Waardenburg综合征模型中Stria Vascularis的成绩单谱

抽象

背景。Waardenburg综合征是一种罕见的遗传性疾病，其特征是至少有一定程度的先天性听力丧失和色素沉着缺陷。然而，影响血管纹发育的遗传途径尚未完全阐明。方法。Waardenburg综合征血管纹的转录谱采用Mitf-M突变猪和小鼠模型进行研究。因此，我们通过GO分析来识别Mitf-M突变引起的基因表达差异。结果。在猪模型中，有113个酪氨酸代谢、黑色素形成和离子转运的基因发生了显著变化，而在小鼠模型中，有191个基因发生了显著变化。此外，在小鼠和猪模型的血管纹中也存在一些香料特异性基因的改变。紧密连接相关基因，包括Cadm1、Cldn11、Pcdh1、Pcdh19和Cdh24基因，在猪模型中的表达明显高于小鼠模型。两种动物的血管纹中血管相关基因和离子通道相关基因也存在显著差异。与小鼠相比，猪模型中Col2a1、Col3a1、Col11a1和Col11a2基因表达量较高，而Col8a2、Cd34和Ncam基因表达量较低。结论。我们的数据表明，这两种模型之间的基因表达和功能存在显着差异。

1.背景

Waardenburg综合征（WS）是一种罕见的遗传病症，其特征在于至少一定程度的先天性听力丧失和色素沉着缺陷[1]。WS的Mitf等位基因有20多个突变[2那3.),包括Mitf^MI-VGA9.，mitf.^mi-bw.和mitf.^老鼠，已被证实会导致听力丧失和色素沉着变化。虽然小鼠模型广泛应用于耳聋相关疾病表型和致病机制研究[4.-8.[研究人类遗传疾病，还发现了许多缺点。由于小鼠和人类之间存在巨大的革命性差异，因此可能导致解剖学，能量新陈代谢和听觉感知中的巨大生物学差异[9.那10]。例如，小鼠和人类的听觉器官的发育模式是不同的:人的听力在出生前就已经发育，而小鼠的听力直到出生两周后才完全发育[11]。一些研究[4.那12发现人类胚胎发育疾病很难在一些小鼠模型中复制。因此，不同的动物模型，如牛[13]， 马匹 [14,狗15那16，和猪[17也必须用于研究遗传疾病。猪是早熟物种，一出生听觉系统就完全发达。最近的研究也发现耳蜗的解剖结构与人类非常相似[18-21]。由于猪是具有高生殖效率和经济方便的大型动物，因此研究听觉遗传疾病是一个很好的模型[22-24]。

血管纹在维持耳蜗内淋巴电位(EP)中起重要作用，而EP对毛细胞的机械电传导至关重要[25-29]。Stria Vascularis与巨噬细胞样黑素细胞组成，其也称为中间细胞[28那30.那31]。Scala介质中的钾离子由中间细胞产生，侧壁中的钾通道和转运体KCNQ1/KCNE1、KCNQ4、KCNN2、KCNJ10和SLC12A2等也参与了内淋巴电位的维持[26那32-34]。当Stria Vascularis的故障将导致听力损失[35]。例如，马库斯[36报道，KCNJ10敲除可以将EP值从+80 MV降至1 mV，以及k⁺在他们的小鼠模型中，浓度从110毫米下降到60毫米。在我们之前的研究中，我们发现敲除Mitf-M可以将小鼠模型中的EP降低至18 mV [37]。在Mitf敲除猪模型中，我们发现Mitf突变导致EP值从+78 mV降至+3 mV，低于小鼠模型[18]。野生型猪体内钾离子浓度比外周高142mm。我们之前的研究发现，在Mitf突变的猪体内，钾的浓度降到了0毫米[18]。我们认为在小鼠和猪体内可能存在不同的维持EP的基因，Mitf基因的突变可能导致钾离子通道发生不同的变化。为了回答这些问题，本研究试图在RNA转录组水平上检测这两个物种Mitf-M基因突变引起的基因谱变化。由于目前的研究大多仅使用小鼠模型，因此本文将进一步检测大型动物与小鼠模型血管纹RNA转录组的差异。

