面部神经的再生潜力运动神经元在大鼠慢性轴索显微外科术

文摘

背景。神经再生的确切机制尚不清楚。面部神经再生的潜力和可能的机制包括慢性面部神经损伤后应进一步研究。方法。成年雄性Wistar鼠用于模型要么(我)面部神经损伤(轴索显微外科术)或(ii) reinjury(慢性轴索显微外科术之后,第二个在5个月内轴索显微外科术)。老鼠们被安置在眼睛的动物设施和ENT医院上海医学院的复旦大学(上海,中国)。嘘的表达(声波刺猬)和生长-蛋白43 (GAP43神经元标记)中检测出双边面部核使用逆转录酶聚合酶链反应,免疫印迹分析和免疫组织化学。幸存的运动神经元的数量是量化,面神经再生使用透射电子显微镜检查。结果。Reinjury面神经的12周后的第一轴索显微外科术导致upregulation GAP43 mRNA和蛋白表达在神经元侧轴索显微外科术;免疫组织化学显示,嘘表达较高而控制面部原子核在同一时间点。随后GAP43表达减少。结论。最大的再生潜力的面部神经发生在大鼠慢性轴索显微外科术之后,5个月内和再生可能涉及嘘信号通路。

1。介绍

外围面瘫是特点是瘫痪的面部表情肌肉的影响方面,和面部肌肉运动障碍是主要的特点,造成巨大的心理压力,精神创伤的患者。不管什么原因,外围面瘫,如果药物治疗是无效的,他们应该考虑早期手术治疗(1- - - - - -4]。

尽管如此,一些学者认为面神经再生能力大于其他神经元在中枢神经系统;在这方面,面神经周围运动神经非常相似(5- - - - - -8]。对于那些面瘫患者很长一段时间,术后疗效往往不理想(1- - - - - -4];最重要的原因是最面神经运动神经元的损失,导致面部神经再生的能力下降9]。

多年来,研究人员从未停止过寻找有效的治疗方法,促进面神经再生(10- - - - - -13]。

之前的研究表明,神经损伤诱导各种分子的反应可能参与受伤神经元的再生(11,13- - - - - -16]。在神经元,疗效和神经营养因子的特异性来支持再生取决于各自的受体的存在及其数量。神经生长因子受体,FGF-2 BDNF, GDNF, IGF-I神经元和合成的调节轴索显微外科术。塞茨等人的研究和分析表明,周围神经损伤后运动功能的恢复与一个复杂的监管lesion-associated神经营养因子和细胞因子,包括脑源性神经营养因子、FGF2, IGF2, IGF1和神经生长因子蛋白(17]。

一些学者也取得了一些进步在促进受伤的面神经功能的恢复通过降解神经导管和脂肪细胞肉瘤18),通过地方政府的神经导管(如神经营养因子)19)或注入干细胞神经导管(20.- - - - - -23]。

不管是哪种方式促进面神经损伤后的再生,如何保护或减少运动神经元的nonapoptosis面神经损伤后确实是最关键的一步改善面部神经再生修复的(9]。尽管许多分子参与面神经修复的特点,神经再生的确切机制尚不清楚。有趣的是,一些研究表明,电刺激能促进周围神经再生和功能恢复面部神经麻痹和神经瘫痪肌肉的神经移植24- - - - - -26]。然而,电刺激促进神经再生的机制尚不清楚,我们猜测这可能是有关电刺激末梢神经,激活再生或功能保护神经信号通路。

哺乳动物有三个基因与Hh同源基因(声波刺猬(嘘),印度刺猬(本次),和沙漠刺猬(Dhh))。嘘信号扮演了重要的角色模式和细胞命运规范在中枢神经系统,和嘘显示低表达在神经干细胞/祖细胞背端脑。嘘信号在开发可以调节大脑皮层中间祖细胞,从而维持增殖,生存和分化的神经元在大脑皮层27- - - - - -30.]。

