文摘
目标。功能预后可能与肠道微生物群失调后改变gut-microbiota-brain轴后中风。本研究旨在探讨卒中后改变肠道微生物群和潜在的肠道微生物群之间的相关性和全局函数。方法。共有38个中风患者和35健康demographics-matched控制被招募。他们的粪便dna提取,V3-V4地区的守恒的细菌16 s RNA被放大和测序Illumina公司MiSeq平台。微生物组成、多样性指数、物种共存组之间的比较。随机森林和接受者操作特征分析被用来识别潜在的诊断的生物标志物。之间的关系判别细菌和卒中后功能结果估计。结果。更高的α多样性的肠道微生物群在卒中后患者比健康对照组( )。β多样性表明微生物组合在卒中后组明显不同于对照组。相对丰富的9个属在卒中后患者显著增加,而82属显著下降( )。准确性、特异性和敏感性的优化模型由十大判别物种分别为93%,100%,和86%,分别。亚组分析显示,细菌类群之间丰富的亚急性和慢性中风患者整体的不同( )。改良Rankin规模(夫人)( , ),Fugl-Meyer评估(FMA)评分( , ),水吞下测试(WST) ( , ),和Barthel指数(BI) ( , )明显与变更相关的独特的肠道微生物群。结论。中风患者的肠道微生物群显著变化的丰富性和组成。显著改变之间的关联发现独特的肠道微生物群和全球功能预后。这将促进小说中风的治疗目标选择上下文而独特的肠道微生物群的改变和功能变化之间的因果关系和精心设计的研究需要进一步验证。
1。介绍
中风据报道是主要的全球卫生问题每年258每100000人每年在世界范围内的发病率1]。患有中风征收沉重的医疗和社会和家庭的经济负担2]。医疗干预措施对中风的进步(如静脉溶栓和血管内治疗),生存率已显著提高,而残疾加息(3]。虽然治疗中风是至关重要的竞争与威胁生命的条件在急性期,续集留下的中风(例如,运动功能障碍,认知功能障碍,或吞咽功能障碍)可能随后影响病人的健康相关的生活质量和增加家庭和社会的负担4,5]。这表明应该注意,在某种程度上,推进预见到的长期预后功能;因此,修改相应的早期干预可以提供。根据文献综述,有几个因素可能影响卒中后功能恢复已报告包括年龄、性别、入学美国国立卫生研究院的中风尺度(署)得分6- - - - - -8]。尽管如此,这些综合因素只显示个性化的属性,能被改变或影响(9- - - - - -11]。在这种情况下,探索小说功能prognosis-associated因素,可能作为治疗目标,成为最必要的任务在医生面前。
在几个新提出的理论,调查“gut-microbiota-brain轴心”的作用在调节神经功能已迅速增加在过去的几十年中(12,13]。失调的gut-microbiota-brain轴日益与中风的病理生理学(14,15]。肠道微生物群上的交互,并对卒中后功能结果主要是观察在动物模型(16,17]。尽管如此,人类肠道微生物群的作用确实是不同的从动物(18]。以下问题是有限的知识关于人类肠道微生物群中所扮演的角色与神经可塑性和下面的预后变化。一些代表性的研究探索中风患者的肠道微生物群的构成与健康相比demographics-matched控制。例如,生态失调的短链脂肪酸(SCFA)在急性缺血性中风患者生产细菌和SCFAs以前观察到(19]。改变trimethylamine-producing肠道细菌被证明是与中风相关(20.]。然而,这些研究提供单个时间点观察(例如,收集的数据只有在急性期)或注册只中风亚型(例如,大脑中动脉闭塞)。此外,临床试验的能力仍然有限显示肠道微生物之间潜在的联系,系统和神经反应,和全球功能变化的背景下,中风。
基于上述问题和依据,我们进行了本研究要回答以下两个临床问题:(1)应该有任何不符点的肠道微生物群的丰富性或成分卒中后患者和健康对照组和(2)之间应该有一定的潜在的肠道微生物群的变化之间的相关性和全局函数包括通用残疾,身体功能、吞咽功能和日常生活活动(ADL) ?精化的上述两个问题,我们理解关于“gut-microbiota-brain轴心”的角色在中风的发展将提高其次是促进小说在中风的治疗目标选择。
