分析公司相关的损伤机制₂激光Cochleostomy豚鼠耳蜗

文摘

不同类型的激光器已被用于内耳手术。因此,它是至关重要的,以避免损害内耳(例如,高热和声学效果)由使用这种激光引起的。本研究的目的是使用高功率的fibre-enabled有限公司₂激光(10 W, 606 J /厘米²)对豚鼠耳蜗执行cochleostomies和调查可能的激光损伤机制。圆窗膜的温度变化,听觉诱发脑干反应,头发细胞的形态学测量并记录激光应用之前和之后。所有的结果不同与对照组相比。温度上升和后续增加听力损失中观察到的动物手术10 W公司₂激光。这些发现与增加耳蜗损伤超微结构和较高的钙粘蛋白阳性表达β连环蛋白螺旋器损坏。我们假设增强信息粘附和激活β-catenin-related规范wnt信号通路可能发挥作用在耳蜗的保护以防止进一步的损失。

1。介绍

内耳手术的外科技术中使用的仪器,如stapedotomy和耳蜗植入,必须足够强大高效的同时,与此同时,防止损害内耳。与不同波长激光,将适当的强度,可以实现两个基本原则要求:烧蚀骨的精确位置和成就理想的设置没有深入渗透各个外淋巴,导致损伤感官内耳结构。第一个激光stapedotomy于1979年由帕金斯使用氩激光。从那时起,不同类型的激光,如铒:钇铝石榴石激光,磷酸钾titanyl KTP激光,和有限公司₂激光,已经使用在内耳手术1]。使用不同的激光被描述在实验和临床研究(2- - - - - -8]。

然而,每个激光都有优点和缺点。激光的应用任何媒介会导致吸收,反射,热,和声学效果。可见激光(氩和KTP)波长较短(0.5μ米),只能部分吸收的镫骨踏板或骨壁的耳蜗且容易通过外淋巴吸收内耳的组织,导致组织损伤(2]。看不见的长波长有限公司₂激光(10.6μ米)被水吸收良好。吸收的激光能量转化为热量(7]。在我们之前的研究中,积极伊诺和Hsp70的表达在螺旋神经节细胞、神经纤维、螺旋器的支持细胞,细胞的耳蜗螺旋韧带后严重的辐照损伤的超微结构(5]。因此,温度升高,分子的程度受到高强度的应用有限公司₂激光在豚鼠耳蜗模型需要进一步调查。

本研究旨在探讨激光的热效应是如何干扰分子内耳受损。豚鼠被选为动物模型,因为基底的耳蜗是容易和耳蜗墙的厚度(1毫米的圆形窗口前大约120 - 160μm)相当的尺寸略有增厚otosclerotic踏板(150 - 200年μ米)(3]。我们使用一种新型的手持fibre-enabled有限公司₂激光,10 W (606 J /厘米²)有限公司₂激光,探索可能损害内耳的机制。

2。材料和方法

2.1。动物

成年男性白化豚鼠(体重250 - 350克)被用于这项研究。21个动物都来自复旦大学医学院动物中心的和明确的条件下被安置。复旦大学的动物研究控制委员会批准实验协议和程序执行。

耳镜检查的检查进行豚鼠手术前确保所有外部听觉运河和鼓膜是正常的。所有的动物都有听力正常积极的猎物反射。在每个过程之前,豚鼠所使用氯胺酮(85毫克/公斤体重)和甲苯噻嗪(7.5毫克/公斤体重)。每个动物的左耳被选为实验的耳朵,它收到了10 W公司辐照₂激光。每只动物的右耳被列为对照组,辐照在颞肌接近耳蜗。

2.2。激光设备

穿孔的耳蜗骨进行新的AcuPulse 40 WG公司₂激光使用FiberLase灵活的公司₂激光波导(Lumenis,圣克拉拉、钙、美国)。这个激光有一个手持能源输送系统灵活的2米长波导和各种各样的刚性和韧性显微外科配件不同长度和灵活性。

2.3。手术

麻醉诱导后,我们创建了一个在左耳postauricular切口,暴露了大疱,骨折和大疱的骨壳,并谨慎地暴露在显微镜下基底的耳蜗(OPMI 9-FC,卡尔蔡司,耶拿,德国)。每个豚鼠的左耳接受耳蜗的穿孔前激光1毫米的圆形窗口。使用10 W SuperPulse激光模式的工作距离在非接触模式3毫米。两个选择曝光时间。每个激光枪持续0.1秒,每一个镜头之间的时间间隔是0.1(表1)。Cochleostomy承认了外淋巴的积液。一个开口直径约0.5毫米。对照组做过同样的步骤,但是被平等的激光辐照对颞肌的影响排除噪声引起的激光的应用。的豚鼠cochleae骨覆盖的帮助下拍摄数码相机与显微镜(OPMI 9-FC,卡尔蔡司,德国)。

