文摘

慢性压迫背根神经节(CCD)导致神经性疼痛。我们调查了脊髓GABA在CCD-induced疼痛使用有单边CCD的老鼠。stereological分析表明GABA-immunoreactive神经元的比例总神经元L4/5薄片》在受伤方面减少的早期阶段CCD (post-CCD星期1),然后返回到sham-control水平阶段末(post-CCD星期18)。在早期阶段,老鼠显示增加后爪的机械灵敏度和脊髓受伤的一侧WDR神经元兴奋性,这样的增加抑制了沿着脊骨应用muscimol(-受体激动剂,5 nmol)和巴氯芬(GABA-B受体激动剂,25 nmol),表明减少脊髓gaba ergic抑制有关。在后期阶段,CCD-induced机械敏感性和神经元兴奋性增加回到pre-CCD水平,等恢复反应被沿着脊骨增强应用荷包牡丹碱(-拮抗剂,15 nmol)和CGP52432 (GABA-B拮抗剂,15 nmol),表明恢复脊髓gaba ergic抑制有关。总之,脊髓GABA ergic抑制CCD后的变更,导致随着时间的推移逐渐减少CCD-induced机械过敏症最可能是由于脊髓GABA神经元GABA含量的变化。

1。介绍

神经性疼痛引起的疾病或损伤涉及外周或中枢神经系统自发的灼痛的症状特点,异常性疼痛(nonpainful变得痛苦),和痛觉过敏(痛苦变得越来越痛苦)1]。临床报告表明,超过60%的神经性疼痛患者与脊柱畸形包括脊髓感染和肿瘤,以及脊椎椎结构变化,如脊柱椎间盘突出,脊椎狭窄,椎间孔狭窄(2]。压缩结构变化引起的脊髓神经的脊柱椎导致神经根或腰痛源于背部和辐射到后面的腿和脚3]。此外,约40%的慢性下腰痛患者有神经性疼痛(所示4]。因此,周围神经性疼痛和神经根疼痛可能共享一个共同的潜在机制。

神经根疼痛的鼠模型,开发了慢性压缩的背根神经节(CCD)演示了行为的神经性疼痛的迹象,比如机械触诱发痛,痛觉过敏,增强背根神经节(DRG)神经元的兴奋性(5- - - - - -7]。巨大的冲动,源自DRG神经元向脊髓受伤导致脊髓突触可塑性改变或中枢敏化称为痛觉过敏和异常性疼痛的神经机制。猜测的一个方面潜在的脊髓中枢敏化机制是降低脊髓gaba ergic抑制,或脊髓gaba ergic去抑制,造成的损伤的脊髓gaba ergic抑制。虽然这脊髓gaba ergic去抑制周围神经损伤后神经性疼痛行为曾被研究过,不同的结果报告。观察脊髓GABA神经元的细胞死亡受伤后(8- - - - - -10]。然而,没有发现损伤后脊髓GABA神经元的损失(11- - - - - -13]。此外,增加GABA水平在脊髓背角受伤后被发现14]。

的参与脊髓gaba ergic去抑制在CCD-induced神经性疼痛没有得到充分的研究。CCD损伤模型显示,随着时间的推移逐渐复苏的神经性疼痛行为发生(15]。因此,一种验证脊髓GABA参与CCD模型检查脊髓GABA ergic抑制的变化,这取决于GABA水平和GABA受体的活动,在CCD后早期和后来的阶段。在目前的研究中,我们调查了第一个改变GABA神经元的数量是否与总腰椎脊髓背角神经元CCD后确实存在。第二,我们已经确定药理激活脊髓GABA受体的影响建立机械过敏症在早期阶段,以及抑制脊髓GABA受体的影响在减少过敏后阶段。

2。材料和方法

2.1。动物和CCD的手术

共有83个雄性老鼠(Sprague-Dawley、180 - 200 g、韩国)被用于这项研究和安置在一个动物设施自动控制温度,湿度,光照12小时的周期。实验过程都是根据美国国立卫生研究院和制度执行的动物保健和使用委员会延世大学的医学院。慢性压迫第五腰椎DRG如前所述执行(5]。深麻醉下(安氟醚,感应5%和维护2%混合氧气),背部皮肤和肌肉被雕刻的暴露腰椎第五颈椎椎间孔。压缩背根神经节和L5神经根,消毒不锈钢棒(0.7毫米直径4毫米长度)插入第五椎间孔的空间。受伤后,肌肉组织和皮肤缝合。一个虚假的操作是按照相同的程序执行;然而,不锈钢杆没有插入。手术后的护理进行了食物和水随意。动物被分配成四个组:那些收到CCD损伤()或虚假的操作()18周早些时候和CCD(一个星期)或8周(早)。sham-operated, 1周,18-week post-CCD团体受到GABA-related药物药理反应的研究,在saline-treated控制用于stereological细胞计数和电生理记录。8周post-CCD组包括动物用于stereological细胞计数。所有的实验都是由调查人员蒙蔽动物治疗。