2。材料和方法
2.1。研究设计和患者登记
当前队列研究是由南京医科大学第一附属医院从04 2020年7月至2021年1月29日。是制度伦理委员会批准的机构审查委员会,2018 - sr - 339),和所有的参与者参与前提供书面知情同意。
入选标准如下:(1)缺血性或出血性卒中发生确认与计算机断层扫描(CT)或磁共振成像(MRI),(2)年龄在18岁以上,(3)能够口头回应指令,和(4)生命体征稳定(120 - 180毫米汞柱的收缩压、心率50 - 100 /分钟的身体 ,和 )(21,22]。患者被排除在外,如果(1)诊断为短暂性脑缺血发作(TIA),(2)严重的认知和精神障碍( )(4,23),和(3)目前参与另一项试验或6个月内参加临床试验24,25]。匹配的健康对照组也登记根据年龄、营养状况(身体质量指数(BMI))和地理区域。
2.2。功能评估和样本收集
人口统计信息,包括年龄、性别、体重指数、血压、吸烟史、饮酒、体力活动,中风亚型、病史、家族史是根据收集的面对面采访或从电子医疗记录。功能评估与验证由一个研究助理和可靠的尺度。具体地说,中风严重性评估署得分;更高的分数表明大中风的严重程度(26]。改良Rankin规模(夫人)是用来测量残疾和依赖的程度在日常活动。夫人分数范围从0(无症状)到6(死亡)和不利结果得分得分0 - 2(3 - 6和有利的结果27,28]。ADL评估Barthel指数(BI)范围0 - 100,得分越低,表明高依赖(29日]。上或下肢运动功能评估与Fugl-Meyer评估(FMA)得分,得分越低,表明运动机能差30.,31日]。吞咽功能评估和水吞下测试(WST);更高的等级表示愿望的风险更高(32,33]。从两组收集粪便样本,并立即沉浸在一个解决方案和存储在-80°C DNA提取。
2.3。DNA提取和Illumina公司测序
从粪便中提取dna样本用于放大V3-V4地区16 s rRNA目标基因的引物组341 F / 806 r。执行这个动作来确定肠道细菌群落结构。放大产品进一步受到图书馆准备和测序Illumina公司MiSeq平台上根据制造商的指示(Illumina公司技术,美国)。
2.4。生物信息学和统计分析
从Illumina公司测序仪获得的原始fastq文件是质量与trimmomatic过滤,vsearch等。高质量的序列通过QIIME管道用于群落结构分析。操作分类单位(OTU)进行了挑选闭着UCLUST参考方法,和代表辣子鸡被分配使用UCLUST分类法分类器通过使用席尔瓦数据库(132年版)作为一个参考的数据集。
α和β多样性表明肠道微生物多样性的不同患者在卒中后或在(α多样性)和对照组评估(β多样性)样品。α多样性评估使用ace和香农指数计算。β多样性与主坐标分析(PCA)估计,Bray-Curtis,偏最小二乘分析(PLS-DA)的歧视。Wilcoxon测试是用来识别显著差辣子鸡( )进行进一步分析。之间的显著差异相关类群的相对多度组与线性判别分析进一步确定结合效果(LEfSe)。随机森林模型(R3.4.1 randomForest 4.6 -12包)进行开发预测模型。接受者操作特性曲线(ROC)和曲线下面积(AUC)被用来评估模型的准确性(R3.3.0 pROC包)。
提出了连续变量均值和标准差。分类变量证明是数字和百分比。连续非正态的分布变量组间比较Wilcoxon等级和测试。确切概率法为分类变量是用来比较组间差异。判别细菌之间的相关性和功能评估与斯皮尔曼相关分析估计。组之间的差异被认为是重要的值小于0.05。
3所示。结果
3.1。人口统计学和临床特点
一些卒中后患者的临床诊断患者38岁 ;他们招募了男性/女性的25/13),其中包括18亚急性及慢性20个病人。我们跟着亚急性中风定义的指导方针和中风的持续时间不到30天,而慢性中风患中风的持续时间超过30天(34]。与此同时,35岁,sex-matched健康人(年龄 ;男/女23/12)也加入。详细的人口和中风患者的临床特征和控制如表所示1和2。
3.2。在卒中后的改变肠道微生物群组成