2.4。温度测量

测量温度变化与K型热电偶(铬和铝)(Jingda TM6801,中国)。检测过程记录在我们的上一篇文章(6]。0.8毫米直径检测头被放置在圆形窗口的膜测量温度变化期间以每秒大约一脉冲激光辐照体内。由一个数字温度计温度手动记录。

2.5。听觉脑干反应的测量

录音的听觉脑干反应(ABR)之前和之后立即进行激光辐照。动物犀牛,然后放在一个sound-isolated electrically-shielded布斯(宁波、Tonecon声学系统,南京,中国)。声刺激是单声道的通过一个耳机(美国IL的生物逻辑的造物九律系统公司,Mundelein)连接到一个定制塑料镜插入耳道。皮下的电极插入顶点的头骨,在适当的(地)和左耳。的生物逻辑的造物九律NAVPR2听力诊断系统(Natus医疗公司,圣卡洛斯、钙、美国)被用来提供刺激(单击刺激;持续时间,0.1 ms)和记录响应。1024每个刺激反应平均水平。核确定通过减少强度在10 dB的增量,然后在5 dB步骤接近阈值,直到没有检测到有组织的反应。阈值估计刺激最低级别的一个反应是观察,确定的存在可识别和可重复的波iii。所有ABR测量被蒙蔽的专家评估治疗的条件。

2.6。扫描电子显微镜

每组三个豚鼠深麻醉下牺牲后术后ABR评估。鼓泡开了,骨覆盖耳蜗的移除。cochleae固定在2.5%的戊二醛溶液0.1 mol / L钠甲次砷酸盐缓冲。固定后,解剖cochleae脱水在10%,30%,70%,90%,100% (3 x)浓度的乙醇。临界点干燥机(EM CPD300徕卡,位于德国)与液态二氧化碳用于干燥标本的标本被sputter-coated platinum-palladium (e - 1045离子溅射,日立高新技术有限公司,东京,日本)。器官的表面螺旋器观察低真空下扫描电子显微镜(SEM) (Nova NanoSEM 230年,范公司晚宴过后,或者,美国)。

2.7。Immunofluorescent染色

术后ABR评价后,牺牲了三个额外的从每组豚鼠immunofluorescent染色深麻醉下。如前所述,鼓膜的垂饰和固定在4%多聚甲醛在磷酸盐溶液(PBS)一段24小时。在放大,耳蜗的骨墙被挑选和钳获得耳蜗的基膜。如前所述(执行以下染色过程9]。标本处理0.1% Triton x - 100 + 10%驴血清30分钟。他们在一夜之间被孵化主要抗体在4°C。主要的抗体使用如下:钙粘蛋白(1:200;BD生物科学,火花,医学博士,美国)β连环蛋白(1:200;圣克鲁斯生物技术有限公司、钙、美国)。准备在PBS冲洗3 - 5次,然后在黑暗中孵化与二次抗体2 h在37°C。使用的二次抗体包括驴anti-mouse /兔子Alexa萤石555和/或驴anti-mouse /兔子/山羊(H + L) Alexa萤石647 (1:1000;分子探针,表达载体的生活技术,卡尔斯巴德,CA,美国),phalloidin (1: 1000;英杰公司)。所有标本检查用徕卡共焦激光扫描显微镜(徕卡SP5徕卡微系统)由显微镜和图像捕获。

