文摘
生成脑衍生神经营养因子(BDNF)是一个重要的生长因子在中枢神经系统。赤字在运输的分泌蛋白可能是神经退行性疾病的基础。调查疾病的变化BDNF运输可能会提供洞察细胞机制,例如,阿尔茨海默病(AD)。分析BDNF交通广告的作用,活细胞成像的荧光标记BDNF在海马神经元不同的广告模式执行系统。BDNF和应用与较低的发病率在多孔结构。顺行和逆行运输BDNF囊泡减少,这些影响是由因素从海马神经元释放到细胞外介质。运输BDNF的改变在很早的时间点后人类应用表达式或急性发作后淀粉样β蛋白(1-42)治疗,而脑源性神经营养因子的依赖性活动释放仍不受影响。综上所述,细胞外的乳沟的产品应用诱导顺行和逆行运输快速变化BDNF-containing囊泡的释放脑源性神经营养因子是影响转基因表达突变的应用。这些早期交通赤字可能导致永久受损的大脑功能在成年人的大脑。
1。介绍
支持生成BDNF是一个重要的生长因子的功能开发和成人中枢神经系统。根据细胞类型和表达式模式BDNF坐标多种生物功能,像神经突生长、突触发生和神经保护1- - - - - -5]。脑源性神经营养因子的缺乏远程影响细胞以及在系统层面上,因此可以构成不同的神经退行性疾病(6- - - - - -8]。赤字BDNF运输,因此脑源性神经营养因子的缺乏支持各自的目标区域可能启动大脑中的神经退行性过程8- - - - - -12]。尽管许多先前的研究解决神经营养因子的神经信号,调节神经营养支持BDNF-containing囊泡的不同的运输过程还不是很清楚。
到目前为止,BDNF的交通调查免疫组织化学染色,未及,活细胞成像的荧光标记BDNF,或量子点标记BDNF (13- - - - - -15]。注入放射性标记重组脑源性神经营养因子在不同的大脑区域发现了一个广泛的顺行和逆行运输BDNF在中枢神经系统(13,16- - - - - -18]。活细胞成像神经元的文化表达荧光标记BDNF透露BDNF-containing囊泡的速度0.1 - -1.4µ米/秒(14,19- - - - - -21]。在两个方向,BDNF-containing囊泡运输依赖于dynactin-motor复杂(14,19,20.]。在阿尔茨海默病转基因小鼠模型,内源性BDNF的逆行运输受损被Poon和同事。他们观察内源性BDNF的赤字在逆行运输/ TrkB-signalling核内体的差别与淀粉样β蛋白诱导有关对这些泛素c端水解酶(22,23]。类似的影响淀粉样前体蛋白(APP)或劈理的产品应用在活动依赖性的分泌BDNF尚未被描述。
在这项研究中,我们将演示一个快速行动(5分钟内)淀粉样β蛋白(1-42)BDNF-containing囊泡运输的。BDNF和应用与发病率较低程度的多孔结构和colocalization增加应用细胞中表达水平较高。然而,赤字在顺行和逆行BDNF运输和应用没有联系表达在单细胞水平但相当释放可溶性因子,诱导的海马神经元细胞外介质。此外,短期应用淀粉样β蛋白(1-42)但不是淀粉样β蛋白(3 (pE) -42)诱导减少逆行定向囊泡的平均速度。囊泡是顺行直接影响转基因表达的应用以及淀粉样β蛋白治疗后培养的时间点。然而,依赖性活动释放脑源性神经营养因子是不受任何这些操作影响脑源性神经营养因子的运输小泡。
2。材料和方法
2.1。细胞培养
所有实验进行按照道德准则的使用动物实验和被批准的当地动物保护委员会(Landesverwaltungsamt Sachsen-Anhalt)。
C57BL / 6小鼠海马神经元被孤立在产后第二天和准备如前所述4,24)与小修改:主要产后(P2)分离、培养皮层星形胶质细胞在BME介质2 - 3周,含10% FCS直到被扩大到融合。星形胶质细胞是通过玻璃盖玻片和播种密度的80 000个细胞/ 3.5厘米菜在BME / 10% FCS屈服星形胶质细胞的岛屿100 - 300µ7 - 14天后米直径在体外(DIV)。β-D-Arabinofuranosylcytosine (3µ米)添加了4 d播种后星形胶质细胞星形胶质细胞避免进一步增长的岛屿。分离产后(P2)海马神经元被镀在BME / 10% FCS 1神经元的密度每星形胶质细胞岛到盖玻片。20 h后,镀介质交换的无血清培养基(Neurobasal 2% B27补充;表达载体,圣地亚哥,CA)。
海马神经元从5 xfad老鼠孤立在产后第二天和镀的密度每厘米70 000个细胞2在polyornithine-coated盖玻片。20 h后,镀介质交换的无血清培养基(Neurobasal 2% B27补充;表达载体,圣地亚哥,CA)。
