Cisplatin-Induced条痕Vascularis损伤与炎症和纤维化有关

文摘

的条纹vascularis (SV)生成endocochlear电位(EP)在内耳和是必要的适当的毛细胞(HC)转导和听力。细胞连接的建立是不可或缺的组分不同的流体在内耳隔间。耳毒性的药物顺铂可以损伤SV而导致感音神经性听力损失;然而,这种伤害背后的潜在机制仍不清楚。在这项研究中,顺铂腹腔内注射后7天(3毫克/公斤/天)在老鼠中,我们确定的听觉功能EP记录和听觉脑干反应(ABR)的分析,观察SV的超微结构,透射电子显微镜(TEM),并分析了细胞连接蛋白的表达和分布通过免疫印迹,PCR,免疫荧光染色。我们发现EP显著降低而ABR阈值显著升高cisplatin-treated老鼠;顺铂诱导细胞超微结构变化边际(MCs),内皮细胞(ECs)的周等等。我们发现顺铂侮辱听觉功能不仅减少的表达zonula occludens蛋白1 (ZO-1) MCs的SV还通过减少联接蛋白的表达26 (Cx26)和联接蛋白43 (Cx43) MCs和基底细胞(BCs)。更重要的是,顺铂诱导激活的perivascular-resident macrophage-like黑色素细胞(PVM / Ms)和interleukin-1beta (il - 1β)以及增加profibrotic蛋白的表达在SV第四层粘连蛋白和胶原蛋白等。因此,首先我们的研究结果表明,顺铂诱导纤维化炎症和细胞连接SV的复杂的表情变化。

1。介绍

内淋巴是典型的含钾量高的细胞外液导致80毫伏的电位称为endocochlear潜在(EP),听力的基本驱动力作用[1]。条痕vascularis (SV),异构和非感觉上皮组织侧壁的耳蜗,生成和维护内淋巴的高浓度的钾。的intrastrial fluid-blood屏障分隔的SV末梢循环,和屏障的完整性维护内耳体内平衡至关重要,特别是对于维持EP (2]。破坏的障碍是与听力障碍密切相关,包括自身免疫性内耳病,噪音性听力丧失,老年性听力损失(3,4]。有研究报道,在SV特定细胞类型确定为关键防止泄漏的溶质和生成EP,到目前为止包括边缘细胞(MCs),中间细胞(ICs),基底细胞(BCs) [5- - - - - -7]。MCs脸互相交叉的基底内淋巴和扩展预测ICs的预测运行在两个方向上对MCs水和BCs基底外侧。BCs参与障碍通过相互连接形成缝隙连接(数次),以防止泄漏的离子。此外,SV的其他细胞类型包括perivascular-resident macrophage-like黑色素细胞(PVM / Ms),对周,内皮细胞(ECs) [8,9]。

顺铂是一种广泛使用的化疗药物有效地对各种肿瘤类型。不幸的是,顺铂可以造成严重的毒性副作用通过直接损害毛细胞(高碳钢)和螺旋神经节神经元(10,11,据报道,顺铂干扰SV功能,导致抑郁的EP (12)和膜结合酶的抑制系统(13]。组织学检查cisplatin-induced损害PVM / M的SV由萎缩,肿胀和MCs的起泡,和后者的细胞质空泡形成14]。阿拉姆等人表明,Bax-positive细胞数量显著增加和减少Bcl-2-positive细胞的数量被发现在SV顺铂治疗(15]。然而,顺铂耳毒性的潜在机制复杂,目前还不清楚如果所有的组件构成SV(即。、MCs PVM /女士和毛细管)对顺铂耳毒性也同样敏感。此外,顺铂在SV细胞连接的影响,如紧密连接(套)和数次重要维持离子浓度梯度之间的内淋巴外淋巴,还未知。

鉴于上述情况,我们假设爆破引起的顺铂耳毒性的影响可以改变内皮细胞连接的层。在这里,小鼠腹腔注射(i.p)与3毫克/公斤顺铂连续7天,我们发现顺铂损害了SV通过改变细胞连接蛋白的表达zonula occludens蛋白1 (ZO-1)联接蛋白26 (Cx26)和联接蛋白43 (Cx43)。更重要的是,我们发现顺铂诱导interleukin-1beta (il - 1β)激活和增加的表达profibrotic第四层粘连蛋白和胶原蛋白等蛋白质,以及导致结构细胞的形态学改变结在SV分量。这项工作建立基础探索cisplatin-induced SV损伤的潜在机制和可能提供新的治疗目标预防SV障碍造成的听力损失。