维恩图解显示210个团体之间的共同辣子鸡(图1(一))。然而,133年发现了独特的辣子鸡卒中后36组和对照组,分别(图1(一))。α多样性分析表明,卒中后患者具有丰富性和多样性高于对照组(ace索引 vs。 ;香农指数 vs。 , ,数据1 (b)和1 (c))。Bray-Curtis和主成分分析的结果也证明数据1 (d)和1 (e)。此外,PLS-DA表明微生物组合在卒中后组显著不同于对照组(图1 (f))。
(一)
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在家庭层面上,Enterococcaceae,Lachnospiraceae,肠杆菌科,Helicobacteraceae极大地丰富而奈瑟氏菌科,Porphyromonadaceae,Flavobacteriaceae,Weeksellaceae,Cardiobacteriaceae,巴斯德氏菌科卒中后组明显减少(图2(一个))。在属水平,丰富的9个属,包括Lachnoclostridium,Flavonifractor,乳酸菌,肠球菌,肠杆菌属卒中后组明显升高。然而,大量的82属,包括Blautia,Faecalibacterium,Roseburia,Fusicatenibacter,普氏菌,被发现显著降低卒中后组(图2 (b)和表3)。在这些明显分化属中,18个属(例如,Blautia,Fusicatenibacter,瘤胃球菌属,Romboutsia,普氏菌,Roseburia(图)SCFA-producing细菌2 (c))。根据人类口腔微生物细菌(HOM,版本13)数据库,口服殖民者(包括26属和67种)显著分化丰富卒中后组(图2 (d))。而控制,大量的25个物种146年升高而减少卒中后组(表4)。
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3.3。肠道Microbiota-Based预测卒中后功能恢复
线性判别分析(LDA)和分配图分析(LDA )显示较高的微生物群属的变更梭菌属,乳酸菌,肠球菌,韦永氏球菌属,Megamonas,埃希氏杆菌属在卒中后组(数字3(一个)和3 (b))。然而,属Blautia,普氏菌,Fusicatenibacter,Roseburia,Faecalibacterium,瘤胃球菌属,奈瑟氏菌属水平在对照组(数字大大丰富3(一个)和3 (b))。
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探索潜在的生物标记物预测卒中后功能变化、随机森林模型构建基于物种分化(相对的 )。十倍交叉验证分析显示95%的auc(图3 (c))。根据上述分析,准确性,特异性和敏感性的优化模型由十大物种(图3 (d))分别为93%、100%和86%,分别。
3.4。疾病Duration-Dependent肠道微生物群的变化
属同现网络团体之间根据皮尔逊相关分析中演示了数据4(一)和4 (b)。积极的之间的关系证明Aggregatibacter和奈瑟氏菌属,Porphyromonas,棒状杆菌属和之间的Capnocytophaga和纤毛菌属,Porphyromonas,奈瑟氏菌属(ρ范围0.87 - -0.97, )在对照组,而之间Pseudobutyrivibrio和Roseburia,Flavonifractor和Lachnoclostridium,Fusicatenibacter和Pseudobutyrivibrio(ρ范围0.66 - -0.76, )卒中后组。亚急性病人显示之间的正相关性Fusicatenibacter和Pseudobutyrivibrio,Flavonifractor和Lachnoclostridium,Fusicatenibacter和Roseburia,Pseudobutyrivibrio和Roseburia(ρ范围0.67 - -0.80, )(图4 (c))。慢性的子群,我们观察到Pseudobutyrivibrio和Roseburia,Aggregatibacter和奈瑟氏菌属,Aggregatibacter和Porphyromonas,Capnocytophaga和纤毛菌属,Capnocytophaga和Pseudobutyrivibrio(ρ范围0.53 - -0.81, )呈正相关(图4 (d))。