2.结果

2.1。Mitf-M突变引起的基因表达变化

使用DESEQ封装软件筛选与MITF-M突变引起的猪和小鼠中猪和小鼠中不同基因的激活。纠正筛选差异基因的条件值< 0.05。利用维恩图获得猪和小鼠差异基因的交点。结果如表所示1。MITF突变动物和对照之间有14种常见的差异基因。小鼠模型中有177个特异性差异基因，猪模型中的99个特定差异基因（图1)。

在DAVID数据库上执行GO分析和KEGG路径分析（调整后值<0.05）。结果显示在图中2。MITF突变引起的主要途径是富含酪氨酸新陈代谢（MMU00350）和素质生成途径（Melanogenesis，MMU04916）的Kegg途径。GO分析主要富集离子输送的生物过程（离子运输，GO：0006811）和等离子体膜的整体成分（GO：0005887）（图2)。

2.2。Stria Vascularis特异性离子传输相关的基因分析

从正常和Mitf-m突变猪和小鼠样本的RNA转录组数据中提取离子转运相关基因进行聚类分析。结果显示，通过MeV聚类分析，两种物种中均有许多离子转运相关基因高表达(图)3.)。MITF突变被携带TRPM1.那Kcnj13,Slc45a2两个物种的基因。猪和小鼠的离子通道调节有显著差异。的表达Kcnn1那CLCN2.,TRPM4基因猪比小鼠中那些基因更高，而表达TRPM7.那Kcnq1,Kcnj8与猪相比，老鼠的基因含量更高。

2.3。血管纹中特殊的紧密连接相关基因

从Mitf突变体和正常猪/小鼠的RNA转录组数据中提取紧密连接相关基因进行聚类分析。两种植物血管纹中紧密连接的表达不同(图)4.)。的CADM1.那CLDN11那Pcdh1那PCDH19.,CDH24与小鼠相比，猪的基因表达量更高Ncam那CLDN6.那CLDN9.,CLDN14小鼠的基因表达高于猪。两组血管纹的结构均完好无损。边缘核和细胞连接完好。三层细胞明显，基底细胞紧密相连(图)5.)。

2.4。血管纹特殊血管发育相关基因

从MITF突变体和正常猪/小鼠的RNA转录组数据中提取的血管显影相关基因用于聚类分析。在这两个物种之间的血管血管内血管发育基因存在显着差异（图6.)。的COL2A1那COL3A1那Col11a1,Col11a2猪的基因比小鼠在猪中表达较高，而是COL8A2那CD34,Ncam与猪相比，小鼠在小鼠中表达的基因更高。

3.讨论

该研究综述了耳蜗中MITF-M突变对基因表达的变化。mitf有许多亚型[38，其中M型在黑素细胞中特异性表达[39，通过与相关色素酶如酪氨酸酶(Tyr)、多巴achrome tautomerase (Dct)、内皮素受体B (Ednrb)和溶质载体家族45成员2 (Slc45a2)直接关联，调节黑素细胞的存活、迁移和分化[40]。其中Mitf-M基因[38那39在调节酪氨酸代谢途径和黑色素产生中起关键作用，主要调控下游的色素相关酶如Tyr、Dct、Tyrp1。Mitf-M还控制细胞骨架和细胞间紧密蛋白来调节黑素细胞的形态和迁移。在本研究中，我们发现Mitf-M突变引起的主要基因途径是在小鼠和猪耳蜗血管纹的离子转运途径，包括酪氨酸、酸代谢和黑色素形成途径。我们的数据与以往的报告一致[39]。