2。材料和方法

2.1。动物与顺铂管理局

C57BL / 6小鼠获得山东大学动物中心(济南,中国)。老鼠被安置在一个温度控制(20 - 22°C)的房间,一个12/12 h光/暗周期和免费的食物和饮用水。实验进行年龄,sex-matched 6 - 8-week-old老鼠重17-23 g。适应了一个星期后,小鼠随机分为两组( 每组)根据管理顺铂(江苏Haosen制药有限公司、江苏、中国)剂量如下:对照组,给小白鼠腹腔内(i.p)注射0.9%生理盐水(顺铂的车辆,0.6毫升/ 100 g)为7天每天一次;顺铂组小鼠腹腔注射3毫克/公斤顺铂在0.9%生理盐水为7天每天一次。

所有研究协议被山东大学动物保健委员会批准,符合指南的护理和使用国家卫生研究院的实验动物。

2.2。听觉功能评估

老鼠的听觉功能评估了听觉脑干反应(ABR)分析。ABR反应测定猝发音刺激4、8、12、16、24、32 kHz使用TDT系统3(美国佛罗里达州Tucker-Davis技术、Alachua)与1024重复刺激/记录声音隔离展台。简而言之,共有36老鼠( 每组)进行麻醉的甲苯噻嗪(10毫克/公斤)和氯胺酮(100毫克/公斤)的ip注入和放置在一个温暖的加热垫在ABR录音。插入耳机的声音输送管紧密安装到外耳道;电极针插入皮下组织的顶点(记录电极),侧耳朵(参比电极),并返回(地线)。声级开始从90分贝声压级(SPL)和减少5 dB增量的听觉阈值。在每个频率、ABR阈值确定,指最小SPL导致可靠的ABR与一个或多个记录的波,通过目视检查可以明确确定。需要重复这个过程在门槛低:确保波形的一致性。ABR听证会测量后,组织从相同的老鼠被用来进行组织学、生化、分子分析。

2.3。Endocochlear潜在的记录

小鼠麻醉如上所述,体温维持在37°C使用加热垫。然后,暴露了耳蜗腹方法和骨头的螺旋韧带基底又轻轻地把形成一个小洞(~ 30μ米)。玻璃吸管作为记录电极满3 m氯化钾的阻力12-20 mΩ安装在电动机械手(IVM单身,Scientifica有限,英国)。b Axopatch 200放大器(美国分子器件、LLC)和一个轴突Digidata 1550 b由软件界面的pCLAMP(10.6版本,分子器件、LLC,美国)是用于current-clamp EP的记录。当先进微电极通过圆窗膜鼓阶,可能被设置为0为基准。然后,微电极是先进到通过基膜蜗管记录EP。参比电极被插入颈部肌肉的老鼠。

2.4。样品收集

ABR测量后,老鼠牺牲颈椎错位和颞骨头从头部切除。后删除镫骨卵圆窗和穿刺圆窗和耳蜗顶部,cochleae固定在4%多聚甲醛(PFA) (Sigma-Aldrich、圣路易斯、钼)一夜之间在4°C,然后冲洗37°C磷酸盐(PBS, pH值7.4)来删除任何剩余PFA。正确的cochleae脱钙在PBS含有10%乙二胺四乙酸(EDTA) 30个小时在4°C,脱水历届孵化在10%,20%,和30%蔗糖在PBS,嵌入超频T化合物(美国樱花Finetek Tissue-Tek)冻结部分。冻结部分被切成7μ米部分使用低温恒温器(徕卡CM1850、徕卡、胡桃胡同,德国)。左边的耳蜗的侧壁microdissected骨壁的耳蜗。本地化的色素带耳蜗侧壁,SV是轻轻地microdissected使用细钳和坚持从螺旋韧带小幻灯片预镀celltack免疫荧光染色。

