文摘
为了探索新的无创性治疗脊髓损伤(SCI)的选择,本研究调查的影响对SCI大鼠电针刺激(EA)模型。SCI诱导了艾伦的重锤法修改。我们调查的反应EA Dazhui(问14)和品名门(问4)穴位来理解的效果和机制EA在SCI后神经保护和神经功能恢复。BBB测试用于检测运动机能的老鼠的后肢组间,EA是促进经济复苏显示SCI大鼠的运动机能。尼氏小染色显示恢复神经形态学和EA后神经元的数量的增加。同时,antiapoptosis角色被TUNEL染色暴露。免疫印迹分析是用来确定蛋白质的表达neurotrophin-3 (NT-3)在脊髓组织。虚假的组相比,NT-3的表达水平显著降低,EA是上调NT-3的表达。目前的研究表明,EA在神经保护的作用和背侧神经功能恢复SCI大鼠后,尤其是EA刺激在全球之声14和命门,可以极大地促进神经功能恢复,这可能导致移植NT-3的表达。
1。介绍
脊髓损伤(SCI)是一种意外的悲剧,造成意外遭受身体上和情感上,是昂贵的病人1]。创伤somatesthesia SCI可引起疾病和受伤的运动水平以下。SCI诱发主要机械损伤和继发性脊髓损伤。主要发生的损害机械组织立即中断后的创伤。二次损伤是由复杂的细胞和分子过程2]。
目前主流科学的治疗方法包括几种药物、神经营养因子、细胞移植试验,基因治疗和生物材料移植3,4]。中药(TCM)治疗也被报道和使用(3,4]。药物治疗包括甲基强的松龙和GM1 [3]。神经营养因子包括神经生长因子(神经生长因子)和脑源性神经营养因子(BDNF) (5]。
针灸是一种治疗技术用于中药。从其发展几千年前,针灸医疗保健和治疗做出了许多的贡献。电针刺激(EA)是一种治疗针的插入一个穴位是附加到一个跟踪脉冲电流与产生合成电针刺刺激的目的。EA治疗SCI的应用展示了有前景的结果在减轻病人的痛苦6]。之前有研究表明,应用EA的SCI的治疗已被证明有助于神经系统和功能恢复在SCI (7- - - - - -9]。
中医认为,血管损伤的主要原因是SCI州长。营养不良的肌腱和肌肉由于妨碍气血不通引起废弃和萎缩。因此,州长船穴位治疗SCI是第一选择。“Dazhui”(问14)州长船的交汇处,手,足三阳经。针灸刺激在全球之声14可以激活并激励之全身疏通经络。“品名门”(问4)也是一个州长船穴位和十字路口的州长船和带船。它收集genuine-Yin genuine-Yang, Yuan-qi的根源和生命的网关。刺激全球之声4可以调节通道和激活络脉,温补,并加强肾脏。在之前的实验中使用SCI大鼠模型、针灸刺激在全球之声14和问4采用(10]。
EA的州长船已经被证明可以缓解SCI后的二次损伤患者和动物模型(10,11]。疗效已被审查报告(12]表明,针灸刺激在州长船SCI后可以促进运动功能恢复和改善膀胱功能的恢复。证据来自临床试验和基础研究支持EA州长血管运动功能的恢复,SCI后膀胱功能,感觉四肢的函数(10,13- - - - - -15]。
神经营养因子(NTFs)蛋白质分子对神经元生存和发展都是至关重要的,16]。神经生长因子、脑源性神经营养因子3 (NT-3)生成,生成4/5 (NT-4/5)被确定为NTFs。NT-3神经元生存至关重要,在神经发育分化,神经回路的形成(17,18]。NT-3也是一个重要因素在脊髓修复的微环境(16]。它具有影响力的作用在防止神经元死亡受伤的脊髓,维护神经元生存、促进轴突再生(16]。外生NT-3也促进成年干细胞移植后生存和分化成一个脊髓受伤(19]。先前的研究发现,EA在州长船促进分泌的NT-3受伤部位和邻近组织SCI后14天(7,20.]。然而NT-3是否改变之前,这一次是未知的。