2.2。转染
海马文化与表达载体转染BDNF-mCherry编码,哈标记proBDNF-GFP, APP-YFP, APPmCherry,或GFP,分别25,26使用Ca)2 +磷酸盐沉淀前面描述的方法(25)与小修改:C57BL / 6小鼠海马文化被转染9 DIV和海马文化转基因5 xfad老鼠与各自的表达质粒转染DIV 10。转染后细胞用于实验1 - 3天。
2.3。Live-Cell成像和图像分析
盖玻片是转入Petriperm菜(他一一Bio-One Frickenhausen,德国)包含消息灵通的缓冲盐(20 mM玫瑰,4毫米氯化钾,100毫米氯化钠,1毫米Na2HPO44毫米CaCl210毫米葡萄糖10µMgCl M对羟苯甘氨酸,1毫米2;pH值7.4)和成像倒置荧光显微镜数字化(IX70、奥林巴斯、汉堡德国)使用高孔径油浸目标(40 x,厦门市。:1.0)和CCD相机(Sensys 1401 e,光度)如前所述[27)与小修改:细胞保持在一个恒定的温度为30°C使用板温暖(Minitub, Tiefenback,德国)。延时图像获得2赫兹的频率300 ms的曝光时间。1分钟的延时与MetaMorph录音分析软件(美国分子设备、Downington PA)。BDNF-containing泡动力学分析了个体通过手动跟踪使用神经突MetaMorph的“跟踪点”功能。囊泡是跟踪1分钟或直到他们消失的观点。BDNF-containing囊泡时视为固定运动观测期间的百分比低于15%或运动的最小距离观察时间低于8µm。泡显示扩散行为的比率估计位移和距离(> 4)被排除在外。否则,小泡被定义为移动。
Colocalization蛋白质的检测用共焦激光扫描显微镜(德国蔡司LSM 780年,耶拿)使用20 x水浸客观(W Plan-ACHROMAT,数值孔径:1.0)。图像获取和分析禅宗2010软件。加权禅宗colocalization系数计算的软件。
2.4。免疫组织化学
细胞被固定为4%多聚甲醛在PBS (pH值7.4)20分钟和permeabilized PBS Triton x - 100 0.3%。不具体的绑定被孵化抑制与屏蔽解决方案(1 x PBS, 10% BSA和0.1% Triton x - 100) 15分钟。孵化与中小学抗体在PBS为2 h做含1% BSA和0,特里同x - 100年的1%。细胞被固定在载玻片Immumount(美国马热科学、沃尔瑟姆),储存在4°C到分析。所有步骤都是在室温下进行。主要的抗体使用anti-APP(北部的兔子,1:1000年,密理博公司,美国)和anti-HA (Covance鼠标,1:1000年,新泽西,美国)。二次抗体是Cy3耦合anti-rabbit免疫球蛋白(Dianova 1: 1000年,德国汉堡)和Alexa萤石350耦合anti-mouse免疫球蛋白(Moleculare探针1:1000年,生活技术,卡尔斯巴德,加利福尼亚,美国)。由MetaMorph Colocalization分析软件(分子设备、唐宁敦PA)。
2.5。制备淀粉样β蛋白寡聚物
淀粉样β蛋白寡聚物生成中描述(28]。短暂,冻干肽(β-淀粉样蛋白(1-42),MoBiTec)溶解在1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP;σ,圣路易斯,密苏里州)的浓度为1毫米。解决方案是整除,HFIP蒸发,肽的电影是储存在−80°C。使用前24小时,淀粉样β蛋白肽在无菌条件下溶解在二甲亚砜(DMSO溶液;σ;100年μ米)和用。淀粉样β蛋白寡聚物被稀释股票获得解决方案5μ米在4°C NB / B27和孵化24 h。在以前的实验中,低聚物制备的质量是由负染色电镜和sodiumdodecylsulfate-polyacrylamidgelelectrophoresis (sds - page) [29日]。淀粉样蛋白-早期神经功能障碍β寡聚物取决于NR2B-containing NMDA受体的激活。我们已经调查了这个低聚物准备不利影响神经功能和神经结构集成。使用初级神经细胞培养和海马切片从老鼠和老鼠,我们发现政府的submicromolar浓度β寡聚物容易损害长期势差,减少基线突触传递,减少神经元的自发的网络活动,引起收缩的突触联系29日]。
