文摘

大麻素受体1型的表达模式(CB1R)和大麻素受体2型(CB2R)在啮齿动物和灵长目动物。在长尾黑颚猴猴,CB1R存在于视网膜神经元(光感受器,水平细胞、双极细胞、无长突细胞和神经节细胞)和CB2R只存在于视网膜神经胶质细胞(穆勒)。然而,这些大麻素受体的作用在正常灵长类动物视网膜功能仍然是难以捉摸的。使用细致的长尾黑颚猴electroretinography在成人,我们记录了神经活动的变化后,封锁CB1R和CB2R intravitreal政府他们的对手(AM251 AM630, resp)在光和暗的条件。我们的结果表明,AM251增加了适应光的一波振幅在闪光强度高,而AM630增加光的振幅,b-waves。在暗的条件下,阻滞剂b-wave振幅增加,但没有改变一波振幅。这些发现表明一个重要的角色CB1R和CB2R灵长类动物视网膜的功能。

1。介绍

神经系统是由大麻素受体1型(CB1R),大麻素受体2型(CB2R)、内源性配体(内源性大麻素)、合成和代谢酶。的生理和心理影响大麻类几乎到处都可以发现在体内大量的大麻素受体。CB1R和CB2R表达模式在众多物种的视网膜里有清楚的记录,包括啮齿动物和灵长类动物(1- - - - - -6]。在啮齿动物,CB1R CB2R表达在许多视网膜细胞类型,特别是锥和杆光感受器,水平细胞,无长突细胞、双极细胞和神经节细胞(1,7]。在长尾黑颚猴猴,CB1R主要发现在中央视网膜上的视锥细胞,杆小球与非常低的表情,双极细胞、水平细胞和无长突神经节细胞(5]。CB2R,另一方面,在穆勒灵长类神经胶质细胞中表达的是严格6]。除了视网膜,CB1R已经观察到的表达模式背外侧膝状体核(8和初级视觉皮层9的灵长类动物。

我们的大多数知识的作用在人类的视觉大麻类来自报告,轶事,研究大麻消费者(审查[10])。除了众所周知的“红眼”效应(血管扩张)的大麻和降低眼内压(IOP) (11- - - - - -13),功能性内源性大麻素对视觉系统的影响尚未定义良好的(14]。然而,大麻类生产管理的一些已知的改变人类的视觉系统。其实案例研究指出,人类cannabis-mediated视觉效果的存在,特别是增加眩光复苏在低对比度15),减少游标和Snellen≤16,17),改善夜视(18,19),视力模糊20.),颜色的改变歧视,和光敏性的增加21]。最后者(心理物理)可能影响视网膜组件,这可能是由于神经化学变化引起的视网膜神经系统。事实上,许多生理效应大麻类被报道为每个在牛视网膜细胞类型,几内亚猪,啮齿动物和鱼类(审查[10,22])。牛视网膜,激活CB1R增加单胺氧化酶(23]。在豚鼠视网膜刺激CB1R导致多巴胺释放的抑制24),大鼠视网膜,大麻素受体的激活调节(S]三磷酸鸟苷γS-binding在光感受器和压敏膜电流,双极细胞和神经节细胞(3,25- - - - - -28]。此外,大麻素受体激动剂增加金鱼的锥光响应抵消视网膜(29日]。

网膜电图(ERG)是一个有用的工具来评估视网膜功能通过测量视网膜细胞的电反应的人群,主要是光感受器(视锥细胞和棒),双极细胞,无长突细胞,Muller细胞(30.- - - - - -32]。ERG波包括两个主要部分:负振幅(波)和积极(b-wave)。传统上,一波反映了视杆细胞和视锥细胞对光线的反应(33,34]。代b-wave, ERG的第二个主要组成部分,是由于视网膜内部,主要是双相的去极化和Muller细胞(30.- - - - - -32,35- - - - - -39]。选择特定的刺激和记录环境分离的组件ERG和目标特定人群的视网膜细胞。例如,杆功能评估在黑暗的眼睛,在暗条件下,当锥反应更好的评估与高强度的闪光,在适应光的条件下(38]。在这项研究中,我们调查了正常视网膜功能的改变以electroretinography长尾黑颚猴在成年后的封锁CB1R或CB2R拮抗剂AM251 AM630,分别。