2.5。免疫荧光染色

SV组织和冻结部分permeabilized 0.5% Triton x - 100 (Sigma-Aldrich) 1小时和immunoblocked 1%鱼明胶溶液(G7765σ),另一个1小时。标本被孵化与不同主要抗体:ZO-1 (1: 1000;61 - 7300年热费希尔)、Cx26 (1: 200;LS-B6429-50,生活技术)、Cx43 (1: 400;Ab135763 Abcam)、层粘连蛋白(1:200;Ab30320 Abcam),胶原IV (1: 200;Ab6586 Abcam) alpha-smooth肌肉肌动蛋白(αsma, 1: 200;Ab5694 Abcam)和CD68 (1: 100;Ab53444 Abcam),稀释1%牛血清白蛋白(BSA) PBS,一夜之间,分别在4°C。第二天,细胞被孵化与二次抗体(表达载体、A21202 A21206, A31571, A31573,和A10040)连同DAPI(美国Sigma-Aldrich D9542)在室温下1 h。盖玻片被安装,激光扫描共焦显微镜下观察样品(徕卡SP8;德国徕卡)。

2.6。TEM

动物被斩首深麻醉下,耳蜗组织收集,与PBS洗快,立即放置在3%戊二醛固定的解决方案(pH值7.4)。样本块被削减了 ,根据常规透射电镜样品制备方法清洗,以及1%锇酸(OsO₄)固定、脱水、浸泡和epon 812嵌入式;半和超薄径向部分被剪切了基底和柠檬酸铅和铀酰乙酸电子染色。最后,strial部分使用透射电子显微镜观察(JEOL 1200例,日本)在济南WeiYa生物技术有限公司有限公司(济南,中国)。

2.7。信使rna提取和实时聚合酶链反应(PCR)

SV提取的总RNA, RNA提取工具包(RNeasy迷你QIAcube工具包,试剂盒,瓦伦西亚,CA)。目标基因mRNA的相对表达水平是衡量实时PCR使用一个股份公司22331年PCR机(德国汉堡)。20μl实时PCR反应体系包括2 x SYBR绿色预混料Taq交货10μl (RR42LR豆类生物技术),1μg cDNA模板,1μl正向引物和1μl反向引物,用去离子水补充剩下的体积。实时PCR参数predegenerated在95°C 3分钟,然后在95°C 40周期的变性50年代,在60°C 45 s退火,伸长为50 72°C。每个PCR的特异性反应证实了融化曲线分析。在这个实验中使用的引物序列如下所示:佐薇- - - - - -1正向引物:5CTCCAGTCAGCCCGCAAAG 3 ,反向引物:5CAAGACAACATCCCCTTCTTGA 3 ;cx26正向引物:5TCGGGGGTGTCAACAAACAC 3 ,反向引物:5CGTAGCATACATTCTTGCAGCC 3 ;cx43正向引物:5TGGCTGTCGGTGCTCTTCATT 3 ,反向引物:5GTGGGCACAGACACGAATATGAT 3 ;胶原蛋白4正向引物:5AATCCCAGGAGGACGAGGTGT 3 ,反向引物:5GGATTACCCACTTGCCCCCAG 3 ;层粘连蛋白正向引物:5GACCTCCCACTTACAGAGCAG 3 ,反向引物:5TGTACCGTGCTGAGGTGAAT 3 ;伊尔- - - - - -1β正向引物:5GATGAAGGGCTGCTTCCAAACC 3 ,反向引物:5GGTGCTCATGTCCTCATCCTGG 3 ;和β- - - - - -肌动蛋白正向引物:5GTCCCTCACCCTCCCAAAAG 3 ,反向引物:5GCTGCCTCAACACCTCAACCC3 。