短期治疗海马神经元与500纳米淀粉样β蛋白肽(溶解在HBS)在记录室进行了30分钟。长期培养的海马神经元与500纳米淀粉样β蛋白肽在NB /执行B27培养基细胞培养24小时的孵化器。
2.6。释放测量
主要海马体神经元与BDNF-GFP表达质粒转染10 DIV和成像本质上如前所述24转染):三天后,封面与海马神经元被陷入洗澡室(Luigs & Neumann)和一个正直的荧光显微镜检查(奥林巴斯BX51W)使用60 x水浸客观(NA LUMFI,奥林巴斯,汉堡,德国:1.1)。使用冷却CCD相机图像捕获了(CoolSnap总部2,光度,亨廷顿海滩,CA, 14位动态范围),由VisiView控制软件(Visitron系统、Puchheim德国)。延时录音曝光时间(0.3到1.5秒)调整等每个细胞囊泡是清晰可辨的背景没有驱动CCD芯片到饱和。BDNF-GFP释放刺激通过应用50 mM氯化钾与局部灌注系统包含消息灵通的缓冲区。估计发病率的囊泡融合、0.3毫米溴酚蓝(BPB;比较(30.)包含消息灵通的缓冲释放后过冷实验。分析的图像是由MetaMorph软件(分子设备、唐宁敦PA)。总之,单囊泡被选来衡量单个细胞的平均荧光动力学。背景荧光强度减去了囊泡和平均强度归一化融合事件之前的时间点。monoexponential推断过程中观察到的照片漂白基线记录应用正确的归一化荧光数据(30.]。释放振幅最大荧光强度分析的每一个分泌颗粒融合事件后(时间点= 0)被设置为100%,相对荧光降低融合后的300年代进行了分析。融合事件的百分比计算分数的囊泡释放实验后消失在摄影领域的应用。这个分数的囊泡也可以检测到融合事件后荧光强度的变化。
2.7。统计数据
使用SPSS统计分析软件版本21(美国、IBM公司,纽约Armonk)使用单向或双向方差分析事后图基或成对多重比较显示的文字和图标题。是水平的意义。
3所示。结果
3.1。动态特性BDNF-Containing囊泡在阿尔茨海默病转基因小鼠模型
分析BDNF运输在阿尔茨海默病的作用,活细胞成像的荧光标记的蛋白质进行分离海马神经元的阿尔茨海默病小鼠模型(5 xfad) (31日- - - - - -33]。这种转基因小鼠行是过度表现(1-42)[32,34]coexpressing淀粉样前体蛋白(APP)和三个家族性阿尔茨海默氏症(时尚)突变和presenilin 1 (PS1)与两个时尚另外增加的突变(1-42)生产。两种转基因蛋白质Thy1启动子的控制下使早期产后特异性神经元转基因表达(35,36]。分离海马文化源于这些5 xfad动物及其野生型的同胞也显示出了类似的细胞密度和细胞生存后12天在体外(DIV)(补充图1在网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2016/4145708)。这些文化是转染BDNF-mCherry DIV(图10点1(一))和传输动力学单BDNF-containing囊泡在薄过程由延时视频显微镜轴突的形态进行了分析。在观察期间BDNF-containing囊泡显示走走停停的运动或固定(图1 (b))。量化分析BDNF-containing囊泡的能动性,在观察动作的百分比,我们观察到显著减少水泡能动性与野生型相比,5 xfad派生的海马神经元的同胞。的意思是运动性BDNF-containing囊泡为59.7±1.3%在控制条件下,BDNF-containing囊泡的平均活性明显降低到49.1±1.3% 5 xfad转基因海马神经元(;图1 (c))。类似的结果是通过分析移动和固定囊泡的分数。而76.0±2.0%的BDNF-containing囊泡显示野生型的定向运动神经元,只有65.8±2.4%的BDNF-containing囊泡是主动运输在5 xfad转基因神经元。因此,一个更大比例的囊泡是固定在这些转基因神经元没有主动运输(WT: 24.0±2.0%;5 xfad: 34.2±2.4%;图1 (d))。总之,这些结果表明过渡BDNF-containing囊泡从移动到一个固定的状态在5 xfad老鼠派生的神经元。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