2。材料和方法

2.1。选择的物种

长尾黑颚猴猴成为首选动物模型用于生物医学研究仅次于恒河猕猴(41]。长尾黑颚猴非常相似的生理和行为的猕猴,它们更加容易理解和无病用更少的健康和安全风险。长尾黑颚猴猴有视网膜中央凹双目视觉随偏心率的锥密度高,三色颜色视觉,six-layered背外侧膝状体核(42,43]。最近,我们有标准化的一种非侵入性,无痛的长尾黑颚猴ERG方法(40)显示高度可比录音猕猴(44)和人(45]。

2.2。主题

长尾黑颚猴16 (Chlorocebus sabaeus)进行了测试研究。这些猴子被注射AM251 6,另一个六人注射AM630。额外4猴子注入车辆(DMSO)用于稀释我们的对手为了提供控制的价值观。灵长类的动物喂养食物(哈伦Teklad猴子高蛋白饮食;美国麦迪逊,哈伦Teklad WI)和新鲜的当地水果,与水可用随意。所有实验根据加拿大动物保护协会的指导方针(CCAC)和视觉和眼科学研究协会(下午)声明中使用动物在眼科和视觉研究。实验协议也审查和批准的当地的动物保健和使用委员会(蒙特利尔大学协议# 14 - 007)的机构审查委员会行为科学的基础。没有一个动物是牺牲了这项研究。

2.3。动物准备ERG录音

所有程序都按照标准协议的electroretinography长尾黑颚猴猴(40]。简单地说,所有的动物都收到了肌肉注射氯胺酮(10毫克/公斤;特洛伊实验室、Glendenning、新南威尔士、澳大利亚)和甲苯噻嗪(1毫克/公斤;劳埃德实验室,谢南多厄,美国IA)保持一个适当的阻止动物的镇静水平移动和闪烁。这种药物混合物对ERG录音(没有影响46]。有1% tropicamide (Mydriacyl)和2.5%盐酸去氧肾上腺素(Mydfrin)(美国爱尔康实验室、沃斯堡、TX),学生们完全扩张(约9毫米直径),住宿瘫痪。角膜是麻醉与0.5%盐酸proparacaine (Alcaine;美国爱尔康实验室,沃斯堡,TX)。预防角膜干燥、眼睛湿润经常与2.5%甲基纤维素(Gonak;阿肯,Inc .,布法罗格罗夫,IL,美国)。体温是36.5°C和38°C之间保持一个加热垫。记录会议持续了约2小时后,动物被遣送回他们之前自然设置隔离恢复期后。

2.4。Intravitreal注入

CB1R拮抗剂AM251从开曼群岛购买化学品(安阿伯市,美国)。CB2R拮抗剂AM630从Tocris购买(Tocris生物科学、Ellisville,密苏里州,美国)。这两个对手在无菌条件下在DMSO溶液稀释。假设没有泄漏,最终浓度为1.5% DMSO v / v, 0.01毫克/μAM251 L和0.003毫克/μAM630 L。提出任何车辆(DMSO)的影响,我们减去ERG的录音DMSO-injected动物ERG录音的药物注射的动物。通过这种方式,我们报告的影响只有那些超出车辆的影响。检查和检查后的眼睛,角膜为45秒与5%聚乙烯吡咯酮碘清洗解决方案。proparacaine下降的局部麻醉,然后应用在注射部位。结膜和角膜表面进一步滋润甲基纤维素(水分的眼睛,博士伦加拿大,沃恩,,加拿大)。角膜与无菌保护涂料而将Barraquer眼窥器(1.75英寸,宽10毫米小刀片)。共有50个μL药物解决方案是2毫米后的角膜异色边缘注入玻璃腔。在针,注射部位压缩了一分钟用无菌棉拭子避免回流。眼睛的后面是intravitreal注入之前和之后使用眼底镜检查来验证视网膜的完整性。没有实质性的差异观察前后眼压intravitreal管理。后续,动物的眼睛检查七天每天注射后,或者局部抗生素软膏(Tobrex, 0.3%妥布霉素眼药膏,加拿大爱尔康,米西索加,加拿大)。

2.5。视觉刺激

细致的刺激是由Ganzfeld光源(uta e - 3000电生理设备;马里兰州盖瑟斯堡LKC Technologies, Inc .,,,美国),放置在动物的面前。唤起了尔格< 5怀特女士闪光在细致的条件。氙气闪光灯亮度为2.5 - 800 cd·s·m⁻²(0分贝至20 dB LKC单位)被用于适应光的录音和LED闪光灯亮度为2.5×10⁻⁵6 cd·s·m⁻²(−40 dB 4 dB LKC单位)暗录音。对于light-adapted尔格稳定background-adapting字段(30 cd·m⁻²)提出了内部Ganzfeld饱和杆系统。暗适应持续了大约20分钟。Interstimulus至少20秒的时间间隔是在高强度使用黑暗的眼睛。闪光强度和背景亮度校准使用研究辐射计(IL1700光度计、国际光Inc .、纽,妈,美国)用SED033探测器放置在36厘米从源。