本研究旨在探讨EA能否促进神经功能的恢复一个合适的微环境SCI后通过增加内源性NT-3分泌和表达在受伤部位和邻近组织后执行EA在州长船SCI的早期阶段。
2。实验程序
2.1。动物和实验组织
机构批准的所有实验动物保健和使用委员会北京中医药大学。165只老鼠(Sprague-Dawley,男,180 - 220 g)的比率被随机分成三组1:1:1。sham-operation组(S)只有一个椎板切除术。其余两组在T10建模为脊髓损伤脊髓段。对照组(C)没有接受治疗。EA组EA在问14和命门穴位治疗。对照组和EA组老鼠被随机放入下面的子组:1 d、3 d、7 d。有20大鼠每组3 d和7 d,分别和15组1 d大鼠。每个动物都住在笼子里分离与免费的食物和水。室温设定在°C。
2.2。脊髓损伤
诱导SCI的外科手术是根据已建立的方法(21]。老鼠用10%水合氯醛麻醉(3.5毫克/公斤,腹腔内),执行和椎板切除术在T9-T11层面,暴露底层绳没有扰乱硬脑膜。脊髓挫伤是使用重锤装置诱导,在指导5 g杆从一个高度80毫米到接触线,代表温和的科学。可吸收明胶海绵放置在网站的SCI止血,缝合的脊柱。之后,皮肤和肌肉组织被缝合。椎板切除术进行sham-operation组不科学。所有科学研究中动物模型包括了以下损伤标准:绕的脊髓缺血,水肿,尾巴左右反射,形成移动身体和腿,和缓慢的出现瘫痪(图1)。所有的动物都回到笼子里有足够的水和食物,然后被分开处理日常的腹腔内注射的剂量庆大霉素2000μ,每天两次。没有使用止痛剂。老鼠接受了SCI接受专业护理组成的人工膀胱表达式期间每天三次,清洗实验。
(一)
(b)
(c)
2.3。针灸的应用程序
问14和命门穴位时使用EA治疗。问14穴位位于后中线和抑郁的第七颈椎棘突下卧姿。问4也位于后中线和抑郁的第二腰椎棘突下卧姿。老鼠被放置在一个布袋在EA没有麻醉管理。虚假的和控制动物被捕获的束缚EA组接受治疗的时候,每次20分钟的时间,以确保相同的工艺条件。消毒一次性不锈钢针(毫米,中研泰和品牌,北京中研泰和医疗器械有限公司,有限公司,北京,中国)插入问14(斜向下),全球之声4(斜向上),分别对点深达5 - 7毫米。插入后,电极连接到针的处理(电子针灸器使用:LH202穴位神经刺激器,北京华为工业发展有限公司有限公司,北京,中国)。电动仿真参数2赫兹的频率和强度1 mA 20分钟。老鼠接受了EA治疗后2小时SCI模型建立和麻醉复苏。1小时前安乐死,在24小时的时间均在EA组1 d大鼠有第二治疗。老鼠在3 d和7 d EA组每天也会以同样的方式一次直到他们安乐死在约定的时间。虚假的和控制动物没有接受治疗。最后,11个老鼠每组进行了分析。6大鼠每组灌注固定和新鲜组织来自其他5大鼠/组。上述过程后进行麻醉。
2.4。行为测试
老鼠从虚假的组、对照组和EA组评估后肢运动功能1 d, 3 d,和7 d后伤两人蒙蔽观察员通过低音部,比蒂,Bresnahan (BBB)后肢运动量表测试。BBB评级尺度比例系统基于操作上定义的行为特性,它遵循完全瘫痪正常运动的复苏进程。评定量表范围从0到21岁,0分表示完整的后肢瘫痪和21分表示完全正常运动功能。
2.5。尼氏小染色
六11每组大鼠的灌注和时间均在指定时间安乐死transcardially 0.9%氯化钠和4%多聚甲醛在1 x磷酸缓冲盐(4% PFA) 30分钟。脊髓手术切除和保留在一夜之间4%的PFA后缀。脱水后,脊髓与石蜡、嵌入式和串行日冕部分厚度的4μm。评估的组织病理学变化,每一个受到尼氏小染色获得六个部分。幸存的神经元在蓝染色尼氏小体的特征。量化是由计算神经元生存五个随机选择的字段的数量在每个幻灯片从每个部分在同一结构的一部分在400 x奥林巴斯光学显微镜(BX53、日本)。两个观察者,盲目的实验中,计算幸存的神经元。