我们之前的研究报道了通过缺失Mitf-M基因在Waardenburg 2A猪和小鼠中发生Mitf-M基因突变，导致黑素细胞未能迁移到耳蜗血管纹。它可引起EP滴落和耳蜗毛细胞损伤。在这项研究中，我们还发现钾含量显著下降⁺通道相关基因，即，TRPM1.那Kcnj13那Slc45a2,Kcnj10。根据我们的rna测序分析，clcnka.和Kcnj15基因显示出猪型的显着差异，而Kcnq4那Kcnn4那Kcne1,Kcnj2基因主要在小鼠模型中受到影响。KCNJ13 (KIR7.1)和KCNJ10 (KIR4.1)属于内向整流钾通道类别。KCNJ10是钾转运的关键通道。在耳聋相关疾病中有较深入的研究，其缺失可导致EP和钾离子浓度降低[36那41.-45.]。而Kcnj13、Trpm1、Slc45a2在听觉研究中却鲜有报道。此外，TRPM1是瞬时受体电位(TRP)家族中的非选择性电压门控阳离子通道Mitf突变会导致删除TRPM1.[46.]。SLC45A2是膜转运膜中的交叉介导的黑色素合成[47.]，它受到监管Mitf通过营地的小路穿过酪氨酸和DCT.基因，主要颜料相关的基因[48.那49.]。

两个物种的血管纹转录组数据表明Mitf-M在调控The的表达中发挥了重要作用TRPM1.那Kcnj13那Slc45a2,Kcnj10血管纹的基因。在这两个物种中，Mitf-M可能在听觉发育和耳蜗EP的维持中发挥重要作用。尽管猪和老鼠之间存在巨大的生物学差异，但我们发现这两个物种的共同基因变化都是由Mitf-M引起的。Mitf-M的突变引起的显著变化CLCN2.那Kcnn1,TRPM4两种模型中的基因。clcn2 [34]是氯化物通道的重要组成部分，其坐标钾和氯化物交换。kcnn1的功能尚未在内耳中报告。KCN1属于钙离子介导的钾通道，并在调节神经炎症和MICROGLIA的神经老龄化中起重要作用[50.]。在小鼠中,Kcnq1那TRPM7.,Kcnj8受到显着影响。KCNQ1是钙离子依赖性钾通道[45.]。当缺失KCNQ1时，它会导致外毛细胞的退化，其临床表征为Jervell和Lange-Nielsen综合征，一个导致出生中深刻听力损失的一个条件以及心脏正常节律的破坏。KCNE1和KCNQ1是Stria Vascularis边缘细胞中的重要钾分泌通道[26那45.那51.]。KCNE1调控KCNQ1表达，增加离子输运[52.]。

紧密连接和血管内皮细胞是血迷宫屏障和离子通道的重要组成部分[30.那53.-57.]。我们对来自猪和小鼠的RNA转录组数据的聚类分析表明，这两种物种的Stria Vascularis中，紧密的结在显着差异。的表达CADM1.那CLDN11那Pcdh1那PCDH19.,CDH24与小鼠相比，在猪体内的Ncam那CLDN6.那CLDN9.,CLDN14与猪相比，小鼠的基因含量更高。血管相关基因的聚类分析表明，两种植物的血管纹存在显著差异。猪的高表达为COL2A1那COL3A1那Col11a1,Col11a2，而的表达式COL8A2那CD34,Ncam与猪相比，小鼠的基因含量更高。这些结果可能表明，这两种动物可能会激活不同的基因来调节紧密连接，就像离子通道一样。这两个物种的进化关系、生活习惯和解剖学上的差异可能导致这些基因表达的显著差异[56.那58.那59.]。选择更接近人类的动物模型来研究听觉相关疾病更合适。

综上所述，我们发现利用RNA-seq分析WS模型的血管纹有助于理解EP和耳聋丢失相关的调控机制。这些数据为离子通道定义基因提供了见解，并阐明了可能与WS听力损失相关的基因。这些结果可能对基因治疗挽救血管纹内耳蜗电位的消退具有重要意义。

4。结论

我们的研究表明，这两个模型之间的基因表达和功能存在巨大差异。根据RNA转录组水平的MITF-M基因突变引起的这两种物种的不同表达，可能存在由MITF突变引起的不同基因转录途径调节小鼠和猪中的钾通道。并且该转录组数据可以为治疗Waardenburg综合征的基因治疗提供基础。