我们接下来问,除了固定数量的增加小泡,还动态属性的动态囊泡的影响转基因表达。自囊泡运动的特点是走走停停的行为,而不是通过移动速度常数,不同BDNF-containing泡的动态特性进行了分析。为此,我们决定停止频率定义的数量单位时间(补充图2)停止。此外,我们分析了保压时间,所表达的时间囊泡在一站在相同的位置。停止频率和停留时间的停止阶段泡的特点。在囊泡流动相(去),以一定的速度移动,所述囊泡的平均速度在运动中,省略了囊泡。覆盖距离之间的囊泡所描述的两个停止运行长度(cf。37])。BDNF-containing囊泡的总体平均速度与平均速度在运动过程中被定义为距离覆盖观测时间的比率(cf。38))(补充图2)。最后,动作发生在观察时间的百分比确定的读出一个囊泡的能动性。虽然能动性以及停留时间是类似的顺行指示BDNF-containing囊泡在两种条件下(能动性:5 xfad: 75.50±1.57%;Ctrl: 78.91±1.33%;停留时间:5 xfad: 1.10±0.07年代;Ctrl: 1.04±0.05,顺行性的停止频率直接泡在转基因神经元与野生型相比显著增加神经元(图1 (e))。除了停止前进的频率直接泡,运行长度和平均速度在运动神经元显著减少转基因导致减少BDNF-containing囊泡(图的总体平均速度1 (e))。所有动态属性的逆行BDNF-containing囊泡在转基因神经元显著改变,相对于野生型神经元(图1 (f))。,BDNF-containing囊泡的总体平均速度降低转基因神经元由于较低的速度在运动和更多的主动运输过程中停止BDNF-containing囊泡。
3.2。赤字BDNF运输也观察到在发生急性过度没说完,但独立于细胞内的应用水平
Thy1启动子在5 xfad老鼠发起转基因表达在神经元细胞在产后6天35,36]。如何快速的表达人类应用(没说完)可以负面影响BDNF-containing囊泡运输的,我们从C57BL / 6 cotransfected海马神经元动物BDNF-mCherry和GFP或APP-YFP,分别模拟早期增加没说完的表达式。固定囊泡的数量是增加海马神经元转染和BDNF-mCherry hAPP-YFP相比,神经元和BDNF-mCherry转染GFP作为控制(图2 (b))。此外,移动的运输动态BDNF-containing囊泡相比,海马体神经元表达一切发生明显变化来控制神经元(数字2 (b)- - - - - -2 (d)、补充图3)。一切发生在海马神经元的表达了类似的运输赤字顺行和逆行中观察到5 xfad mice-derived神经元。BDNF的运输赤字发生三天后开始没说完表达式。从应用程序中不同细胞的表达水平调查,我们要求运输赤字的大小是否与细胞的内容应用。因此,APP-YFP的荧光强度,研究细胞的胞体(估计个体细胞内APP-level)策划的动态属性各自的单个细胞。但是,没有应用和运输赤字水平之间的相关性是显而易见的(补充图4),因此,虽然运输赤字增加的程度与应用的持续时间表达在海马文化中,没有证据表明大量的细胞应用负面影响移动BDNF-containing的运输小泡位于相同的单元中。然而,整个细胞内应用表达水平没有发现应用程序或APP-derived分子参与细胞功能在亚细胞水平的不同方面。例如,先前的研究显示应用程序的函数作为货物运输的适配器蛋白质([39,40),但看到41])。因此,单一应用分子可能直接与BDNF-containing囊泡在亚细胞水平上。因此,检查应用程序的函数作为适配器蛋白质BDNF囊泡运输,我们调查是否同时colocalize蛋白质亚细胞水平。海马神经元细胞转染与proBDNF-GFP与抗体针对应用氨基的成熟领域应用的一部分。BDNF与较低的频率与内生的氨基端部分应用vesicular-like结构(图3(一个))。此外,也主要的BDNF prodomain colocalizes BDNF的成熟领域揭示显然可检测但相对低水平的colocalization ProBDNF和应用(补充图5)。这些结果表明适度的BDNF的本地化应用程序在相同的结构在海马神经元。然而,应用程序可能会作为一个适配器蛋白质BDNF-containing囊泡的子库。然而,没有任何相关性的强度应用在单个细胞表达和动态属性表示,不是过表达一切发生在一个给定的水平细胞负责损害传输特性,表明,应用乳沟产品培养基更容易引发了受损的传输特性。
(一)
(b)
(c)
(d)
(一)
(b)
3.3。一个β肽诱导交通赤字在短时间范围内