2.6。ERG记录

所有ERG程序后ISCEV指南和长尾黑颚猴猴的最近出版标准化ERG协议40]。ERG反应分别记录角膜接触镜电极之间(射流电极,Diagnosys LLC,洛厄尔,妈,美国)躺在每只眼睛的角膜的中心。飞机电极配备四个小帖子凸表面以保持眼睑开放。参考和地面黄金圆盘电极(模型F-E5GH;草技术、Astro-Med Inc .)、西沃里克,RI,美国),分别放在外眼角和额头胶粘剂粘贴(Ten20导电脑电图粘贴,Kappa医疗,普雷斯科特,阿兹,美国)。对波形的分析,一波振幅测量从基线到低谷的一波。b-wave的振幅测量的槽波的峰值b-wave。发病的高峰延迟定义flash槽或峰值。基线和接受适应光的振幅和延迟计算的平均值来最小化ERG固有的噪声信号,提高能力,允许强大的参数统计分析。因为只有一个基线记录注入眼,基线值的计算从平均在两只眼睛(当可用)由于尔格不相差很大在眼睛(47]。对于接受的值,我们有几个录音从注入的眼睛(每10分钟40分钟)。目视检查显示峰值效应出现在30和40分钟的接受录音。这些都是因此平均每个强度flash获得接受的值。视网膜反应图被画在Adobe InDesign使用Adobe Illustrator和加工(Adobe Systems加拿大,渥太华,加拿大,软件版本CS5)。记录协议评估药物总结在图的影响1。

2.7。统计分析

绝对的槽(波)和峰值(b-wave) ERG曲线得到的每个光强度值。当ERG曲线低光照强度(<−2日志cd·s·m⁻²)没有回到基线350 ms刺激后,a -的振幅和b-wave纠正占基线的转变。当没有一波,或无波,检测,0的振幅和延迟是留空,特定刺激强度。离群值(±2.5 SD)被移除(< 2%)。接受振幅和延迟表示为注射前振幅的变化百分比(接受-注射前,除以注射前)。三角洲注入AM251变化百分比和AM630然后减去从三角洲变化百分比控制注入,DMSO溶液。因此,积极归一化效应表明由于注射药物,增加大于单从注入车辆改变这一结果。评估观察的统计显著性增加,我们分析了振幅和b-waves使用广义估计方程(GEE)与闪光强度在主体因素,因为每只猴子是多次测量(每次闪光强度)。这些主要的影响,及其相互作用,被用来估计的归一化影响视网膜注入AM251和AM630视网膜功能。随访显著影响,在适当的时候,两两比较,显著的值表示与明星相关的数据。

3所示。结果

3.1。视网膜功能适应光的条件

视网膜功能评估使用electroretinography light-adapted条件下车辆DMSO溶液注入后,CB1R拮抗剂AM251或CB2R拮抗剂AM630(图2)。

3.2。明b-Wave

我们的结果表明,振幅b-wave注射后保持一个正常的适应光的山形状表明视网膜的功能完整性受损(图3(一个))。哎呀分析显示flash的重要主要作用强度(),一个重要的闪光强度之间的交互和注射组()。交互是跟进成对比较。AM251没有明显不同于DMSO在任何的闪光强度(图3 (b))。相比之下,AM630导致振幅显著增加,相对于控制注入,在几个闪光强度,从0.6到1.6的日志cd·s·m⁻²(0.6:55%增加幅度相对于控制,;0.9:增加53%,;1.4:增加63%,;1.6:增加60%,;重要的影响表示在图3 (c))。AM251的主要作用是平均增加了6%,这不是明显不同的车辆,由零的表示设在数字3 (b)- - - - - -3 (d)()。所有flash AM630的主要影响,平均强度,是无意义的,但趋势,增加34%仅在视网膜的反应相比,车辆(,图3 (d))。相同的延迟也分析了哎呀模型和交互()是跟着上面。两两比较显示无显著差异,药物和车辆,在任何的闪光强度(没有显示)。