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此外,泡沫块,LEfSe ( )显示显著增加/减少细菌类群丰富的亚急性和慢性中风患者(数字4 (e)和4 (f))。属(如Megasphaera,Paraprevotella,Howardella)和物种(例如,叫多形拟杆菌,乳酸菌粘膜,Parabacteroides johnsonii)亚急性患者明显富集,而Lactococcus,Barnesiella,双歧杆菌kashiwanohense,拟杆菌salyersiae,Lactococcus garvieae大大丰富了在慢性子群。根据α多样性分析,未发现显著差异之间的亚急性和慢性组(数字4 (g)和4 (h))。
3.5。分化与卒中后细菌属功能之间的相关性变化
一些细菌类群(如Barnesiella,Blautia,Coprococcus,肠球菌,Lactococcus卒中后组)显示出了明显分化丰富。显著的正相关性的变化之间的观察普氏菌和FMA-UE ( , ),肠球菌和FMA-LE ( , ),Lactococcus和WST ( , ),和普氏菌和BI ( , ),分别(图5)。显著的负相关性,之间的差异Butyricicoccus和FMA-LE ( , )和肠球菌和夫人( , ),也被发现(图5)。
4所示。讨论
在当前的研究中,我们首先观察肠道微生物群的高α多样性和β多样性在卒中后患者与健康对照组相比,表明卒中后社会的丰富性和肠道微生物群的组成不同于健康对照组。之后,一组微生物群被确认为生物标记(例如,Aggregatibacter segnis和奈瑟氏菌属粘膜区分疾病状态)。此外,灵敏度分析进行了探讨肠道微生物群改变根据出现中风的长度(例如,亚急性和慢性)34]。显著改变肠道微生物群组成观察以及中风的进展。最后,我们还证明了残疾总水平,运动机能为上肢或下肢,吞咽功能和ADL与独特的肠道微生物群的变化显著相关。综上所述,我们的研究结果提供进一步的证据支持的观点,肠道微生物群变化后中风。肠道微生物群之间的虚拟连接改变和功能预后初步观察,而这些观点背后的因果关系需要进一步验证设计良好的动物和临床研究。
肠道微生物群的复杂性和巨大的个人属性的异质性,研究肠道微生物群的作用对中风与动物实验开始,以避免混杂因素的干扰结果观察。通过使用两个不同的小鼠模型的中风,微生物群的生长(例如,厚壁菌门,拟杆菌门,放线菌)以前确定为生物标志物的卒中后微生物群失调,表明微生物群失调可以作为工具来指导中风的诊断和预后预测(35,36]。由于人类和动物之间的差异的肠道微生物群,有几项研究对人类是为了更好地理解卒中后发起的肠道微生物群的变化。例如,一个新的参数称为中风失调指数(SDI)提出了区分中风患者与健康对照组auc范围74.9% - -84.3% (37]。这是第一个提出复合生物标志物占卒中后肠道微生物群的改变。然而,歧视能力的准确性没有高达在当前的研究中。在这里,我们用随机森林模型的一组10显著改变肠道微生物群与auc发现93% - -95%不等。的准确性有识别力的能力进一步加强与我们的模型,这为下面的分析提供了可靠的结果。
卒中后肠道微生物群的变化可以用几个提出理论来解释。例如,中央应激反应引起的胃肠蠕动减少可能导致细菌过度生长(38]。自主神经系统也被卷入调解的影响中风失调(39]。具体来说,卒中后应激反应可能导致不平衡的自主神经系统活动进而增加肠道渗透性通过释放促肾上腺皮质激素和糖皮质激素的荷尔蒙,从而导致肠道细菌易位(40,41]。此外,小鼠模型移植与卒中后粪便微生物群显示更高的炎症性T细胞的表达Th1和Th17表明系统性代谢,免疫,炎症反应可能在卒中后肠道微生物群的变化中发挥的作用[35,42]。