不同的细胞凋亡和Autophagy-Associated蛋白和基因表达模式在螺旋神经节神经元在大鼠产后发展

文摘

自噬和凋亡有复杂的相互作用在胚胎早期发育。螺旋神经节神经元的发展(胡志明市)除了在哺乳动物耳蜗螺旋器的器官在第一两周产后仍然至关重要。探讨细胞凋亡和自噬的角色在胡志明市的发展,光学显微镜用于观察胡志明市的形态学变化。胡志明市的数量从P1到P7下降并趋于稳定P10好。免疫组织化学结果显示cleaved-caspase3的积极表现,bcl - 2, microtubule-associated蛋白轻链3-II (LC3-II) Beclin1, sequestosome 1 (SQSTM1 / P62)在胡志明市。凋亡和自噬体和自吞噬泡尸体也被在P1和P7透射电子显微镜。实时聚合酶链反应和免疫印迹结果显示凋亡和自噬活动活动达到顶峰P7逐渐调节以及发展。综上所述,我们的研究结果首次表明,自噬和凋亡在胡志明市扮演不同的角色在特定的发育阶段时间的方式。

1。介绍

新生儿老鼠的听觉功能仍然不成熟,和耳蜗结构和功能在产后第二周逐渐达到成熟。不成熟的螺旋神经节神经元的树突(胡志明市)开发神经支配外毛细胞(ohc)和内毛细胞(包含ihc)年底同时怀孕1]。在产后1 - 7天,不成熟的胡志明市分化成类型我胡志明市和II型胡志明市(2]。此外,探明然后通过至关重要的细化和收缩的步骤,建立一个特定的连接类型我胡志明市,包含ihc和II型胡志明市和ohc之间1,3]。随后,举行的花萼在耳蜗核逐渐成熟,从而建立耳蜗的功能输出(4]。这些双胡志明市开发长流程连接在耳蜗毛细胞(高碳钢)与耳蜗神经核的神经元来处理听觉信息所需的精度和速度。之间的特定的和适当的连接周边和中枢听觉系统最终完成产后天10 - 12 (5]。胡志明市的数量在此期间被证明是减少(6]。然而,瞬态退化的潜在机制和分化的胡志明市仍然难以捉摸。

细胞凋亡(“自杀”)和自噬(“自食”)是两个自我毁灭过程发挥重要作用在内耳的发展。同时,他们被认为是重要的成熟高碳钢和胡志明市(7,8),细胞凋亡和自噬对高碳钢的生存至关重要,不同的破坏条件下的胡志明市。细胞凋亡是I型程序性细胞死亡中起着至关重要的作用的发展和分化耳蜗(8]。2000年,尼克里奇等人使用了TdT-mediated dUTP缺口末端标记(TUNEL)技术和结果显示,细胞凋亡显著发生在耳蜗神经节E16天与P1但P1和好[之间偶尔发生9]。然而,Echteler Nofsinger报道约27%减少的数量从P3胡志明市P7 [6]。另一方面,之前的报告表明,自噬与凋亡涉及复杂的连接内耳高碳钢和胡志明市。在大多数情况下,通过加强细胞自噬抑制细胞凋亡反应力的能力。引人注目的是,自噬通过其他途径进行细胞死亡,称为二型或自噬细胞死亡(10]。一些常见的和类似的刺激分子可以诱导自噬或细胞凋亡或两11]。然而,时间自噬活动耳蜗胡志明市出生两周后还没有被报道。因此,自噬和凋亡特征变化在出生后两周使用光和电子显微镜进行了评估。此外,自噬机制如microtubule-associated蛋白轻链基因3-II (LC3-II) Beclin1, sequestosome 1 (SQSTM1 / P62)和apoptosis-related因素包括bcl - 2,cleaved-caspase-3,caspase-3调查发现了微分自噬和apoptotic-associated蛋白质和基因的表达模式及其假定的相关性在胡志明市的老鼠在当下的发展研究。

2。材料和方法

2.1。动物

老鼠(Sprague-Dawley)从上海SIPPR-BK购买实验动物有限公司动物操作都是按照指导实验动物保健机构批准新华医院、上海交通大学医学院。在目前的实验中,产后第一天(P1)是生日。P1, P3, P5、P7 P10,好被认为是生日后的产后时间点。

2.2。Hematoxylin-Eosin(他)染色

大鼠耳蜗( )(P1-P14)被如前所述12]。耳蜗是PFA固定4%,10% EDTA脱钙,由一系列梯度乙醇脱水,嵌在石蜡中。然后,3μ米部分被削减和deparaffinized,其次是明矾苏木精染色与75%和0.15%伊红和二甲苯、乙醇分级系列补液。