在成年大鼠,声波刺猬(嘘)表达式是调节面部神经轴索显微外科术24小时后然后开始下降4周后(31日]。虽然再生的确切分子电路还不清楚,这个表达式模式意味着函数在成熟的运动神经元(嘘32]。

在这项研究中,我们调查了潜在的面部神经再生和是否受到嘘的激活信号通路的影响。

2。方法和材料

2.1。动物

成年雄性Wistar鼠(重200 - 250克)被安置在动物的眼睛和ENT医院上海医学院,复旦大学(上海,中国)。所有动物实验和护理协议进行机构的伦理委员会的批准下护理和使用实验动物。

2.2。轴索显微外科术模型

动物实验是在全身麻醉下进行使用的腹腔内注射盐酸氯胺酮的混合物(135毫克/公斤)和甲苯噻嗪盐酸盐(6.5毫克/公斤)。动物被分成两组。在我组(轴索显微外科术),正确的面部神经干细胞(包括耳后分支)是断掉的约3毫米远从茎突乳突的孔,一个2毫米的神经末梢被移除,远端树桩的结扎,以丝线从他们的目标,防止轴突的再生,以丝线是用于标签神经假肢。组II (reinjury涉及慢性轴索显微外科术紧随其后的第二轴索显微外科术),在12日,20日,28日,36周(w)在最初的面部神经轴索显微外科术之后,在1毫米神经假肢(包括耳后分支)reaxotomized和远端树桩和3 - 0丝线结扎。完整的侧方担任控制。有10个老鼠在每个实验小组在每个观测时间。

2.3。组织收集

13岁,21岁,29岁,37 w在最初的面部神经轴索显微外科术组,我和1 w面神经reaxotomized后在第二组中,十只老鼠被随机选中。五个是transcardially灌注生理盐水(0.9%氯化钠)其次是4%多聚甲醛(PFA)。这些老鼠被移除的脑干,PFA 24 h后缀在4%,脱水在随后磷酸盐(PBS)含15%蔗糖30%蔗糖/ PBS的解决方案。组织快速冷冻,然后储存在-80°C。日冕脑干部分被切割的厚度20μ低温恒温器,用于免疫组织化学。每个治疗组随机检查,消除任何系统处理偏差。剩下的五个老鼠迅速全身麻醉下斩首。大脑被迅速并存储在液态氮,直到所需的逆转录酶聚合酶链反应(rt - PCR)和免疫印迹分析。

2.4。免疫组织化学

细胞形态学检查了1%甲苯胺蓝染色幻灯片(σ,圣路易斯,密苏里州)。短暂,幻灯片放在蒸馏水为2分钟后1%甲苯胺蓝20分钟40°C。幻灯片然后用水涮洗,其次是95%的乙醇和盖玻片覆盖。

免疫组织化学进行了识别细胞的表达生长- protein-43 (GAP43),嘘,胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)。双荧光标记进行识别细胞的表达GAP43嘘——或GFAP-positive细胞使用鼠标单克隆抗体anti-Shh(σ1:1000稀释)和多克隆anti-GAP43(兔子anti-rat GAP43, 1: 500稀释;Abcam,剑桥,英国)和anti-GFAP抗体(兔子anti-rat GFAP, 1: 100稀释;σ)。Cryosections PFA包含固定在4% 0.5% Triton x - 100在孵化主要抗体在一夜之间在4°C。部分被洗和孵化二级异硫氰酸荧光素(FITC)标记抗体(山羊anti-rabbit, 1: 200稀释;杰克逊ImmunoResearch西树林,PA)或异硫氰酸tetramethylrhodamine——(TRITC)标记抗体(山羊anti-mouse, 1: 200稀释;杰克逊ImmunoResearch)。荧光图像捕获使用共焦显微镜(徕卡,位于德国)和分析图像专业+软件6.0版本(媒体控制论,罗克维尔市,MD)。

2.5。逆转录聚合酶链反应(rt - pcr)

