr176,Lrrc8d,Alox15,Calca(图4 (c))。

我们注意到的一个重要表达下调基因的SVSlc26a4老鼠是不足Gpr176编码一个G-protein-coupled受体(16并曾被报道与成人常染色体显性小脑性共济失调,耳聋和嗜睡症(17]。的差别定量rt - pcr分析证实了对这些Gpr176SV的Slc26a4^{- / -}老鼠(图4 (c)),建议减少GPR176介导的信号在Slc26a4缺乏。

另一个重要基因的发现Calca因此,我们产生了Calca基因敲除小鼠使用CRISPR / Cas9技术和仔细检查其ABR阈值。结果表明,Calca^{+ / -}老鼠听到野生型控制(图4 (d)),这表明至少杂合的删除Calca听到没有显著的影响。

3.6。纹Vascularis Hcy代谢的改变Slc26a4^{- / -}老鼠

我们下一个决心的表达Bhmt,以及其他几个Hcy代谢包括所需酶Bhmt2,Ahcy,哥伦比亚广播公司在SV和大脑Slc26a4^{- / -}使用定量rt - pcr的老鼠。结果表明,Slc26a4缺乏显著增加Bhmt表达式的SV但不是大脑,而其他酶的表达参与Hcy新陈代谢是相似的两组(数字5(一个)和5 (b))。有趣的是,我们还观察到显著增加Bhmt假基因(Bhmt-ps)的SVSlc26a4^{- / -}老鼠而不是大脑,类似的水平Bhmt本身,这表明可能存在一个共同的监管Bhmt和Bhmt-psSV。因此,我们应用免疫染色检测使用一个anti-Hcy多克隆抗体从野生型和SV的测量水平Slc26a4^{- / -}老鼠和发现的SV Hcy水平显著下降Slc26a4^{- / -}老鼠(图6(一))。然而,我们没有观察到显著改变这些小鼠血清Hcy水平相比,野生类型,基于anti-Hcy ELISA(数字6 (b)和6 (c))。

4所示。讨论

听力损失可能是由遗传因素引起的,老化,耳蜗慢性感染、传染病、耳毒性的药物,和噪声暴露18- - - - - -24]。大部分的听力损失是由于毛细胞及螺旋神经节神经元的损伤,在许多先前的研究已经进行了广泛的调查(25- - - - - -30.),而条纹的详细机制vascularis-related听力损失,如Pendred综合症,没有众所周知的。SLC26A4影响耳蜗的功能在人类和小鼠;然而,的机制SLC26A4达到这还不清楚15]。转录组测序技术已经广泛应用于许多先前的研究调查的详细机制在内耳(31日- - - - - -37]。在我们的研究中,我们应用一种转录组测序的方法来检查的水平差异表达基因的SVSlc26a4^{- / -}老鼠。利用生物信息学分析,我们发现183调节基因和63 SV与基因表达下调Slc26a4损耗。此外,这些基因的细胞功能与细胞通讯,细胞外基质组织和跨膜运输。因此,我们的研究结果表明一种新的机制SLC26A4可以影响耳蜗功能。

以前的研究已经表明巨噬细胞入侵导致退化的SVSlc26a4^{- / -}小鼠模型(14,38]。与此一致的是,我们发现一个额外的两个特征明显炎症调节基因,Alox15编码,花生四烯酸15-lipoxygenase [39),Arrb1、编码β-arrestin 1 (40,41),在SV的表达下调的基因Slc26a4^{- / -}老鼠。定量rt - pcr结果还显示,表达水平Arrb1和Alox15在这些基因敲除小鼠的SV下降。这些发现表明组织炎症的可能角色退化的SV Pendred综合征小鼠模型(42,43]。

的Calca降钙素基因,编码和alpha-calcitonin相关基因肽(44),是一个表达下调的基因在我们的研究中找到。作为一项研究报道,Calca表示在小鼠耳蜗在开发早期阶段(45]。我们因此获得了Calca确定的低表达突变的老鼠Calca影响听力。自Calca在multiorgan[发展中起着至关重要的作用46,47),Calca^{- / -}老鼠,由CRISPR / Cas9方法论,是不健康的,出生后不久死亡。因此,我们被迫生成Calca^{+ / -}杂合的老鼠模型来确定听证会。ABR结果表明,没有差别的听力阈值和野生型之间Calca^{+ / -}动物。没有明显的听力损失可能是由于所使用的小鼠的杂合的性质。因此,还需要进一步的研究来确定是否更微妙的,或隐藏在这些老鼠存在听力损失。同时,一个新的Calca-模型需要进一步研究其影响听力。

我们的转录组测序结果发现最独特的调节基因的SVSlc26a4^{- / -}老鼠是Bhmt编码,甜菜碱Hcy S甲基转移酶的活动需要的一个甲基转移Hcy甜菜碱,末端硫氨基酸(48,49]。故障的Bhmt导致半胱氨酸和几个以前的流行病学和实验研究已经揭示了半胱氨酸和听力损失之间的相关性50]。先前的研究表明,Hcy水平中扮演一个重要的部分在保持SV的完整性,这是SV建立EP的基础(51]。我们一直观察到的SV Hcy的急剧减少Slc26a4^{- / -}小鼠与野生型相比,最近,营养失衡是成为诱发因素与听力损失有关。此外,特蕾莎修女Partearroyo等人报道Bhmt蛋氨酸代谢的过程中扮演着重要的角色在体内平衡在小鼠耳蜗及其缺陷导致易感性增加噪音性听力丧失(52,53]。此外,减少Bhmt表达和SV Hcy的增加被认为解释听力损失表型中看到Cx30^{- / -}老鼠(54]。然而,我们的研究结果和先前的研究之间的区别之一是,SV的Slc26a4^{- / -}老鼠,Bhmt是调节,减少大量的Hcy,叶酸和甲硫氨酸循环的一部分。的高表达Bhmt导致增加Hcy和叶酸的消费和生产蛋氨酸和S-Adenosylmethionine作为主要捐助者的甲基合成的激素,核苷酸,膜脂质。这是推测的改变表现Bhmt结果在一个戏剧性的变化在多种生化反应和内淋巴营养体内平衡的破坏。然而,是否减少Hcy水平占耳蜗功能障碍,听力损失Pendred综合征小鼠模型需要进一步调查。

5。结论

转录组分析显示,Slc26a4缺乏显著影响基因的表达与细胞粘附,跨膜运输和多细胞生物的生物起源。的改变表现Bhmt结果在一个戏剧性的变化在多种生化反应和破坏的体液内淋巴中可能导致的听力损失Slc26a4基因敲除鼠。

数据可用性

数据可从作者Wenyue雪(xuecindy0107@163.com)在合理的请求和头颈外科部门的许可,上海交通大学附属第六人民医院。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

Wenyue雪和豫新添了同样的工作。

确认

作者想表达自己的感激之情EditSprings (https://www.editsprings.com/为专家提供语言服务)。这项研究得到了资助自然科学基金一般项目资助的中国(授予数量:81770998,82071040)。

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