2.3。透射电子显微镜(TEM)

麻醉后,老鼠在P1和P7接受心脏灌注与冰冷的2.5%戊二醛(没有。美国σG5882)。耳蜗是解剖和2.5%戊二醛固定24 h和decalculated 10% EDTA。随后,耳蜗与1%锇酸固定2 h在室温下,冲洗3次,有0.1 M PBS,用乙醇和丙酮脱水。耳蜗是沉浸在Epon 812。超薄部分(60 - 70海里)耳蜗的准备。然后,部分与碱性染色柠檬酸铅铀酰乙酸和飞利浦cm - 120透射电子显微镜下观察(阿姆斯特丹、飞利浦、荷兰)。

2.4。免疫组织化学染色

P7鼠耳蜗的石蜡包埋组织部分被封锁在一个1 x PBS缓冲含有5% BSA (C500626 Sangon生物技术,中国)和0.3% Triton x - 100(σ,没有。美国30 - 5140)在室温下1 h,然后在4°C以下主要抗体孵育过夜:anti-MAP LC3II鼠单克隆抗体(1:300;美国圣克鲁斯,sc - 271625), anti-SQSTM1 / P62重组兔单克隆抗体(1:200;美国ab109012 Abcam), anti-Beclin1兔多克隆抗体(1:200;美国ab62557 Abcam), anti-Bcl2鼠单克隆抗体(1:200;GB12318 Servicebio,中国),anti-cleaved caspase3兔多克隆抗体(1:500;GB11009 Servicebio,中国),anti-caspase3兔多克隆抗体(1:500;Servicebio GB11009-1,中国)。与0.01 PBS三洗后10分钟,样品部分是孵化HRP-conjugated山羊anti-rabbit /老鼠免疫球蛋白包含IHC(准备使用)(1:300;D110073 Sangon生物技术,中国)在室温下了40分钟。 After being incubated for 5 mins using a DAB Substrate kit (Sangon Biotech, E670033, China), the specimens were observed under a microscope (Olympus BX43, Tokyo, Japan) and images processed using Adobe Photoshop software.

2.5。定量实时聚合酶链反应

胡志明市的总RNA提取试剂盒氯仿异丙醇的方法,然后,浓度决定。互补脱氧核糖核酸是通过使用TaqMan®逆转录试剂(没有。N8080234 ThermoFisher科学),反应进行了一式三份使用SYBR™绿色PCR大师(没有混合。4344463,ThermoFisher科学)。β肌动蛋白作为内生参考,autophagy-related基因LC3-II,P62,Beclin1和apoptosis-related基因Bcl2和Caspase3被用作目标基因。使用的引物扩增提供了一个表列表1。对目标基因变异系数和内源性基因计算参考。mrna的相对表达水平计算了2^{- - - - - -△△CT}方法。

2.6。免疫印迹分析

样本从孤立中提取P1-P14耳蜗胡志明市。样品解决了蛋白质sds - page 12%聚丙烯酰胺凝胶和转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(美国微孔)。膜被封锁(Beyotime中国)在环境温度下1 h和探索在4°C以下主要抗体在一夜之间:anti-MAP LC3II鼠单克隆抗体(1:1000;圣克鲁斯,sc - 271625), anti-SQSTM1 / P62重组兔单克隆抗体(1:1000;美国ab109012 Abcam), anti-Beclin1兔多克隆抗体(1:1000;美国ab62557 Abcam), anti-caspase3兔多克隆抗体(1:1000;细胞信号技术,没有。9662年,美国),anti-cleave-caspase3兔单克隆抗体(细胞信号技术,没有。9664年,1:1000年,美国),anti-Bcl2兔单克隆抗体(1:2000;中国WL01556 Wanleibio), GAPDH (1: 2000; Proteintech, 60004-1-lg, USA). After three washes, the membranes were incubated with a secondary antibody, HRP-labeled goat anti-rabbit IgG or anti-mouse IgG (1 : 1000; Beyotime, A0208/A0216, China), at 37°C for 1 h. Subsequently, the chemiluminescence reagent (Millipore, ,美国)是利用开发免疫反应性的乐队,和图片进行了分析使用Bio-Rad ChemiDoc XRS + (Bio-Rad公司,美国)。至少有三个独立的实验。

2.7。统计分析

数据表示为 ,和所有实验至少重复三次。使用GraphPad棱镜6软件进行了统计分析。学生的 - - - - - -测试是用来判断不同群体之间的显著影响。 被认为是显著的。图像J软件被用来测量横截面积和计算胡志明市计算的密度胡志明市(耳蜗胡志明市的数量除以横截面积)。