2.8。蛋白质提取和免疫印迹

SV的总蛋白提取与寒冷里帕裂解缓冲(P0013B;Beyotime生物技术研究所、中国上海)加蛋白酶抑制剂鸡尾酒(P8340;美国σ)30分钟在4°C,然后离心20分钟12000克在4°C。蛋白质浓度由BCA检测化验设备(Shenergy Biocolor生物科学与技术公司,上海,中国。相同数量的蛋白质样品变性在99°C 10分钟和10% sds - page凝胶电泳分离。然后,蛋白质被转移到聚乙二烯二氟化物膜。细胞膜被封锁在5%脱脂牛奶在室温下1小时,然后与不同孵化主要抗体:ZO-1 (1: 200;61 - 7300年热费希尔)、联接蛋白26 (Cx26, 1: 200;LS-B6429-50,生活技术)、联接蛋白43 (Cx43, 1: 200;Ab135763)、层粘连蛋白(1:200; Ab30320, Abcam), collagen IV (1 : 200; Ab6586, Abcam), and anti-β肌动蛋白抗体(1:2000稀释;ZSGB-BIO,北京)3% BSA在一夜之间在4°C。第二天,膜与HRP-conjugated山羊anti-mouse孵化或山羊anti-rabbit免疫球蛋白抗体(1:2000稀释;ZSGB-BIO、北京、中国)在室温1小时。最后,蛋白质信号检测使用ECL工具包(美国微孔,Billerica的),分析了ImageJ软件。所有阻塞、孵化和洗涤TBST溶液中进行(Tris-buffered盐水和0.05%渐变20)。

2.9。细胞计数

至于细胞量化,我们整个耳蜗使用成像 目标和使用ImageJ软件量化immunostaining-positive细胞。在细节中,我们测量的相对规模的长度栏(20μ米图和规模设置为20μm ImageJ软件。然后,我们使用了“选择”工具ImageJ计算immunostaining-positive细胞数量。

2.10。统计分析

所有与SPSS 13.0软件进行统计分析(SPSS Inc .)、美国)。结果表示为 。被independent-samples进行统计比较 - - - - - -测试。差异与值< 0.05被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。顺铂诱发侮辱听觉功能

探讨顺铂对听觉的影响函数,C57BL / 6小鼠在6 - 8周是给定ip注射顺铂(图7天1(一)),我们发现cisplatin-treated EP的小鼠和对照组(图相比显著降低1 (b), ),作为控制和EP cisplatin-treated老鼠 mV和 分别mV。老鼠的听觉功能评估使用ABR测试。ABR阈值升高的顺铂组与对照组在所有频率测量(图1 (c), ),表明顺铂有效的听觉功能受损的老鼠在我们的研究中。

3.2。顺铂SV细胞的超微结构变化

SV的超微结构是由TEM观察顺铂后管理。在控制组织,SV正常形态,所显示的特征差异之间的电子密度深MCs卫星传回的过程和较轻的PVM /女士和BCs(图2(一个))。细胞核的大小和形状正常,出现核仁和大量的常染色质和密集的异染色质(图成比例2(一个))。然而,厚SV和血管在cisplatin-treated观察小鼠与对照组相比。应该注意,大部分的核,很轻,在形状异常。特别是在MCs,核大而圆,而不是椭圆形,通常难以区分和杂乱无章的核仁;此外,MCs萎缩,信息连接中断(图2(一个))。此外,我们的分析表明,线粒体的数量是低得多的SV cisplatin-treated老鼠与控制的相比,线粒体是普遍和发生在一个高度有组织的方式(图2(一个))。此外,超薄部分的分析表明,顺铂治疗导致内皮细胞减少,内质网肿胀,血管壁薄而控制老鼠(图2 (b))。我们还观察到的变化在迁移远离血管周围的周(图2 (b))。

3.3。顺铂改变了表达模式,减少在SV ZO-1的表达

免疫荧光染色法被用来评估顺铂的影响的典型的本地化模式紧密连接蛋白ZO-1经过7天的管理。控制老鼠,ZO-1信号出现在细胞表面和局部MCs的信息枢纽,更加突出和明显的免疫染色的细胞间边界(图3(一个)),这显然表明生理紧张的存在的障碍。然而,MCs的顺铂导致蛋白质移位,导致“zipper-like”染色模式和孔洞,细胞间可见(图3(一个))。此外,西方墨点法和qPCR结果显示显著减少ZO-1表达cisplatin-treated老鼠相比,对照组(数字3 (b)- - - - - -3 (d)),这表明之间的TJ MCs受损后顺铂治疗。

此外,TEM分析还表明,细胞的数量预测互相交叉和套共存与MCs或位于其附近明显减少cisplatin-treated老鼠与控制(图3 (e))。在经典视图,intrastrial fluid-blood屏障是由基底膜和内皮细胞相互连接套(16形成一个扩散的障碍,阻止大多数血源性物质进入耳朵(17]。观测显示内皮细胞核的存在与不规则形态,完整的细胞器在细胞质中,内皮细胞之间和完整TJ结构(数据3 (e)和3 (f))。顺铂曝光后7天,TJs开放和间歇性地扩大相邻ECs(数字3 (e)和3 (f)),表明顺铂耳毒性与一个改变TJ组织。