2.6。TUNEL染色
检测细胞凋亡,六冠的每一个部分获得上述实验过程中进一步受到末端转移酶介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)染色。评估凋亡细胞,我们测量6个样品在一个从每个脊髓节随机选取的。凋亡细胞的特点是深棕色染色细胞核核膜。量化是由计数阳性细胞的数量在五个随机选择的领域内每个幻灯片从每个部分在同一结构的一部分在400 x奥林巴斯光学显微镜(BX53、日本)。细胞凋亡指数计算整体凋亡细胞的比例。两个观察者,盲目的实验中,计算凋亡细胞。
2.7。西方墨点法
剩下的五11每组大鼠深麻醉用10%水合氯醛和安乐死在约定的时间。1厘米的脊髓段集中在震中受伤很快就被切割。脊髓匀浆蛋白在50由快速均质化μL裂解缓冲。样本离心机在10000 r / min 10分钟在4°C。蛋白质浓度测定采用布拉德福德法(22]。对电泳、蛋白质样品(40μ每g)溶解在样品缓冲和5分钟加热到100°C。样本然后解决10% sds - page和转移到PVDF膜。包含5%的膜被封锁在TBS-T脱脂奶粉1 h,其次是孵化NT-3 (ABcam 1: 500年,英国)在一夜之间在4°C。洗后,膜与HRP-Goat-Anti-Mouse孵化免疫球蛋白(ZSGB-BIO 1: 5000年,北京,中国)。蛋白质被ECL可视化化学发光(圣克鲁斯,美国)。所有免疫印迹实验至少重复3次。GAPDH(减少glyceraldehyde-phosphate脱氢酶)担任内部控制。目标蛋白质的灰色值除以,内部控制要想纠正这个错误,导致了由于样品中靶蛋白的相对含量。
2.8。统计分析
没有老鼠死于1 d;在3 d、2老鼠死于虚假的集团3老鼠死于对照组,和1只老鼠死于EA组;在7 d,没有老鼠死于虚假的集团5 7老鼠死于对照组,大鼠死于EA组。最后,11个老鼠每组随机选择进入统计数据。数据被当作手段SD(标准差)。SPSS 20.0(美国芝加哥SPSS Inc .)部署了数据分析用单向方差分析方法测试后的正态分布和方差齐性,其次是一个事后多重比较。两组之间,我们使用费舍尔的LSD(最小显著差)方法比较任何差异。将统计意义。
3所示。结果
3.1。EA SCI后行为测试的影响
我们使用了BBB后肢运动量表测试来评估神经功能1 d, SCI后3 d和7 d。意思是BBB评分(表1)低于对照组的虚假的组1 d、3 d、7 d后SCI ()。意思是BBB评分(表1)的EA组高于对照组7 d后SCI ()。BBB评分均值在对照组增加从0.6364 1 d在7 d(表2.09091)。EA组均值BBB评分从0.6364增加1 d在7 d(表4.09091)。虚假的BBB评分小组的最高水平,因为神经功能并未损坏(23]。这些结果表明,EA扮演重要的角色在改善神经功能。
3.2。SCI后EA对神经元存活的影响
虚假的组神经元表现出大量的人口甲苯胺蓝染色颗粒在细胞质中(图2)[24]。然而,在对照组中,尼氏小体显著下降甚至消失在神经元1 d(图2)。在3 d,运动神经元的灰质显示明显的萎缩,一些神经细胞溶解,尼氏小体的数量明显减少,甚至消失在对照组(图2)。7 d,少量的神经元尼氏小体在对照组(图再次出现2)。在EA组尼氏小体的数量与对照组相比恢复并显示补丁形态(24]。组织形态学没有改变在EA组1 d;神经元也有不同程度的降低染色是轻(图2)。在3 d,神经元萎缩和减少仍然存在,但条件是比在对照组,和尼氏小体是EA组(图中隐约可见2)。在7 d,剩下的神经元尼氏小体的出现再次接受EA治疗后,和数量明显大于对照组(图2)。EA组显示与对照组相比显著保护神经元1 d, 3 d和7 d后SCI(图2;表2)(数据给出的意思SD,,而虚假的集团;;,而对照组;动物每组)。这些结果表明,大鼠较低数量的幸存神经元SCI后,和EA可以提高生存。