3所示。结果

3.1。在胡志明市产后发展形态和定量变化

他在P1-P14染色胡志明市的老鼠显示形态过渡的中间(图1)。个人胡志明市的大小显示显著增加,细胞质和细胞核的比率逐渐下降从P1到好(图1)。增长率超过第一个产后一周记录在产后第二周。胡志明市的密度下降了约33%在第一周,然后从P10趋于稳定好。周围骨壁的骨化胡志明市P7开始。但是,P7之前,一个明显的界限不成熟的胡志明市和未分化间充质细胞被证明是缺席。雪旺细胞逐渐成熟,包括胡志明市胞体和神经突在发展。

3.2。透射电镜下细胞凋亡和自噬在胡志明市

在P1,几个凋亡尸体被显示为细胞质膜起泡,染色质凝聚在核膜,染色质着边,细胞收缩(图2(一)),而核膜,质膜和细胞器都保存完好。连续、神经胶质细胞和胡志明市不能区分(图2(a), A1)。然而,在其他时间点凋亡体很少被发现。在第七页,细胞核,细胞质的比率(图神经元变得明显2(b), B1)。同时,确定了几个自噬空泡和自吞噬泡在胡志明市P7(图2(b), B2-B6)。

3.3。免疫组织化学染色细胞凋亡和自噬

免疫组织化学染色结果LC3-II、P62 cleaved-caspase3, bcl - 2显示积极的自噬和凋亡蛋白的表达在胡志明市(图3在第七页)。

3.4。实时PCR定量分析凋亡基因和自噬基因机械在胡志明市产后发展

实时PCR定量分析的结果显示,自噬机械动态变化的基因和凋亡基因在转录水平上。的表达LC3-II演示了一个上升趋势从P1到好,除了它在P5高于在第七页(图4(一))。的表达P62显示渐进偏差在产后两周(图4 (b)),而的表达Beclin1显示一个增加的趋势(图4 (c))。Bcl2和Caspase3显示出类似的表达式在产后发展趋势。Bcl2在P1表现出最大的表情,这在P3下降了76.3%。的表达Bcl2在第七页增加了1.42倍相比,在P5,紧随其后的是一把锋利的偏差37.3% P10(图4 (d))。的表达Caspase3是显示在P5下降,显示P7发生率最高,显示2.2倍下降相比,在P5,然后从P7下降到好(图4 (e))。产后两周期间,细胞凋亡最初的整体表达趋势增加,然后下降,并且逐渐增加自噬在鼠耳蜗胡志明市(图4 (f))。

3.5。凋亡蛋白免疫印迹分析和自噬机械蛋白质在胡志明市产后发展

免疫印迹分析显示动态改变凋亡蛋白质和自噬机械蛋白质在蛋白质水平。bcl - 2的表达在P7最大化,P10及好(图大幅下降5 (c))。Caspase3表现出相对较低的表达在P1和拒绝进一步在P3,其次是增加在P5和P7大幅减少P10及好(图5 (b))。Caspase3 cleaved-caspase3显示,一个强大的表达式在P5和P7(图5 (c))。凋亡蛋白表达最大凋亡在P7活动。另一方面,LC3-II的表达表现出上升趋势从P1到P10及拒绝好(图6 (b))。P62证明低表达在P1,升高了1.5倍在P3,逐步减少P3好(图6 (c))。的最大表现Beclin1在第七页(图观察6 (d)),这是比观察LC3-II更早。

4所示。讨论

高碳钢在耳蜗中发挥关键作用机械声波转换为神经信号,和胡志明市传输这些信号的听觉皮层听觉。因此,高碳钢和胡志明市听觉功能被认为是至关重要的。在哺乳动物的内耳,高碳钢和胡志明市很容易受到多种损害,但高碳钢和胡志明市的再生能力有限在哺乳动物中,所以大部分受损高碳钢和胡志明市不能自发再生。因此,大多数患者的听力损失是由基因突变引起,噪音,不同的毒性药物,高碳钢的炎症,或老化,导致故障或胡志明市13]。内耳细胞凋亡是由基因引起的,应对各种损害,包括噪声、不同毒性药物、炎症或老化在高碳钢和胡志明市(13]。的表达Bcl2、caspase3 cleaved-caspase3代表凋亡活动水平。我们的研究结果显示,细胞凋亡的活性急剧下降,达到P7 P10,好。因此,P7可能发育时间点被认为是至关重要的。首先,施瓦兹等人发现了胡志明市的数量减少27% P3和P7[之间14),这是符合由TEM检测到凋亡的尸体。第二,据报道,探明在高碳钢完成细化和收缩P8 (3]。最后,胡志明市开始分化成I型和II型胡志明市P7后(2]。caspase3的定量变化表明,细胞数量的减少P3和P7之间可能产生的细胞凋亡由于缺乏营养因素和刺激感官高碳钢(15]。虽然它仍然难以区分是否I型和II型胡志明市进行凋亡细胞死亡基于目前的结果,显示了不成熟的II型胡志明市的最大数量,因为他们之间的松散传入神经支配从ohc P3和P716]。