测试是否BDNF运输的干扰是由因素释放到细胞外介质,海马神经元cotransfected BDNF-mCherry和GFP转染后被培养的海马神经元一起cotransfected BDNF-mCherry和hAPP-YFP(补充图6),神经元cotransfected BDNF-mCherry和GFP转移与神经元也cotransfected BDNF-mCherry培养皿和GFP作为控制。运输单BDNF-containing泡动力学分析延时视频显微镜。有趣的是,固定囊泡的分数是相似的在这两个条件(Ctrl没说完媒体:31.2±2.4%;Ctrl Ctrl媒体:27.8±3.0%;、双向方差分析)。然而,移动BDNF-containing囊泡运输赤字观察控制神经元没说完介质(没说完Ctrl)与传输赤字后没说完表达式在海马神经元(cf。图2)。平均速度在运动和整体平均速度为顺行指示BDNF-containing囊泡在海马体神经元显著减少转移到培养基的海马神经元细胞转染没说完(补充图6)。因此,在海马神经元的细胞外因子转染没说完和释放到细胞外介质可能对观察到的赤字负责运输BDNF(补充图6)。
蛋白水解产物分泌到细胞外空间的应用发挥重要作用在阿尔茨海默病的发病机制。最好的和最有毒的β-淀粉样蛋白肽是淀粉样β蛋白研究(1-42)淀粉样斑块的重要组成部分。另一个物种,淀粉样蛋白的氨基端截断和修改的β-淀粉样蛋白(3 pe-42),也称调节在老年痴呆症患者的大脑。肽都是闻名的高毒性以及快速积累5 xfad老鼠的大脑(32,42),是重要的球员在阿尔茨海默病的发病机制。分析这些蛋白水解产物之一是否负责观察赤字BDNF运输、海马神经元转染与BDNF-mCherry对待不同的β-淀粉样蛋白寡聚物。淀粉样β蛋白治疗敏锐地(5 - 30分钟)或执行一段时间24小时。急性治疗淀粉样β蛋白(1-42)而不是氨基端截断淀粉样β蛋白淀粉样β蛋白(3-42)或截断和修改(3 (pE) -42)显著下降的平均速度逆行导演BDNF-containing囊泡(图4(一))。所有其他动态特性没有显著改变后的短时间内淀粉样β蛋白治疗(补充图6)。然而,这些动态特性显著改变与β-淀粉样蛋白(1-42)孵化后24 h(图4 (b))。同样,BDNF交通动力学也受到长期影响孵化与淀粉样β蛋白(3-42)或淀粉样β蛋白(3 pe-42)。然而,尽管所有的动态属性的移动BDNF-containing囊泡是由淀粉样β蛋白显著改变(1-42),固定囊泡的数量没有变化(图4 (b)),表明细胞内应用的可能角色分离的囊泡从微管。综上所述,这些数据显示明显的放缓对大多数BDNF-vesicle运动方面不同的可溶性淀粉样β蛋白肽与最早开始测试淀粉样β蛋白(1-42)诱导对BDNF-containing囊泡的平均速度的影响。
(一)
(b)
3.4。释放脑源性神经营养因子不影响神经元从5 xfad老鼠
BDNF囊泡运输效率的降低可能最终减少BDNF-containing囊泡胞外分泌的准备。因此,我们分析了活动依赖性释放BDNF是否影响转基因表达突变没说完。海马神经元从5 xfad老鼠转染BDNF-GFP和去极化的由当地溢出与50 mM钾在细胞外的解决方案(24]。BDNF的depolarization-induced版本进行了分析通过监测GFP荧光强度BDNF-GFP-containing囊泡使用延时视频显微镜(所有实验条件如图1)。荧光强度的变化发生后10 - 50年代成为明显的去极化(图5 (b))。荧光强度的增加由于intravesicular中和pH值包含囊泡融合后毛孔开放BDNF-GFP随后荧光强度下降表明depolarization-induced释放脑源性神经营养因子(数字5 (b)- - - - - -5 (c))。荧光强度的增加以及荧光强度下降后融合事件两组相似。此外,密度BDNF-GFP包含囊泡(数据未显示)以及数量的膜泡融合事件类似的两种条件下(数字5 (d)- - - - - -5 (e))。因此,无论是融合事件的百分比还是从单囊泡释放BDNF在海马神经元改变源自5 xfad老鼠。因此,尽管BDNF的运输小泡是影响早期转基因表达没说完后,BDNF活动依赖性释放没有影响。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
这些结果表明,应用脑源性神经营养因子的镇定在运输过程中发挥作用,而不是BDNF-containing胞外分泌的囊泡。
4所示。讨论