3.4。顺铂减少Cx26和Cx43表达SV

评估顺铂在GJ蛋白表达的影响,免疫荧光染色和TEM老鼠注射顺铂处理后使用。免疫荧光显示,Cx26基底中表达主要是絮凝剂层和Cx43表达在MCs和BCs,和他们都是局部细胞的细胞质(数字4(一)- - - - - -4 (c))。顺铂治疗导致经常分散染色细胞细胞质的Cx26 BCs(图4(一)),以及减少Cx43信号强度(数字4 (b)和4 (c))。在一些MCs,然而,一个非常强大的线性Cx43信号质膜染色发现了MCs的普遍模式与控制(图4 (b))。进一步定量评价Cx26 Cx43蛋白质和mRNA表达蛋白免疫印迹和qPCR也体现了定性结果(数据4 (d)- - - - - -4 (f))。

TEM的结果显示,在基底层的锚定连接的数量减少(图4 (g)的数量),并数次共存与BCs或位于其附近降低cisplatin-treated老鼠与控制。类似的减少也观察到在螺旋韧带的情况下,通常只包含单个或几个套(图4 (g))。顺铂治疗后,数次的表达和数量明显减少,表明数次在SV受损。

3.5。顺铂的促进Translocalizationα-SMA-Positive细胞SV,增加胶原IV和层粘连蛋白的表达

Myofibroblasts激活成纤维细胞的一个子集,表达的特征αsma的主要细胞类型负责细胞外基质(ECM)过度沉积(18]。我们发现顺铂的translocalization增加α-SMA-positive细胞SV相比控制老鼠(图5(一个))。这些数据表明,顺铂对奖励的影响成纤维细胞转化成myofibroblasts纤维发生过程中。

我们下一个调查在SV ECM的标志是否增加顺铂政府以确定顺铂对小鼠纤维发生的影响。胶原IV主要是表达了MCs的细胞质(图5 (b)),增加蛋白质和胶原IV的mRNA水平被发现顺铂治疗后显著(数字5 (e)- - - - - -5 (g))。我们还观察到一个重要的层粘连蛋白的表达增加(数据5 (d)- - - - - -5 (g)),一个分析血管病变的标志。按照TEM结果图2(d),血管腔变得圆润,迁移到远离周围的周血管(图5 (c))。总之,我们的数据表明,在SV纤维化是诱导顺铂治疗后。

3.6。顺铂激活PVM /女士在SV

研究表明,PVM /女士控制屏障完整性影响紧junction-associated蛋白质的表达(19]。PVM /女士与一个特殊的抗体标记CD68和strial毛细血管Griffonia Simplicifolia IB4 (GS-IB4;图6(一))。我们发现PVM /女士非常投入abluminal表面毛细血管(图6(一))。PVM /女士SV减少的数量统计顺铂治疗后与对照组相比,小鼠(图6 (c))。免疫荧光结果显示PVM / Ms的形态学改变,PVM /女士的体积扩大,和PVM /女士分支机构的数量增加,以及一些的树枝变得平坦,变形的形状(图6 (b))。促炎细胞因子il - 1的相对mRNA水平β分泌PVM /女士也显著增加(图6 (d))。总之,这些数据表明,PVM /女士及其分泌il - 1β可能参与细胞的损伤在SV顺铂引起的结。

4所示。讨论

听力损失是一种最常见的人类感觉障碍,从而影响世界各地的4.66亿人。听力损失可以由各种不同的压力和损伤引起的,如遗传疾病、衰老,噪音声创伤、炎症、感染、接触不同的耳毒性的药物,包括顺铂(20.- - - - - -28]。不幸的是,一旦内耳耳蜗受损,哺乳动物只有非常有限的再生能力,使听力损失不可逆转的哺乳动物(29日- - - - - -35]。听力损失明显降低了患者的生活质量;对于孩子们,听力损失将推迟语言习得和学习能力的影响。因此,为了保护耳蜗和听力是非常重要的。