3.3。适应光的波

我们的研究结果表明,注射后,一波的振幅常态曲线(图4(一))。然而,药物的效果是完全不同于车辆。哎呀分析显示flash的重要主要作用强度(),一个重要的闪光强度间的相互作用和药物组()。这种交互表明药物的效果是不一样的在所有闪光强度。交互是跟进成对比较。AM251引起振幅明显高于DMSO闪光强度最高的2.4和2.9日志cd·s·m⁻²(2.4:36%增加幅度相对于车辆,;2.9:增加32%,;重要的影响表示在图4 (b))。就其本身而言,AM630导致振幅显著增加,相对于控制注入,在一组更大的闪光强度,从0.9到2.9日志cd·s·m⁻²((0.9:增加30%,;1.4:增加38%,;1.6:增加32%,;2.4:增加39%,;2.9:增加35%,),表示有显著影响在图4 (c))。AM251引起一波振幅的增加只在闪光强度最高,而AM630增加了一波振幅在更广泛的闪光强度。平均AM251的主要作用是增加了12%,这是相对于单独车辆不显著()。相反,AM630的主要影响,平均所有flash强度,是一个无足轻重的但趋势增加26%的响应性视网膜相比单独车辆(,图4 (d))。相同的延迟也分析了哎呀模型和交互()是跟着上面。两两比较在每个强度值显示药物和载体之间没有显著差异(没有显示)。

3.4。视网膜功能暗条件

评估的影响大麻素受体拮抗剂在暗条件下,ERG反应模拟视网膜的黑暗也注册管理DMSO溶液后,AM251或AM630。的ERG轮廓保持正常的形状后注入。然而,振幅b-wave增加的两个治疗组,虽然药物没有可靠地改变海浪的模式(图5)。

3.5。暗b-Wave

注射后,暗的振幅b-waves正常形状:增加振幅增加闪光强度(图6(一))。然而,药物的效果是完全不同于车辆。哎呀分析显示重要的主要影响注射组()。没有主要影响闪光强度(也没有一个交互组与闪光强度()。由于缺乏互动,两两比较在每个闪光强度并不合理,但平均值和标准错误是绘制在图6 (b)(AM251)和图6 (c)(AM630)。跟踪药品的主要影响,两两组间比较显示注射后明显高于振幅AM251单独车辆相比增加20%,)和类似的增加幅度后注入AM630(增加18%,)(图6 (d))。这两种药物之间差异不显著()。延迟效应的振幅有相同的模式。两个药物导致显著增加延迟相对于车辆(AM251: 8%,;AM630: 12%,)。没有交互存在(没有显示)。

3.6。暗一波

注射后,暗波的振幅有正常的形状:振幅增加闪光强度增加,开始−1日志cd·s·m⁻²(图7(一))。因此,暗波的统计分析只涉及闪光中获取的值1.4−1日志cd·s·m⁻²。哎呀分析显示flash的重要主要作用强度()和一个重要的相互作用强度的flash和药物注射()。交互是跟进两两比较,药物和载体之间的,在每一个闪光强度值。这并没有发现显著差异,药物和车辆,在任何强度的数据7 (b)和7 (c))。因此,虽然这两个受体激动剂在不同的闪光强度产生不同的影响,每种药物的影响相对于车辆,在给定的闪光强度,明显还不够可靠。整体效果AM251 AM630,平均在闪光强度没有明显不同于车辆(图7 (d))。相同的延迟也分析了哎呀模型和交互()是跟着上面。两两比较显示一个显著差异闪光强度0.6;注入AM251后,延迟达到峰值21%相比慢车辆单独注射(,而不是如图所示)。

4所示。讨论

本研究的目的是确定大麻素CB1和CB2受体的作用在正常猴视网膜。丰富的CB1R和CB2R表达在视网膜上已经指出,这些受体在正常视觉的一个重要的角色。我们分析了明和暗ERG的变化与各自的拮抗剂阻断这些受体后的反应。DMSO作为控制使用的实验设计,而不是注射前值,来控制车辆的任何影响。在适应光的条件下,我们证明了只有封锁CB2R b-wave的振幅增加,高于标准闪光强度值,而阻塞CB1R或CB2R一波的振幅增加,在高闪光强度值。在暗的情况下,然而,封锁CB1R或CB2R只有b-wave无论flash的振幅增加强度。