自噬是一个关键的细胞死亡机制,包括分化和发展(7,17]。它的特点是双层膜泡的结构,称为自噬小体。de Iriarte罗德里格斯等人已经证明了一个双重的Beclin1和Atg9a信使rna表达在e相比,P0 [18),表明自噬活动的upregulation在产后发展与增长。然而,这些基因的表达趋势P0-P14期间,这是一个关键的发展阶段,尚不清楚。在这项研究中,实时PCR结果显示的表达LC3-II和Beclin1的调节,而P62表达下调在耳蜗胡志明市从P1到好。免疫印迹分析结果显示,最大LC3-II和Beclin1蛋白的表达在耳蜗胡志明市P10和P7,分别。

在鸡进行的一项研究表明,抑制LC3-II凋亡细胞的积累导致耳囊泡(19]。这些结果支持自噬提供能量移除受损的细胞器或凋亡细胞迁移和被认为重要的神经前体细胞。此外,Kuma等人发现的氨基酸含量降低等离子体和脂肪组织Atg5- - - - - -,Atg7- - - - - -,Atg9- - - - - -,Atg16突变的老鼠,这些老鼠出生后不久死亡,这表明自噬作为一种能源在围产期(15]。一般来说,调节自噬活动第一个产后一周诱发能量发生细胞凋亡,这山峰在第七页。此外,随着细胞大小和细胞质,细胞核的比例随着的发展,需要大量的蛋白质和细胞器产生高水平的自噬。的分化,激活自噬促进特定受体的营业额和因素以促进不同的细胞命运(7]。此外,成熟分化神经元可能面临各种外部损伤,因此,在刷新细胞内自噬具有自我平衡的作用组件和抵抗外部压力(16]。

更重要的是,细胞凋亡和自噬可能之间的关系要复杂得多猜测(20.]。自噬和凋亡是由共同的上游信号,偶尔结合的过程(21]。在其他病人,两者之间的细胞开关响应以互斥方式(22]。因此,不同的目的自噬和凋亡的蛋白和基因表达模式在产后两周是满足胡志明市的发展要求。然而,细胞凋亡和自噬的分子机器的变化仍然不清楚。

总之,目前的形态学实验显示减少的数量胡志明市和细胞大小在产后的增量发展。第一次时间动态改变的细胞凋亡和自噬P1在鼠耳蜗胡志明市是检查好。P7凋亡的结果达到了顶峰,和自噬在P10达到峰值或在以后的阶段。这表明细胞凋亡和自噬扮演不同的角色在不同发育时间点,尽管在这些时间点不一致的意义显示峰值的表情仍不清楚。因此,进一步的研究是必要的澄清之间的相关性细胞凋亡和自噬以及底层机制在耳蜗发育。

数据可用性

在研究过程中使用的所有数据都可以从相应的作者的请求。

的利益冲突

作者声明没有竞争的经济利益。

作者的贡献

舒乐侯负责研究概念、和数据质量控制和写的手稿。Penghui陈负责数据质量控制和写的手稿。Jiarui陈负责研究概念,免疫组织化学染色法和统计数据分析。联华太阳负责实时PCR实验。Jianyong陈负责数据质量控制。李曰负责耳蜗)实验样本的收集。Junmin陈负责收集耳蜗样品透射电镜实验。Baihui他负责耳蜗胡志明市的收集样本进行免疫印迹。Yuren香港负责TEM实验。欢秦和Dekun高分析数据。 Shuna Li was responsible for the collection of cochlear SGN samples for real-time PCR. Jingchun He was responsible for data quality control. Fabio Mammano was responsible for the study conception. Jun Yang was responsible for data quality control and wrote the manuscript. Shule Hou, Penghui Chen, and Jiarui Chen contributed equally to this work.