2.8。免疫印迹

15豚鼠被牺牲,分为实验和对照组。收集的基底膜,如上所述,和细胞溶解radioimmunoprecipitation分析缓冲区(Na-deoxycholate NP-40 Tris-HCl 50毫米,1%,0.25%,150毫米氯化钠,1毫米Na₃签证官₄和氟化钠)含有蛋白酶抑制剂(1μg / mL的抑肽酶、亮抑酶肽抑肽素,乙二胺四乙酸和苯甲磺酰氟)在微型离心机管和用近10年代。他们在12000年被离心机15分钟在4°C。上层清液被转移到一个新的microfuge管,与样品混合缓冲(12毫米Tris-HCl, 96毫米甘氨酸,10% SDS, 2-mercaptoethanol 1%,和0.1%的溴酚蓝,pH值6.8),和煮5分钟。总蛋白质是由bicinchoninic酸测定试验(Beyotime、Beyotime生物技术研究所、江苏、中国),和40的整除μg蛋白/巷为每个样品的电泳分离8%钠十二烷基硫酸使用叠加5%聚丙烯酰胺凝胶凝胶。解决蛋白质转移到硝酸纤维素和饱和了30分钟在室温下与阻断缓冲区(25毫米三(pH值8.0),125毫米氯化钠,渐变20 0.1%,和4%脱脂牛奶)和孵化anti-E-cadherin (1: 2500;BD生物科学),反β连环蛋白(1:500;圣克鲁斯生物技术),anti-GAPDH (glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶)(1:1000;Beyotime)抗体在室温下1 h,然后一夜之间在4°C,其次是孵化1 h在适当的二次抗体结合辣根过氧化物酶(IgG-HRP;1:1000;Beyotime Beyotime)。免疫反应性的乐队使用增强化学发光检测系统(Beyotime)。检测是由柯达影像站4000毫米Pro(美国伊士曼柯达公司,罗彻斯特,纽约)和量化使用ImageJ软件。

2.9。统计分析

所有统计对比和学生的表现以及。数据分析是使用SPSS软件包(版本。15.0;美国SPSS Inc .,芝加哥,IL)。一个值< 0.05被送往显示统计学意义。

3所示。结果

3.1。Cochleostomy豚鼠耳蜗

在这个实验中,执行cochleostomy基底扭转附近的窗口。豚鼠耳蜗之一的骨覆盖是如图1。射孔是明确的和膜与虚线划定。基底膜标本,suprabasal膜,中间膜,顶端膜标记为红色箭头是收集和处理。

3.2。热效果强烈的动物治疗10 W有限公司₂激光

温度变化时测量应用有限公司₂激光。如图2(一个),温度增加明显高于10 W的有限公司₂激光组比对照组(°C和°C,分别;)。

3.3。动物们的一大损失听力处理10 W时有限公司₂激光

ABR阈值记录之前和之后立即手术。平均手术后ABR阈值计算和图所示2 (b)。更高的ABR阈值等同于更大程度的听力损失。两组平均ABR阈值增加分贝(声压级;对照组)和分贝(10 W的激光组)。手术后,与对照组相比,10 W的动物有限公司₂激光组显示明显大幅增加其ABR阈值()。

3.4。外毛细胞崩溃动物10 W公司处理₂激光

手术后,每组的cochleae收集和处理电子显微镜下检查。图像的基底的动物10 W公司处理₂激光在图所示3。的静纤毛和表皮板内外毛细胞和支持细胞显示正常配置在对照组标本(图3(一个))。相比之下,大多数的外毛细胞静纤毛的倒塌和紊乱中观察到10 W有限公司₂激光组(图3 (b)),他们缺少的一部分,尤其是第三行外毛细胞(箭头)的基础。然而,内毛细胞显示正常的配置。超微结构在其他结果显示正常的控制(数据未显示)。

3.5。信息附着力增强,β-Catenin-Related规范wnt信号通路被激活后10 W有限公司₂激光治疗

基膜的基底打开immunofluorescent染色显示积极的钙粘蛋白和β连环蛋白,对应信息粘连10 W公司的应用₂激光。基底的图像将从10 W有限公司₂激光组如图4。在对照组(数字4(一),4 (c),4 (e),4 (g)),几乎没有表达的内外毛细胞β连环蛋白(红色,(e))或钙粘蛋白(蓝色,(g))。然而,在10 W的激光组(数字4 (b),4 (d),4 (f),4 (h)),我们观察到的强烈表达β连环蛋白(红色)和钙粘蛋白(蓝色)的外毛细胞表面受损。倒塌的外毛细胞显示微弱phalloidin(绿色,图4 (d))和大胆的β连环蛋白(红、图4 (f)(图)和钙粘蛋白(蓝色)4 (h))。免疫印迹分析蛋白质钙粘蛋白(图4(我)),β连环蛋白(图4 (j))10 W的激光和对照组是量化和提供在图4 (k)。钙粘蛋白和密度β连环蛋白蛋白质乐队与管家蛋白GAPDH正常化。钙粘蛋白的水平(),β连环蛋白()在公司被发现显著增加₂激光损伤(10 W的激光组)与对照组相比和分别;)。