5.材料和方法

5.1。动物

实验中使用了Mitf突变体和正常猪和小鼠。Mitf突变猪和小鼠的产生已经在我们之前的出版物中描述过[17那37]。实验方案由中国解放军医学院的伦理委员会批准。

5.2。来自Stria Vascularis组织的RNA分离

猪的血管血管体的组织在胚胎阶段的四个正常猪和四个MITF突变体猪中获得，如前述研究所描述的[17]。小鼠血管纹组织取自出生后30天的10只正常小鼠和10只Mitf突变小鼠[7.那37]。这些组织的总RNA分别使用Trizol试剂(Invitrogen, CA, USA)按照制造商的方案提取。使用NanoPhotometer®分光光度计(IMPLEN, CA, USA)、生物分析仪2100和RNA Nano 6000检测试剂盒(Agilent, CA, USA)分析收集的总RNA的数量、纯度和完整性。大约4μ.如之前的研究所述，总RNA的g用于RNA样品的制备[60.那61.]。

5.3。库的构建与排序

测序文库制备使用的是Illumina®(NEB，美国)的NEBNext®Ultra TM RNA文库准备试剂盒。测序文库制备使用的是Illumina HiSeq TM 2000系统，按照制造商的推荐方案(Illumina公司，美国加利福尼亚州圣迭戈)进行，如之前的研究所述[61.那62.]。

5.4。RNA-SEQ读取映射

参考基因组和基因模型注释文件是从基因组网获得的（http://asia.ensembl.org/index.html)。利用Hisat2软件(v2.0.5)建立参考基因组索引，将配对的末端清洁reads与参考基因组进行比对。我们建立了一个潜在剪接连接的数据库，并通过比较之前未映射的读到的数据与假定连接的数据库来确认。对齐后的读取文件由袖扣软件处理，该软件使用归一化RNA-seq片段计数来测量转录组的相对丰度。测量单位是每千碱基的外显子每百万片段(FPKM)。读取被映射到鼠标NCBIM38 (ensemble release 68)和Sus scrofa 11.1 (Sus scrofa ensembl release 94)使用默认选项。

5.5。基因本体学（GO）和途径富集分析DEGS

采用DEseq R包对Mitf-M突变体和正常猪/小鼠进行差异表达分析[63.]。使用调整值0.05并将2的绝对折叠变化设置为显着差异表达的阈值。使用基因本体（GO）和KEGG分析David数据库中的高吞吐量基因组和转录组数据[64.-68.]，这是这些分析的重要在线工具。将DEGS列表上传到David [64.]分析工具，和 被认为具有统计学意义。DEGs已上载至MeV软件(https://sourceforge.net/projects/mev-tm4/)，以取得相关的热图。

5.6。从RNA-SEQ数据选择SV转录瘤的耳聋基因

在获取已知耳聋基因数据时，我们使用了以下来源的已知耳聋基因数据库:(1)遗传性听力损失网页[69.]及(2)遗传性听力损失及耳聋概况[27那45.]。

5.7。透射电镜(TEM)

为了制备用于TEM检查的样品，用0.1M PBS洗涤Stria Vascularis，然后在1％锇氧化锇中后固定，然后通过一系列乙醇脱水，然后嵌入塑料琼脂100树脂之前。聚合后，将Stria Vascularis切成超薄部分（3 μ.M）用甲苯胺蓝染色，安装在0.7％Formvar涂覆的铜网上，由0.5％乙酸铀酰基和柠檬酸铅对比，然后在透射电子显微镜下检查（Philips Tecnai10）[70]。

数据可用性

读者可选择访问附加的实验数据补充材料。

的利益冲突

作者声明没有相互竞争的经济利益。

作者的贡献

陈林军和王毅为这项工作做出了同样的贡献。

致谢

中国国家科学基金会的补助金（81770683，81770992至Wiiju Han和81670940到Shiming Yang）支持这项研究。既没有公布或已在其他地方接受其内容的任何部分。

补充材料

Deseq去分析。猪与鼠的关系。（补充材料）

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