在目前的研究中,我们表明,不同操作增加应用蛋白表达或APP-derived分子水平细胞外介质扰动生成BDNF的逆行,顺行运输。因此,转基因超表达突变的一切发生在5 xfad老鼠,plasmid-driven超表达的一切发生在海马文化中,或胞外β-淀粉样蛋白肽的应用顺行和逆行运输BDNF减少囊泡。溶性的影响肽可以显示发生在快时间尺度(30分钟)。虽然,低概率的蛋白质应用和BDNF colocalize泡状结构,BDNF的赤字运输和应用水平单一单元没有联系,但由因素从海马神经元释放到细胞外介质。逆行运输受到影响之前顺行方向,表明不同的机制负责特定方向的赤字。尽管减少了运输效率,BDNF活动依赖性释放没有受到转基因表达的影响。
神经营养因子脑源性神经营养因子是一个非常重要的生长因子突触和神经细胞的生存发展的(2,3,5,43- - - - - -45]。脑源性神经营养因子的缺乏目标区域可以导致神经元损失(6- - - - - -8]。除了BDNF水平的降低,BDNF的赤字在运输也会导致缺乏神经营养支持在各自的目标领域(6,8,9,11]。BDNF存储在分泌囊泡的排序本构或分泌的活动依赖性途径24,46,47]。蛋白水解乳沟proBDNF前体的事件可以发生在细胞内的隔间或细胞外空间,后分泌(25,47- - - - - -49]。我们的结果确认prodomain BDNF在海马神经元和成熟的BDNF colocalize很好(补充图5)。然而,colocalization两域不能排除发生在这些分泌囊泡的蛋白水解处理。蛋白质的应用也已被证明能够接受proteolytical由不同的分泌酶处理,分为分泌颗粒(50- - - - - -55]。现在我们的研究结果首次揭示脑源性神经营养因子和应用可以colocalize,尽管丰度较低,在海马神经元的多孔结构(图3)。这个观察与先前的报道是一致的指示kinesin-1-dependent运输的货物在神经元26,56- - - - - -62年]虽然kinesin-1主要是描述运输应用而BDNF运输也是取决于kinesin-3 [19,63年,64年]。
此外,我们实验显示更高的固定囊泡发生率5 xfad鼠标派生的神经元。没有类似的野生型中囊泡运动的变化C57BL / 6神经元在培养基培养条件的转染野生型神经元hAPP-YFP或在海马神经元处理淀粉样β蛋白(cf补充图6和图4;参见[65年])。因此,固定囊泡的变化分数可能依赖升高细胞内而不是在胞外β-淀粉样蛋白肽应用水平。应用程序被描述作为一个适配器蛋白质相互作用kinesin-1从而连接轴突运输囊泡((39,40),但看到41])。因此,应用程序可以负责运输的小池BDNF-containing囊泡到亚细胞的定义目标隔间。直接或间接的交互应用kinesin-1可以负责这样一个超然的囊泡(66年- - - - - -68年]。然而,低程度的应用和BDNF colocalization主张很大程度上独立运输的蛋白质。同样,顺行速度直接泡包含应用程序被报道达到9µ米/秒(平均速度:4、7µm / s) [26,69年,70年),而我们观察到BDNF-containing囊泡的平均速度为1µ米/秒(max 4µm / s),与先前的发现是一致的(20.- - - - - -22,71年,72年]。这种比较的泡速度说话的支持很大程度上独立的运输蛋白在神经元。
第一个变化动态BDNF-containing囊泡运输我们观察到的是逆行的减少平均速度在运动指导BDNF-containing囊泡(图4)。其他赤字BDNF-containing囊泡运输只发生后,表明不同的机制负责这些的赤字BDNF运输。快速变化的逆行BDNF-containing运输小泡被描述由抑制疱疹ATP生产(73年]。然而,在方差与我们的发现在目前的研究中,脑源性神经营养因子的镇定顺行和逆行运输受到影响类似的时间尺度以及类似的程度上抑制了糖酵解的关键一步73年β-淀粉样蛋白),表明短期应用(1-42)不扰乱糖酵解。此外,短期治疗淀粉样β蛋白(1-42)被描述快速诱导突触功能的变化(74年,75年]。虽然电活动可以修改水泡贩卖,这些变化并不局限于逆行运输(76年- - - - - -79年),再次表明这些细胞事件不是上游早期的赤字在逆行运输,我们观察。急性治疗淀粉样β蛋白调节GSK3-signalling。GSK3-signalling可以修改特别顺行而不是逆运输(80年,81年]暗示另一个未知的机制下淀粉样β蛋白诱导快速逆行运输的变化在我们的研究中,在逆行运输的影响。