4所示。讨论

的有限公司₂激光用于这个研究有一个手持能源输送系统的空心纤维可以将激光光束在不同角度和不同长度的距离和带有各种手持设备配件和灵活性。这些设备扩大公司的应用₂激光在ENT手术10- - - - - -12];fibre-enabled有限公司₂有实际的优势,特别是在案件复杂解剖条件(12]。豚鼠,颞骨的研究已经表明,激光设置4 - 10 W的足够的用于创建cochleostomy [7]。在这项研究中,我们使用一个10 W fibre-enabled有限公司₂激光建立内耳损伤听力损失和损坏的超微结构。

在我们的研究中,10 W有限公司₂激光(606 J /厘米²)用于cochleostomy产生的温度上升°C膜的圆形窗口。Kamalski等人也观察到这种热影响评估在暴露于激光照射温度升高时(8]。随着温度的增加,ABR阈值也增加了在我们10 W公司分贝₂激光组。这些发现证明了一个强大的关系cochleae中观察到的形态变化。超微结构的基底的耳蜗laser-treated动物显示不同的变化,而没有明显的超微结构改变在耳蜗的其余部分被发现。外毛细胞的变化比内耳毛细胞的更明显,尤其是在第三行见我们的扫描电镜检查。大多数的外毛细胞坍塌,和紊乱,甚至失去静纤毛被观察到,而作为耳蜗外毛细胞放大器。Prestin外毛细胞的膜是在哺乳动物耳蜗放大的基础(13]。Okunade Santos-Sacchi发现prestin非常快速响应温度跳跃(14]。我们假设的改变prestin可能部分解释了不可逆的听力损失。

钙粘蛋白/β连环蛋白复合体中扮演一个重要的角色在维护上皮完整性,并扰乱这个复杂不仅影响细胞的粘附曲目也wnt信号通路(15]。然而,是否和如何wnt信号通路发挥作用的热损伤内耳后激光应用有待解答。在我们的实验中,我们观察到的毛细胞显示积极的钙粘蛋白和受伤β过度的激光辐照后连环蛋白表达。此外,有强烈colocalised钙粘蛋白的表达和β连环蛋白的膜周围的受伤的毛细胞和支持细胞。Karpowicz等人表明,钙粘蛋白的过度表达有助于神经干细胞的自我更新和增加他们的体外数量16]。此外,陈等人的研究表明,钙粘蛋白的超表达病毒转导足以提高诱导多能干细胞的一代(17]。也就是说,upregulation钙粘蛋白的膜可能意味着更强的信息粘连在受伤的头发细胞的表面保护毛细胞进一步损害或提高self-rehabilitation激光辐照后受伤的细胞。

在我们的实验中,有表达增加β连环蛋白10 W的激光,特别是在膜。因此,我们认为,β连环蛋白是重新分配代表信息的增加附着力毛细胞损伤后,这可以保护你的头发细胞进一步损害从细胞质和核细胞膜和钙粘蛋白激活Wnt通路协同。它可能是有用的探索假设Wnt通路可能导致再生在某些条件下,如后损伤。如何β-catenin-related规范Wnt信号影响的修复或再生毛细胞受损后热损伤尚未被证实。因此,今后还需要进一步的研究。

结果表明,当有限公司₂激光超过安全操作水平,这将导致毛细胞崩溃和疯狂的静纤毛,尤其是外毛细胞,更令人吃惊的是,upregulation钙粘蛋白和原因β连环蛋白在细胞膜受伤的头发,这表明这些可能发挥作用在整个损伤机制。刺激Wnt /β连环蛋白可能是一种途径探索成人耳蜗毛细胞的替代,一个受欢迎的目标治疗神经性耳聋,这是常见的脱发所造成的人类细胞。

相互竞争的利益

作者报告没有与这项工作有关的相互竞争的利益。

作者的贡献

所有作者参与设计、解释数据的研究和分析,手稿和审查;湘Liu Xiao-qing钱,冬冬任进行了实验,鲁伊·马和冬冬任拍摄和处理数据,刘香和冬冬任写手稿,Fang-Lu气修订后的手稿。湘刘和Xiao-qing钱贡献同样这项工作。

确认

本研究受中国国家重点工程的项目(2016 yfc0905200),中国国家自然科学基金(国家自然科学基金委)授予Fang-Lu Chi 81420108010和81420108010号,81370022,81570920,和81000413冬冬任,973计划(资助2011 cb504500和2011号cb504506)和上海市科委创新项目(批准号11411952300)Fang-Lu Chi,优秀年轻人才的培训项目上海市卫生系统(批准号XYQ2013084)和“Zhuo-Xue计划”冬冬任复旦大学。

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