冷冻大脑茎冠方向很快被分组在一个厚度为100μ使用低温恒温器。两部分的实验和控制面部原子核在同一位置(基于位置在脑干)的老鼠在试剂盒均相试剂(表达载体,卡尔斯巴德,CA)。总RNA提取和使用上标™三世第一链反向转录合成系统rt - pcr试剂盒(表达载体)。PCR反应包含3μL (cDNA、5μ1.5 L (10×PCR缓冲μL MgCl 50毫米₂,1μ10毫米核苷酸混合物(0.2 Lμ每米)1μL(底漆(0.2μM / L), 1μ反义底漆(0.2 Lμ0.2 M / L)μL(1单位)的白金Taq DNA聚合酶(表达载体),和H₂O生成总量的50μ使用5 l . GAP43 PCR反应进行 - - - - - -ATGCTGTGCTGTATGAGAAGAACC-3(意义)和5 - - - - - -GGCAACGTGGAAAGCCGTTTCTTAAAGT-3(反义)引物32]在下列条件下:94°C 2分钟;30 94°C的周期为30秒,30秒57°C, 72°C 45秒;在72°C和最终扩展10分钟。GAPDH-specific引物(31日]5 - - - - - -TCGTGGAGTCTACTGGCGTCTT-3(意义)和5 - - - - - -CCTCTCTCTTGCTCTCAGTATC-3(反义)。GAPDH是作为内部控制。所有的引物合成了Sangon生物工程有限公司(上海,中国)。放大产品和100个基点DNA梯(豆类生物、Kusatsu、日本)3%琼脂糖凝胶电泳分离,可视化使用溴化乙锭染色和紫外线。

2.6。免疫印迹分析

蛋白提取试剂盒使用试剂根据制造商的指示。蛋白质浓度测定用BCA分析工具包(Bipec生物制药公司(美国)与牛血清白蛋白标准然后使相等。样本在100°C变性5分钟,12%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,并转移到0.45μm聚乙二烯二氟化物膜(Immobilon-P;EMD微孔,伯灵顿,MA)。溶液的膜被50毫米三HCl, 100毫米氯化钠,和0.1%的Tween-20, pH值7.4 (TBST)含5%脱脂奶粉,其次是孵化1:500稀释的多克隆兔anti-rat GAP43抗体(Abcam) 5%脱脂奶粉(TBST)一夜之间在4°C。膜清洗三次与TBST缓冲5分钟每进一步孵化1:2000稀释辣根过氧化物酶,(合)共轭山羊anti-rabbit免疫球蛋白在室温下2 h。洗膜后,合活动使用增强化学发光检测设备(罗氏诊断,曼海姆,德国)。GAPDH(1: 5000年,鼠标anti-GAPDH;Kangcheng、上海、中国)作为内部控制。x射线放射自显影法进行使用柯达X-Omat BT电影(罗彻斯特,纽约)。

2.7。面部神经干细胞甲苯胺蓝染色和透射电子显微镜(TEM)

通过面部神经干细胞再生轴突发现semithin部分甲苯胺蓝染色和面部神经干细胞超薄部分透射电子显微镜分析。

2.8。数据收集和统计分析

GAP43的光学密度测量使用数量一个软件版本4.4.0 (Bio-Rad大力神,CA)。对于每一个老鼠,幸存的运动神经元的数量被计数量化包含可见nucleus-nucleolus神经元的数量每一秒20μ部分在整个面部核的长度。运动神经元数量记录为运动神经元的百分比侧轴索显微外科术和画的均值和标准错误的意思。单向方差分析进行使用占据8.0软件(占据,大学城,TX)和 被认为是显著的。

3所示。结果

3.1。Reinjury后,GAP43 mRNA和蛋白在面部运动最初调节,然后逐渐下降

荧光标记是用来识别细胞的表达GAP43面部神经轴索显微外科术和reaxotomy之后。我在动物的面部神经豚鼠组(只轴索显微外科术),GAP43表达在低水平上控制端(图1(一)(图)和慢性微一边1 (b))。然而,GAP43戈瑞特一边表达逐渐减少。动物reaxotomy 12 w表现出更高的GAP43表达式在身体的同侧的面部核(图1 (d)相比控制端(图)1 (c))。在28 w在最初的轴索显微外科术之后,GAP43表达式戈瑞特并没有高于控制,可能是较弱的。