Cisplatin-induced减少EP, SV生成和维护的过程,后被观察到的应用单一注射大剂量顺铂(36),之后重复系统性管理(37和perilymphatic执政期间38]。在我们之前的研究中,我们观察到3毫克/公斤/天腹腔注射顺铂连续7天可能导致明显的螺旋神经节神经元损害,前庭高碳钢,损伤耳蜗(11,39,40]。虽然在啮齿动物的研究建立了cisplatin-dependent内耳功能障碍和现在有证据表明顺铂对SV产生细胞毒性的影响,顺铂是否改变了信息连接在SV仍然遥遥无期。在这项研究中,第一次,我们发现顺铂引起SV病变的治疗老鼠,这表明cisplatin-induced SV损害可能与炎症和纤维化的过程。

一般来说,顺铂耗尽胞质细胞器,线粒体损害,引起脂质形成的身体和液泡(41]。顺铂的主要影响目标SV MCs和ICs (42,43]。在我们的研究中,我们发现EP cisplatin-treated小鼠相比显著降低,在对照组,表明顺铂损害了SV,因此听觉功能受损的老鼠。一致,我们的TEM结果表明亚核的过程,内质网,细胞核和线粒体顺铂的SV遭到严重破坏。据报道,30分钟后ip 16毫克/公斤注入顺铂,SV水肿可以在场44]。我们发现顺铂治疗(3毫克/公斤/天,7天)导致基底SV水肿区域。与细胞外水肿通常观察到二次循环利尿剂(45),水肿继发于顺铂似乎是细胞内可能占的膨胀和破裂的MCs [42]。Strial毛细血管血流量调节的次要角色但至关重要的作用在维护EP,离子运输和内淋巴的流动资产(1,2]。我们发现顺铂治疗导致的内皮细胞数量减少,血管壁薄。三维天赋成像检测blood-labyrinth障碍(BLB)分解的增强endolabyrinthic流体信号突然听力损失患者(46]。因此,SV顺铂引起的水肿也可能导致BLB分解并增加血管通透性。此外,我们发现顺铂治疗后血管密度的增加。一项研究报道,在颞叶癫痫患者中,血管密度与缺氧和炎症有关47]。但已经有几乎没有任何证据血管重建受顺铂,血管生成的作用,而不是不清楚,需要进一步研究。

套上皮细胞位于外侧,形成选择性细胞渗透性的结构基础。像在其他屏障系统,intrastrial fluid-blood障碍是一个高度专业化的血管上皮基底膜的组成和ECs形成扩散屏障,防止运输最血源性物质进入内耳(17]。套在SV也很重要保持内淋巴之间的离子浓度梯度和外淋巴(5]。ZO-1 TJ位置识别蛋白质,和ZO-1损失导致无序套(48]。在这项研究中,我们发现ZO-1信号出现在细胞表面和本地化的信息结MCs,建议生理紧张的存在的障碍。顺铂曝光后,ZO-1表达降低与SV的功能受损。这个想法是由TEM加强的结果。因此,这些结果表明,顺铂可以摧毁TJ MCs之间的组织和血管内皮细胞,增加SV的渗透率。

GJ蛋白质特定连接素在相邻细胞的细胞膜,细胞间负责电气和化学信号的交换。Cx26在数次的耳蜗细胞参与循环的钾离子从高碳钢的MCs SV和维持细胞内稳态49]。的主要部分(> 50%)nonsyndromic遗传性耳聋是由Cx26基因突变引起的。Cx26损失导致先天性听力损失和耳蜗开发失败,以及发育不良的高碳钢(50]。Cx43在鼠标内耳基因表达和血管系统中扮演重要角色51]。在我们的研究中,顺铂治疗导致经常分散染色Cx26 Cx43的细胞胞浆。锚定连接的数量在基底层SV和螺旋韧带的降低,表明数次在SV和螺旋韧带受损。我们建议减少的细胞连接蛋白是内化的结果进入细胞质。事实上,减少ZO-1信号及其translocalization从膜胞质间被报道是身体与退化GJ组织的塞尔托利氏细胞线(3]。因此,减少Cx43表达cisplatin-treated老鼠的可能结果,至少部分,从减少ZO-1表达式。我们的研究结果使我们能够提出一种工作模式:由顺铂SV受损的细胞连接,从而导致增加渗透性,使不受控制的离子通道和蛋白质,这允许更多的顺铂一起进入内耳,反过来,引发严重的耳毒性和听觉功能障碍。