阐述上述反应的潜在机制,我们的研究结果初步显示出减少大量的SCFA-producing细菌(例如,Blautia,Fusicatenibacter,瘤胃球菌属)患者的中风。刘和他的同事们还发现,缺乏SCFA-producing细菌与卒中后认知障碍显著相关(43]。移植的粪便微生物群富含SCFAs被发现有效的改善中风(44]。这种保护作用是增强相关的肠道屏障完整性和衰减系统性炎症,这可能提高血脑屏障功能,减少脑水肿,减弱脑损伤(45]。这进一步验证了SCFAs在中风的发展和预后中的作用;它可能作为一种新颖的治疗中风的目标。澄清的具体机制在动物的步骤,这个流还表示,需要推进临床情况下更好的促进从人体试验的应用成果。
此外,卒中后特定细菌的变异可能后续影响区域器官反应。根据我们的结果,增加了大量的投机取巧的病原体在中风患者。投机取巧的病原体的潜在作用,如肠杆菌科据报道与肠上皮功能障碍(46]。繁茂的肠杆菌科可能导致炎症恶化或外源性病原体入侵而内部稳态中断(47]。这些生物人体之间的通信和肠道微生物群可能突出中风管理的新靶点。我们还观察到减少潜在的益生菌。基于文献回顾,益生菌和益生菌和益生元的组合可能会改变肠道微生物的复合神经炎症变化和细胞因子释放紧随其后。另一方面,益生菌是证明增加脑源性神经营养因子(BDNF)和抑制细胞凋亡48]。综上所述,中风的特定的细菌可能会影响预后。识别这个独特的肠道微生物群的发展可能导致创新的治疗目标。
虽然我们观察到上述承诺变化的肠道微生物群的潜在内部机制的解释随后的后果,下一个问题是,“应该有某些潜在的肠道微生物群的变化之间的相关性和全局函数”的基础上,新发现的肠道微生物群在健康和中风的变化状态。丰富的Christensenellaceae和Ruminococcaceae据报道与署得分呈正相关,夫人肠杆菌属是负相关49]。我们的研究结果初步表明,全局函数,包括残疾总水平,运动机能,吞咽功能和ADL,明显与独特的肠道微生物群的改变有关。有一些研究已经发表的有关探讨卒中后微生物和预后之间的关系。李等人报道的负相关肠杆菌属夫人得分在一个月49]。类似的结果也已经观察到在我们的研究中。除此之外,普氏菌被发现与运动功能和ADL。可能的解释是,普氏菌被认为是与粘膜炎症有关,这可能会影响卒中后功能恢复由于免疫反应(50,51]。然而,下一个挑战在我们面前的是回答“是否独特的肠道微生物群的改变是卒中后神经可塑性的原因或结果。“这将进一步提高我们对角色的理解“gut-microbiota-brain轴心”在中风和促进发展的治疗目标选择。
目前的研究有几个优点和局限性。首先,我们应用随机森林模型估算出独特的肠道微生物群在中风患者和健康对照组。这个动作的准确性进一步提高辨别能力检测独特的肠道微生物群与先前的研究。尽管如此,结果应该进一步的验证和确认这几个子群分析大样本的微生物群的差异可以被执行。此外,当前的研究初步报告潜在的肠道微生物群的变化之间的相关性和全局函数而底层机制和肠道微生物群之间的因果关系,系统和神经反应,和全球功能变化需要进一步研究建立了整个画面的角色“gut-microbiota-brain轴心”在中风的上下文。
5。结论
总之,卒中后肠道微生物群与健康对照组相比明显修改。stroke-induced转变的主要特征成分SCFA-producing细菌的丰度下降,增加了大量的投机取巧的病原体。显著改变之间的关联发现独特的肠道微生物群和卒中后功能预后。更好的理解准确的肠道微生物群之间的相互作用,系统和神经反应,和全球功能变化可能有助于确定新的治疗目标改善卒中后功能恢复。
数据可用性
使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突,关于这篇文章的出版。
作者的贡献
Yini见鬼,Xintong张,于郑的贡献同样这项工作。
确认
翔宇王博士是感激他的帮助在样本和数据收集。我们还要感谢其他医学和研究人员的康复医学在南京医科大学第一附属医院。这项工作得到了国家自然科学基金(格兰特数字81772441、81772441、82000529和82072546),江苏省自然科学基金(批准号SBK2020042595),南京市科技局(批准号2019060002)。