GAP43 mRNA转录被总RNA的rt - pcr分析纯化semiquantified从面部核五个独立的实验。在我组动物(仅轴索显微外科术),GAP43成绩单在微端存在下级与控制方面12相比,20日,28日和36 w轴索显微外科术之后(图2(一个))。然而,正如显微镜观察到,GAP43 mRNA表达调节在受伤方面与控制的第二组动物reaxotomized 12 w后最初的面部神经轴索显微外科术。然而,GAP43 mRNA出席一个类似级别的控制方面执行reinjury时20 w或28 w。在36 w, GAP43转录水平低在受伤方面与控制(图2 (b))。

免疫印迹分析用于semiquantify GAP43蛋白质的表达,这是可视化为36 kDa乐队。实验时间点组我(单轴索显微外科术),GAP43蛋白质低的受伤与控制(图2 (c))。二组(reaxotomy) GAP43蛋白表达增加当reaxotomy 12 w或20 w后执行最初的面部神经轴索显微外科术。GAP43的表达蛋白相似的控制在28 w,但降低36 w(图2 (d))。

3.2。最初面部神经轴突再生,然后逐渐减少戈瑞特

当执行reaxotomy 12 w或20 w,甲苯胺蓝染色和透射电子显微镜显示戈瑞特一侧面部神经轴突的再生。在28 w,显著降低再生轴突的数量(数据没有显示)。

利用透射电子显微镜,再生轴突和少量的雪旺细胞可以可视化。大部分地区充满了胶原纤维,和perineuria似乎正常。然而,几乎没有幸存的观察轴突和perineuria出现倒塌在28 w(图3)。

3.3。之间的关系变化面神经再生潜力,嘘

3.3.1。嘘不GAP43-Positive神经元和胶质细胞中表达

双荧光标记包含双边面部的脑干核和随后的激光扫描共聚焦荧光显微镜显示,尽管GFAP-positive胶质细胞不表达嘘,大多数GFAP-positive细胞靠近或缠绕在Shh-positive细胞(图4)。GAP43的标记神经元,GAP43-positive面部神经细胞表明运动神经元。这些运动神经元表达上级嘘比GFAP-positive细胞(图5)。此外,我们的研究结果表明,神经胶质细胞被激活后reinjury面部神经的,他们主要定位在Shh-positive运动神经元细胞。

3.3.2。面部神经Reinjury后,随着时间的推移嘘蛋白表达减少

在我组单轴索显微外科术动物,双荧光标记的面部GAP43的核显示较弱的表达和嘘相比,微端与控制方(数据没有显示)。II戈瑞特组动物,GAP43的表达和嘘戈瑞特一边高12 w与控制面部核(图6)。Reinjury在36 w在最初的轴索显微外科术导致GAP43和嘘表达水平不高于观察到在各自的控制。后36 w, GAP43的表达和嘘下降更多。

4所示。讨论

面部神经轴索显微外科术在成年大鼠导致三分之一的面部运动神经元的变性33]。神经元的损失需要几周和不理解如何以及为什么剩下的三分之二的面部运动神经元生存。然而,众所周知,神经元有可能再生一段后面部神经轴索显微外科术(34,35]。

因素影响轴突的命运后面部神经轴索显微外科术包括大分子逆行运输缓慢,如细胞因子和营养因素,以及失去target-derived营养因素(34,36,37]。遗传因素也可能与潜在的再生有关。

通常,面瘫患者不能立即动手术,这意味着手术修复面神经可能发生长在最初的瘫痪。的时间内修复手术仍然是有效的还不清楚。面部神经假神经瘤附近的脑残面瘫移植手术前需要移除。这个初始删除后,神经移植。是否以及在多大程度上面神经再生取决于其再生潜力面神经后树桩。如果面部神经再生的能力极低,维修很困难,即使在神经移植已被执行。