3.3。EA对SCI后抑制凋亡细胞死亡
虚假的组中,有几乎没有TUNEL阳性细胞(图3)。在对照组,阳性细胞出现,主要分布在受损区域及其边缘在SCI后1 d(图3)。阳性细胞明显增加,广泛分布在灰质和白质对照组的3 d SCI后(图3)[24]。在7 d,阳性细胞在对照组比以前少。在对照组,神经元萎缩,表现出异常形态与染色质凝集,内向的核细胞膜,增加凋亡体(24]。不过,神经元的EA组显示更少的染色质浓缩,核膜清晰24]。不过,EA组显示显著降低brown-positive细胞与对照组相比在1 d, 3 d和7 d后SCI(图3;表3)(数据给出的意思SD,,而虚假的集团;,而对照组;动物每组)。这表明EA可以减少细胞凋亡,促进神经元的生存,有一定的保护作用。
3.4。EA NT-3 SCI后的调节蛋白的表达
我们利用免疫印迹分析确定的表达NT-3半定量的评估SCI和EA的保护作用的发展,虚假的组NT-3显示表达式。在对照组,NT-3的表达下降1 d和3 d没有统计学意义(,图4;表4),但有降低的趋势,而表达NT-3仍然降低了7 d与统计学意义(SCI后,图4;表4),表情总是低于假组(图4;表4)。虽然NT-3在EA组脊髓组织的蛋白表达增加与对照组相比有统计学意义在3 d和7 d SCI后(、表4),没有统计学意义在SCI后1 d (、表4),但仍有增加的趋势。这表明,EA NT-3在脊髓组织的表达增加。
4所示。讨论
在这个研究中,对照组的BBB评分和EA组收到SCI操作所统计差异1 d与虚假的集团相比,3 d,和7 d,这证明了SCI模型成功建立了老鼠的后肢的运动机能出现瘫痪。在SCI后7 d, BBB评分开始出现显著统计EA组和对照组之间的差异,这表明,后肢的运动机能的老鼠逐渐复苏,复苏的老鼠接受了EA治疗优于控制老鼠没有EA治疗。这意味着,EA治疗可以促进运动功能恢复SCI后,也是尼氏小染色所示,TUNEL和免疫印迹。
除了损伤脊髓损伤的现场,继发性病变发生在下列顺序:水肿、缺血、钙超载、脂质过氧化反应,微循环障碍,细胞凋亡25,26]。与周围神经系统的神经元(pn)的中枢神经系统(CNS)不自发再生轴突损伤后;因此,大脑或脊髓创伤通常会产生永久性的神经赤字(27]。SCI诱导神经元和少突胶质细胞的凋亡细胞死亡导致脊髓进行性变性,导致永久性功能缺陷(28]。发展的有效的治疗方法,可以恢复丢失的神经功能因此极度依赖策略促进强劲的轴突再生(27]。在过去的几十年里,一个伟大的作品在阐明生物机制限制削弱受伤的中枢神经系统轴突的再生27]。
我们的研究结果显示,少postinjury神经元死亡发生在EA组与对照组相比,解释为神经保护。而且我们的研究结果还表明,EA可以维持神经元的细胞形态,这导致损伤的脊髓的功能恢复的老鼠。
神经营养因子输入轴突通过其受体介导的内吞作用的轴突,然后达到神经元通过等离子体流反向运输,这可能会导致不同的信号通路的激活或抑制细胞,调节相关蛋白的表达,支持神经元发展发挥作用,生存,发展,和功能完整性(16]。NT-3神经元生存至关重要,在神经发育分化,神经回路的形成(17,18]。
NT-3广泛分布在周边和中枢神经系统,主要在海马,背根神经节,脑干和脊髓等等(29日]。陈和方发现NT-3像免疫反应性的物质在中枢神经系统的分布包括胶质细胞和神经元;前者是主要分布在胼胝体,黑质,海马伞,室区,和小脑,而后者主要分布在隔膜,对角线的喝彩,颗粒细胞的原始嗅皮层,杏仁核,脑干和脊髓运动神经元29日]。这可以理解为脊髓的灰质为主要表达网站NT-3,尤其是运动神经元中表达,所以NT-3神经元在脊髓的灰质,尤其是在腹侧角运动神经元的生存和正常功能,发挥了重要作用29日- - - - - -31日]。