4.1。适应光的条件

ERG的主要组件的振幅,明b-wave,代表主要去极化激活的双相细胞测量作为一个积极的视网膜潜在的角膜表面(36,48- - - - - -50]。此外,b-wave归因于穆勒双相细胞和神经胶质细胞之间的相互作用(36,37]。在长尾黑颚猴猴,CB1R主要表达在视网膜锥和其他组件,而CB2R只出现在穆勒神经胶质细胞,导致关于神经的神经元和神经胶质的行动之间的互补关系(6]。光致钾增加外和内网状层的细胞,所去极化的光刺激,修改Muller细胞的膜电位从而产生电反应(51]。Muller细胞,通过KCNJ10 (K_红外4.1)通道和钾虹吸多余的钾离子进入玻璃(52,53),控制light-mediated钾增加视网膜细胞外空间(54]。穆勒的去极化细胞有助于ERG b-wave通过钾离子通道的缓冲(35,55,56]。因此,钾离子通道的封锁导致减少的ERG b-wave37]。我们结果显示显著增加的明b-wave振幅CB2R封锁后,支持之前我们提出的模型(6]。CB2R耦合减少营水平和PKA活性(57]。PKA钾离子通道,因此是一个积极的调制器,封锁CB2R通过增加PKA活动将增加K的活动⁺Muller细胞通道,从而增加光b-wave振幅(图8)。也是可能,AM630影响锥途径源于与锥双极细胞的树突联系,这可以部分解释明b-wave振幅的增加只在中间闪光强度值(58]。另一个潜在的解释是,因为CB2R表达上锥(6),AM630可能调制其他non-CB2受体位于锥体光感受器。

适应光的条件下一波测量代表锥函数。刺激的锥光抑制视网膜暗电流通过phototransduction信号,在锥外段见ERG的一波。一波代表的早期部分锥体光感受器的活动(59,60),而后来的部分反映了极性细胞超极化的贡献,近端无长突细胞和神经节细胞(61年- - - - - -63年]。激素刺激的锥可能激活CB1R [5),进而导致了抑制谷氨酸释放突触间隙。因此阻断CB1R将导致谷氨酸释放的增加。增加模拟强光的影响,导致更大的明一波的振幅。阻塞CB2R另一方面有对一波的振幅更大的影响,这可以解释为一个类似的机制,包括额外的钾缓冲Muller细胞(6)(图8(a))。明b-wave导致的其他受体也可以解释AM630如何影响光一波。的确,明b-wave的增加可能会导致很大的变化一波(锥调制的结果),这将是独立于Muller细胞的作用。

4.2。暗条件

一波测量暗条件下代表杆功能。在黑暗的视网膜,封锁CB1R或CB2R暗一波上没有显著的影响。这种零效应可以解释的少量CB1R杆小球在灵长类动物中表达3,5]。相比之下,大量的假定的大麻素受体(GPR55),发现只在棒(64年对暗ERG),有很大的影响(65年]。据报道,AM251可能也是GPR55受体激动剂(66年]。因此,我们也不能排除后的暗b-wave振幅的增加注入AM251可能是因为GPR55活动。然而,CB1R发现大量杆双极细胞(5),结合CB2R Muller细胞(6),可能导致暗b-wave振幅的大幅增加。微分作用CB1R和CB2R之间可能通过离子通道参与的性质来解释。穆勒的钾缓冲作用后细胞的增加导致暗b-wave CB2R封锁。增加钙双极细胞的突触后杆CB1R封锁的结果(见图8(b))。自从CB1R受体激动剂诱导减少钙通道电流的振幅在视网膜双极细胞3),这并不令人惊讶,如下所示,CB1R拮抗剂AM251了相反的效果:主要增加杆双极细胞的活动。

5。结论

这些发现可能有助于开发新的药物靶点治疗视网膜中毒(67年,68年)和疾病(69年]。这些视网膜疾病通常与electroretinographic波的振幅下降。我们这里显示阻止视网膜大麻素受体的药物可以引起ERG的振幅的增加反应概要文件。操纵神经系统可能因此作为治疗恢复正常视力,保护视网膜。

信息披露

莫里斯Ptito是哈兰·山德士的椅子在视觉科学教授。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

约瑟夫Bouskila和凡妮莎Harrar这里给出同样都贡献给了工作,因此应该被视为等价的作者。

确认

加拿大自然科学与工程研究委员会(6362 - 2012年,莫里斯Ptito;RGPAS 478115 - 2015和RGPIN 2015 - 06582,让布沙尔)和加拿大卫生研究院的研究(拖把- 130337,让布沙尔)支持这项工作。约瑟夫Bouskila收到支持从弗雷德里克·班廷和查尔斯从CIHR最佳加拿大博士研究生奖学金奖。班廷博士后奖学金从CIHR被凡妮莎Harrar获得。让布沙尔支持“Chercheur-Boursier高级”从昏聩de说是Quebec-Sante (FRQ-S)。作者要感谢莫里斯·马修,硕士,for his expert technical assistance in handling the monkeys. They are very grateful to the late Dr. Frank Ervin for his judicious advice and to the staff of the Behavioural Science Foundation for their continued support.