长期治疗(24小时)与淀粉样β蛋白(1-42)以及长期治疗淀粉样β蛋白(3 (pE) -42)最近讨论的是一个潜在的球员在引发阿尔茨海默病(82年)影响顺行和逆行运输BDNF(图4)。类似的变化观察海马文化(图5 xfad转基因动物1)。5 xfad老鼠产生非常高的淀粉样β蛋白(1-42)以及淀粉样β蛋白(pE)(-42),迅速积累intraneuronally 1.5个月时开始,而认知障碍是显而易见的(4 - 5个月32,42]。因此,观察脑源性神经营养因子的镇定赤字在运输发生后不久开始的转基因表达在我们的实验中可能发生的早期发展5 xfad老鼠和可能永久损害大脑功能。长期治疗淀粉样β蛋白肽被描述诱导一些变化(最近评论看,例如,74年,83年,84年),包括β-淀粉样蛋白(1-42)对突触的影响货物运输(23,65年,71年,72年,85年]。突触货物运输受到淀粉样β蛋白寡聚物NMDAR——GSK-3-dependent的方式(65年,71年,72年]。而唐及其同事(65年)描述了淀粉样β蛋白诱导NMDAR GSK-3-dependent机制影响突触速度货物囊泡,西尔弗曼的团队发现了淀粉样β蛋白诱导NMDAR GSK-3-dependent机制完全破坏泡贩卖(71年,72年]。类似的BDNF运输中断淀粉样β蛋白治疗后不能确认调查期间在我们的研究中(图分析4 (b))。我们使用的3种不同的化验分析BDNF运输,我们没有观察到这样一个移动囊泡的分数大幅减少。在我们的测试中,移动或移动后囊泡明显慢急性淀粉样β蛋白(1-42)治疗或24 h后治疗淀粉样β蛋白(1-42),分别,但他们仍然感动。我们没有观察到BDNF运输中断,从而增加固定泡池淀粉样β蛋白治疗后。小但显著增加固定泡池,我们观察到的只是明显当海马神经元中应用显示的函数应用而不是淀粉样β蛋白分离移动从微囊泡。培养条件也分析的方式(手动和自动跟踪,例如,86年)可以解释这些不同的结果。另一个淀粉样β蛋白诱导机制负责运输延迟赤字内源性BDNF / TrkB信号核内体被Poon和他的同事们(22]。长期治疗淀粉样β蛋白寡聚物减少胞体积累细胞外地应用BDNF-GFP [23]表明内源性BDNF的逆行运输/ TrkB-complex受损。这些信号的淀粉样β蛋白诱导赤字逆行运输核内体是由一个泛素介导的c端水解酶依赖机制(22]。一个额外的泛素化途径对顺行运输的影响似乎可能(87年]这也泛素化途径可能是上游的赤字在运输我们观察的赤字。此外,淀粉样β蛋白治疗被描述诱导生成的活性氧(88年,89年),表达下调组蛋白脱乙酰作用通过抑制组蛋白脱乙酰酶(90年]。描述了脱乙酰作用的微管稳定微管网络从而导致停止事件数量的增加或延长停留时间60),这是符合我们的观察数据1和4)。
依赖性活动释放BDNF取决于ATP生产、钙流入和效率glutamatergic突触传递(了91年])。此外,可想而知,BDNF释放也限制了BDNF的可用性囊泡准备胞外分泌释放地点。有趣的是,尽管BDNF的运输是由淀粉样β蛋白的应用以及影响转基因表达在不同的水平,在海马神经元脑源性神经营养因子的释放是类似5 xfad老鼠与其控制的同胞相比。因此,尽管蛋白应用的蛋白水解乳沟产品应用已经被证明能够影响神经功能在不同的水平,去极化诱导释放BDNF持平在调查期间由我们的实验。最近,细胞内β-淀粉样蛋白寡聚物的作用在突触囊泡释放了92年,93年]。杨和他的同事们发现,淀粉样β蛋白单体和低聚物累积intraneuronally直接绑定到1胞内突触融合蛋白。此外,胞质相互作用的淀粉样β蛋白寡聚物显著抑制SNARE-mediated胞外分泌。相比之下,我们没有观察到任何影响BDNF在海马神经元在这些条件下发布。一个可能的解释这一与之对立的结果可能是不同的蛋白亚型的重要性释放神经递质和神经肽囊泡的过程。一般来说,释放神经递质和神经肽的释放机制相似。然而,突触融合蛋白1是重要的突触前神经元胞外分泌的神经递质。此外,众所周知,突触融合蛋白1 b,而突触融合蛋白1中扮演一个重要的角色在胶质细胞释放脑源性神经营养因子。相同的蛋白质机械是否重要的脑源性神经营养因子在神经细胞是未知的,直到现在。除了不同的蛋白亚型,intraneuronal积累淀粉样β蛋白寡聚物直接交互的先决条件的β-淀粉样蛋白和胞内域的突触融合蛋白可能是一种机制,遵循赤字在运输过程。 