确认

这项工作得到了国家自然科学基金(81873698和81873698)。

引用

1. s . m . Echteler”发展隔离在哺乳动物的听觉毛细胞,传入预测”美国国家科学院院刊》上的美利坚合众国,卷89,不。14日,第6327 - 6324页,1992年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
2. m·巴克利,a·f·瑞恩,gdp Housley,”I型和II型螺旋神经节神经元表现出微分生存和neuritogenesis在耳蜗的发展过程中,“神经系统发育》第六卷,没有。1,33页,2011年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
3. l . c .黄m·巴克利k . Lee et al .,“突触概要文件在神经突的扩展、细化和收缩在发展中耳蜗,”神经系统发育,7卷,不。1,p。2012。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
4. r·l·斯奈德和p . a . Leake地形的螺旋神经节预测产后期间耳蜗核发展的猫,”《比较神经学》杂志上,卷384,不。2、293 - 311年,1997页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
5. l .德拉克洛瓦和b . Malgrange耳蜗传入神经支配发展。”听力的研究B部分,卷。330年,第169 - 157页,2015年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
6. s . m . Echteler和y . c . Nofsinger开发产后耳蜗神经节细胞地形的,”《比较神经学》杂志上,卷425,不。3、436 - 446年,2000页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
7. 联合国水岛和b·莱文,“自噬在哺乳动物发育和分化,”自然细胞生物学,12卷,不。9日,第830 - 823页,2010年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
8. 美国Sanchez-Galiano y莱昂,Gorospe,“程序性细胞死亡在脊椎动物内耳的发展,“细胞凋亡,9卷,不。3、255 - 264年,2004页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
9. l·e·p·尼克利奇Jarlebark, t . e . Billett和p·r·索恩”发展中鼠耳蜗细胞凋亡及其相关结构,”大脑发育的研究,卷119,不。1,第83 - 75页,2000。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
10. e·h·Baehrecke,“自噬:双重角色在生活和死亡?”自然评论分子细胞生物学》第六卷,没有。6,505 - 510年,2005页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
11. f . Demarchi c . Bertoli t Copetti et al .,“Calpain macroautophagy需要在哺乳动物细胞中,“《细胞生物学》杂志上,卷175,不。4、595 - 605年,2006页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
12. l . j . Liu Cai, y, j .杨“细胞凋亡表达模式和改变Kolliker apoptosis-related因素支持细胞的体内器官在老鼠出生后早期阶段,“欧洲组织化学杂志,卷61,不。3,第2706条,2017年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
13. j·w·严,w . Liu Qi et al .,“三维培养系统与人工基底膜促进净化螺旋神经节神经元在体外生存和功能,“分子神经生物学,55卷,不。3、2070 - 2084年,2018页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
14. m·a . m . Schwartz Parakkal, r·l·加里“产后发展螺旋神经节细胞的老鼠,”美国解剖学杂志》上,卷167,不。1,33-41,1983页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
15. a . Kuma m·波多野m .松井et al .,“自噬的作用在早期新生儿饥荒时期,“自然,卷432,不。7020年,第1036 - 1032页,2004年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
16. m·p·泰勒和k·科克加德“潜在颠覆autophagosomal通路由小核糖核酸病毒”自噬,4卷,不。3、286 - 289年,2014页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
17. f . Cecconi b·莱文,“哺乳动物发展:细胞中自噬的作用改造而不是细胞死亡,”细胞发育,15卷,不。3、344 - 357年,2008页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
18. r . de Iriarte罗德里格斯,s . Pulido l . Rodriguez-de la Rosa m . Magarinos i Varela-Nieto,“Age-regulated自噬在鼠标内耳功能,“听力的研究部分,卷。330年,39-50,2015页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
19. m . r . Aburto h . Sanchez-Calderon j·m·哈里领导Varela-Nieto,和m . Magarinos”早期耳发展取决于自我吞噬凋亡细胞间隙和神经分化,“细胞死亡和疾病,3卷,不。10篇文章e394 2012。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
20. m . c . Maiuri e . Zalckvar a .泡菜和g .获得“自食和自杀:自噬和凋亡之间的串扰,”自然评论分子细胞生物学,8卷,不。9日,第752 - 741页,2007年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
21. s . Yousefi r . Perozzo。施密德et al .,“Calpain-mediated乳沟Atg5开关自噬细胞凋亡,”自然细胞生物学,8卷,不。10日,1124 - 1132年,2006页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
22. 瞿x, z邹,问:太阳et al .,“自噬gene-dependent在胚胎发育过程中,凋亡细胞的清除”细胞,卷128,不。5,931 - 946年,2007页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索

版权

版权©2020舒乐侯等。这是一个开放分布式下文章知识共享归属许可,它允许无限制的使用、分配和复制在任何媒介,提供最初的工作是正确引用。