给答案是否和如何很重要的表达套有关GJ表达式中观察到的变化cisplatin-treated老鼠,和问题引起了TJ和SV GJ蛋白表达下降可能与结构性变化在超微结构水平,目前正在研究在这个实验室。

PVM /女士监管细胞intrastrial fluid-blood屏障在密切接触容器和屏障功能的关键。研究表明,PVM /女士影响屏障完整性影响TJ-associated蛋白质的表达,和损失的PVM /女士与组织水肿[19]。在这项研究中,我们观察到在SV CD68-positive细胞的数量减少顺铂治疗,但剩下的细胞变得规模更大,更长,表明顺铂可以激活和损害PVM /女士在同一时间。一些研究表明,顺铂推广过度生产活性氧和proapoptotic因素耳蜗细胞,导致细胞凋亡,通过激活半胱天冬酶(11,15,52]。我们推测,cisplatin-triggered激活PVM /女士,延长细胞因子影响生产,也可以延长cisplatin-induced内耳炎症。特定的信号基本PVM / M激活仍不完全清楚。il - 1β是一个重要的促炎细胞因子激活的巨噬细胞产生的,被广泛认为是炎症基因的一个标志瀑布(53]。最近的一项研究还显示,PVM /女士在小鼠耳蜗可以激活NLRP3 inflammasome反应和脂多糖刺激+三磷酸腺苷,从而导致il - 1β分泌(54]。我们发现,il - 1β还在SV顺铂治疗后显著增加。在我们的初步实验,细胞因子如- 2、il - 4、il - 10在SV也在小鼠中发现顺铂治疗后;然而,结果表明,这些细胞因子没有明显差异的SV和对照组之间cisplatin-treated组(数据未显示)。我们推测,过度表达il - 1和/或异常的激活β和PVM /女士在耳蜗的恶化可能导致听力功能,需要在进一步的实验研究。

水平的提高层粘连蛋白免疫反应性已报告在血管基膜,脑缺血后(55)和喹啉酸(56)治疗。值得注意的是,类似upregulation在第四层粘连蛋白和胶原蛋白水平在老鼠注射顺铂。层粘连蛋白过度表达的是解释为一种改进的可访问性gliovascular层粘连蛋白抗原决定基断开的连接在受损的血管57]。根据这些作者,gliovascular连接可能会限制的可访问性的血管基膜抗体,因此“隐藏”层粘连蛋白抗原表位。因此,upregulation第四层粘连蛋白和胶原蛋白的表达是BLB修改的后果之一,顺铂促进SV纤维化的进展通过增加ECM组件的表达。的存在α-SMA-positive myofibroblast-like细胞被认为是发展的一个标志肾脏纤维化(18]。在我们的研究中,我们发现增加的本地化αSV -SMA-positive细胞。这些结果是一致的在体外和在活的有机体内研究显示领域fibrosis-activated巨噬细胞生成可溶性介质调节活化和增殖myofibroblasts [58,59]。因此,我们的研究结果表明,顺铂可能促进SV纤维化的进展通过调节巨噬细胞浸润,il - 1的分泌β,第四层粘连蛋白和胶原蛋白的积累。

总之,目前的调查显示,有结构形态学改变老鼠SV细胞的连接组件;TJ和GJ蛋白质是顺铂治疗后大幅下调。我们的研究结果表明,对顺铂诱导的变化可能与PVM /激活女士,il - 1β分泌,ECM超表达。结果报道在此提供的证据表明,顺铂与SV BLB结果的交互易位的细胞连接装置,反过来,可能导致二次损伤内耳。进一步研究在分子机制cisplatin-induced SV损害可能带来新的目标制定具体的治疗方法对顺铂耳毒性。

数据可用性

使用的数据集和分析在当前研究可从相应的作者以合理的要求。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

Na张和Jing Cai的贡献同样这项工作。

确认

这项工作得到了山东省泰山学者计划(Nos. tsqn201909189和ts20130913),中国国家自然科学基金(81700918和81700918号),和山东省级重点工程项目的研究和开发(2017 cxgc1213)。

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