这项研究的结果表明,面部神经再生主要发生在长期的早期reinjury微面神经。因此,面部神经的再生潜力与第二轴索显微外科术的时机。有趣的是,只有早期reinjury(发生损伤后不到5个月)诱导upregulation嘘,Smo,而后来reaxotomy没有效果。

嘘强免疫反应性观察面部运动神经元的细胞体(GAP43-positive细胞),但没有发现星形胶质细胞的细胞体(GFAP-positive细胞)。嘘的选择性upregulation reaxotomized豚鼠可能在改变其功能发挥着重要的作用。运动神经元再生可能依赖嘘,这可能影响再生通过不明分子(到目前为止)。额外的研究嘘信号就需要精确地阐明如何保存在手机网络神经再生。

我们的研究还表明,嘘调节时间的方式。面部神经轴索显微外科术三个月后,在面部核嘘实验与控制相比显著降低。面部神经轴索显微外科术之后,豚鼠面部核没有目标;因此,我们假设,导致观察到的嘘减少的目标。然而,随着近三分之一的面部运动神经元丢失和较低的表达嘘可能仅仅是由神经元的缺失造成的。

我们的实验表明,后来reinjury的时间点,较弱的嘘表达式,同时较弱GAP43表达式。我们推测,也许是因为嘘激活能力的降低可能导致减少面部神经再生。众所周知,星形胶质细胞反应发生在面部神经损伤后神经元;星形胶质细胞是神经细胞和调节密切相关的开发和修复中枢神经系统。由星形胶质细胞分泌多种细胞因子也起着重要的作用在调节信号传输和突触传递5),本研究进一步证实了。

我们建议在面部神经轴索显微外科术之后,剩余的功能运动是不同的。幸存的豚鼠在亚态,虽然部分的运动仍然是可行的,他们非常贫穷的神经纤维再生的能力。我们推测,嘘信号被激活,下游调控转录因子中扮演重要角色的逆转这些亚态神经元,随后刺激神经再生的能力。

我们还发现,面部神经轴索显微外科术在4个月后,面部神经perineuria分解和髓鞘可以被检测出来。然而,最初的轴索显微外科术5 - 7个月后,神经的神经束膜消失了,剩下的空间已经被纤维结缔组织取代。这是另一个原因微面神经手术应尽早进行。

临床上,对于一些不能接受手术的患者面部神经损伤后不久,在后期手术治疗,包括面神经减压,可以视为面神经reinjury。我们的研究结果为临床治疗意义治疗面神经损伤后,意味着可以通过转基因促进再生。我们已经表明,初始轴索显微外科术之后,有一个关键时期,决定了面部神经再生的潜在的初始轴索显微外科术之后,嘘信号通路的激活是reinjury后面部神经再生密切相关。

5。结论

本研究的目的是探讨面神经再生的性质,以便更好地理解关键时间点和再生机制。在大鼠面神经慢性轴索显微外科术之后,面部神经的再生潜力在5月达到顶峰,也许可能是依赖嘘信号通路的激活。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。

伦理批准

所有协议涉及动物实验动物保健和使用委员会批准的复旦大学。

的利益冲突

作者宣称他们没有竞争的经济利益或个人关系可能出现影响工作报告。

作者的贡献

李语素倪和华为设计了这个实验研究。语素倪Diyan陈,江,Danhong秋和温家宝李执行实验动物程序和所有结果的评估参数和组织分析。语素倪写的手稿,李和华为修订手稿的最终稿。所有作者阅读和批准这个手稿的最终版本。Drs。语素倪、Diyan Chen和彝语江同样对本文亦有贡献。

确认

我们感谢的电子显微镜实验室的技术员复旦大学上海医学院的透射电子显微镜样品。这项工作得到了国家自然科学基金的资助中国(81230019)、上海自然科学基金会的科学与技术委员会(zr1404600 17日)。

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