目前的研究发现,NT-3水平脊髓受伤的对照组和EA组相比,在减少虚假组大鼠的脊髓细胞合成和分泌。这可能是脊髓受伤诱导细胞死亡或受损细胞的衰落”功能的受损区域和邻近组织合成和分泌NT-3;因此NT-3水平将下降(32]。我们还发现NT-3水平在脊髓损伤区域及邻近组织的EA组相比显著增加,对照组在收到7天州长船舶EA治疗。这可能是由州长船EA治疗预防一些受损的细胞合成和分泌的死亡NT-3或可能的调控和修复受损细胞的生理功能。无论NT-3增加的机制是什么,NT-3水平的增加在该地区的脊髓受伤和邻近组织创建了一个合适的微环境脊髓修复。以下研究结果所示,Chen等人。33)使用免疫组织化学染色法、原位杂交和PCR技术检测和观察的影响EA NT-3的表达的脊髓背根。研究发现,NT-3的表达在大或小的猫的背根神经节神经元EA组明显高于其他组。王等人。34)发现通过使用EA模型的治疗效果的猫的脊髓背根部分切除,发现阳性神经元的NT-3脊髓板二增加,推测EA可以加快修复脊髓损伤通过促进NT-3的表达。
此外,NT-3少突细胞发展都发挥着重要作用(35,36]。黄等人的研究表明,治疗可以促进NT-3 EA表达,增加内源性少突细胞前体细胞的数量和分化(信息公开化和remyelination在脊髓脱髓鞘7]。另一项研究表明,EA治疗可能增加NT-3表达,促进oligodendrocyte-like从(NT-3)受体(TrkC)细胞分化的基因修改的间充质干细胞(TrkC-MSCs) remyelination,功能改善脊髓脱髓鞘。然而在我们的研究中,我们没有观察到EA影响NT-3及其行动少突胶质细胞和其他神经胶质细胞(37]。
根据中医,问14和问4点与州长船。脊髓和州长船对经络有直接接触。基于的原则“经络通,适应症的穴位经络可以认为,“选择州长血管治疗截瘫与脊髓损伤符合中医说“寻找疾病治疗的主要原因”(38,39]。
5。结论
州长在问14日船EA和问4可以改善SCI后功能恢复减少凋亡细胞死亡。同时,EA治疗的神经保护作用可能由NT-3水平损伤后脊髓周围的微环境。此外,目前的研究表明,刺激问14和命门,特别是与电针刺激,可能是脊髓损伤的有效的治疗策略。
附加分
的局限性。这项研究有一个小的样本容量。并NT-3及其受体之间的相互作用(如TrkC)和EA的影响在不同的时间应该探索在未来。此外,EA-NT-3对少突胶质细胞和其他神经胶质细胞的影响应考虑而不是神经元。最后,定量分析也是必要的,例如ELISA。
相互竞争的利益
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
余墨和Hai-jiang姚明同样对本文亦有贡献。本文作者是余万莫和修订Hai-jiang姚明。余万莫EA治疗和执行完成的论文中写道。Hai-jiang姚明,魏Lv,洪涛歌负责模型的建立和样本收集。尼氏小染色、TUNEL和西方墨点法是由毛泽东和小陈Ying-qiu元,分别。梁羽生武侠歌曲和Quan-kai Jing完成行为评估和数据提取。Su-hua史进行数据分析和李Zhi-gang仲裁任何分歧,确保了在研究过程中没有出现错误。所有作者贡献的概念研究和批准的出版。
确认
这个科学工作得到了国家自然科学基金(没有。81373728)。由于是由约翰•m•范Alsobrooks和通博士先生,来自北京中医药大学的作者提供一些帮助修改本文的英语表达。