Intraneuronal accumulation of amyloid-beta(1-42) has been reported in the 5xFAD mouse model starting at 1.5 months of age. However, the transgene expression is under the regulation of the Thy1 promoter in 5xFAD mice starting with expression of mutated APP and presenilin within the first days after birth. This speaks for a delayed intraneuronal accumulation of amyloid-beta oligomers. In our hippocampal cultures derived from newborn 5xFAD mice we cannot exclude intraneuronal accumulation of amyloid-beta at this early time point. Nevertheless, we observed an effect of exogenous amyloid-beta(1-42) on transport kinetics of BDNF-containing granules within minutes. For intracellular accumulation, endocytosis of amyloid-beta and leakage of endocytosed amyloid-beta out of endosome or lysosomes are necessary, which makes it unlikely that intraneuronal accumulation of exogenous amyloid-beta is important for the fast effect on BDNF transport we observed. Furthermore, the observation that BDNF release is unaffected in 5xFAD cultures might give a hint that deficits in transport occur before intracellular accumulation of amyloid-beta. Retrograde transport deficits could influence endosomal or lysosomal membrane trafficking. These transport deficits may end in a lysosomal leakage [94年)从而导致intraneuronalβ淀粉状蛋白质的积累和持续的病理生理过程。
我们的研究表明,神经营养因子BDNF显示适度colocalization蛋白质应用多孔结构的海马神经元。顺行和逆行运输BDNF-containing囊泡在不同的模型系统受损的阿尔茨海默氏症。有趣的是,海马神经元的短期治疗淀粉样β蛋白(1-42)导致减少BDNF-containing泡已经急性后应用程序的平均速度。之前因为逆行运输是影响顺行方向,这表明不同的机制在BDNF direction-specific赤字的运输工作。
5。结论
生成脑衍生神经营养因子(BDNF)是一个重要的生长因子在中枢神经系统。赤字在运输的分泌蛋白可能是神经退行性疾病的基础。我们发现细胞外乳沟的产品应用诱导快速运输BDNF-containing泡动力学的变化。数据进一步表明可能应用的角色分离的囊泡从微管的数量从而减少移动囊泡释放脑源性神经营养因子影响转基因表达时突变的应用。
利益冲突
作者声明没有竞争的经济利益。
确认
作者要感谢Sabine谬克,Regina齐格勒,玛吉特施密特为专家提供技术援助和教授Christoph Kaether APP-YFP质粒。这项研究是由联邦州的萨克森-安哈尔特州和欧洲区域发展基金”(ERDF 2007 - 2013),项目:行为脑科学中心(CBBS)。
补充材料
补充图1显示了描述5 xfad海马文化。补充图2显示了一个示意图说明传输动力学。补充图3显示了一些动态属性的顺行和逆行导演BDNF-containing囊泡没说完后表达。在图4中,结果表明,应用在单个细胞表达水平没有与BDNF-transport赤字的程度。Colocalisation BDNF-containing囊泡的应用补充描述了图5。补充图6显示可溶性因子释放到细胞外介质扰动BDNF的顺行运输小泡。急性治疗淀粉样β蛋白(1-42)没有影响传输的特点,顺行指示BDNF-containing囊泡补充图7所示。