2.2。药物及其应用

药理的影响脊髓GABA受体的激活和抑制机械敏感性和WDR神经元活动检查使用的药物包括-受体激动剂muscimol(英国Tocris Cookson)和拮抗剂(−)荷包牡丹碱methobromide(英国Tocris Cookson)以及GABA-B受体激动剂巴氯芬(σ,圣路易斯,密苏里州,美国)和拮抗剂CGP52432(英国Tocris Cookson)。选择药物和剂量根据先前的研究16- - - - - -18]。所有药物溶解在0.9%盐水和管理使用腰椎穿刺鞘内研究机械敏感性变化通过行为评估;另外,药物也是局部使用的脊髓检查通过电生理评估神经活动的变化。通过腰椎穿刺鞘内管理,26-gauge针连接到汉密尔顿注射器插入到槽之间T13和L1椎骨和仔细先进到椎间空间,与针的角度约为10度。适当的位置的针木材蛛网膜下腔当时确认的入口突然失去抵抗和一个简短的臀部和大腿的肌肉的抽动。每种药物的卷10μL是管理慢慢在30秒内。局部应用,药物(10μL)应用使用汉密尔顿注射器在脊髓表面附近记录电极位于的地方。数据被收集在药物应用后15分钟,这个时间点经验决定是最好的测试期间的药物功效(通常5-50 min)。

2.3。GABA免疫组织化学

深麻醉下(聚氨酯,12.5毫克/公斤,i.p),动物灌注与肝素化transcardially解决方案(50毫米甲次砷酸盐酸和1%焦亚硫酸钠),其次是解决方案b(100毫米甲次砷酸盐酸、2.5%戊二醛和1%焦亚硫酸钠)。脊柱椎板切除术后,解剖了- 5脊髓,紧随其后的是postfixation 2 h在室温下。与脊髓- 5块,横向部分(40μ米厚)是减少使用Vibratome (VT1000M、徕卡、德国)。连续两个部分每15部分收集到24-well板块包含solution-C(50毫米三羟甲基氨基甲烷和1%焦亚硫酸钠液)对GABA和NeuN疣状。总之,自由浮动部分solution-C预处理在49%,50%甲醇,1% H₂O₂15分钟,然后洗solution-C(3×5分钟)和阻塞solution-C 98%和2%正常山羊血清3 h。部分与anti-GABA孵化(AB131 1: 100年,微孔,Billerica,妈,美国)或anti-NeuN (MAB377 1: 400年,微孔,Billerica,妈,美国在阻止溶液16 h在4°C,然后洗solution-D(50毫米三氯化钠和145毫米,3×5分钟)。部分被孵化与生物素化的山羊anti-mouse免疫球蛋白g (1: 200) 1 h。洗后solution-D(3×5分钟),部分被孵化的avidin-biotin过氧化物酶复杂(1:200)1 h和洗solution-D(3×5分钟)。为可视化,部分与民建联孵化基质装备解决方案(表达载体,弗雷德里克,医学博士,美国)包含民建联和0.6% H₂O₂了5分钟,然后紧接着脱水使用80年,90年,100%的酒精和二甲苯。最后,部分是安装在幻灯片和固定permount安装媒体(sp15 - 100甲苯溶液UN1294,费舍尔科学、埃尔帕索,德克萨斯州,美国)掩护下眼镜。

2.4。计算机辅助Stereological分析

GABA的总数,NeuN-immunoreactive (ir)细胞估计的应用部分(9 - 12部分为每个细胞类型)使用计算机辅助Stereological工具箱(CAST),组成一个成像系统(美国纽约奥林巴斯BX-51,梅尔维尔)和软件(网格版本2.3.1.5,奥林巴斯,Albertslund,丹麦)。计数细胞,部分重叠的网格运动在逐步转移到网格交点的步长设在和设在(92×92μm)薄片》这样一个特定的网格交点的位置移动到视野的中心监控。部分当时在100 x油浸客观监控设置计算框架,它的大小是20%的边长的平方的面积步骤和步骤。每个部分的厚度决定之前进行计数,并执行计算光学解剖器通过20μ米深度的计算框架。在细胞进入20内的焦点μ米高度的光学解剖器,只有细胞内部的计算框架+那些摸左边和底部行数帧包含细胞计数。- 5细胞总数的估计进行了使用这个公式:,在那里是估计的细胞总数,计算细胞的数量,ASF取样面积分数(的面积计算帧/采样网格的面积),社保基金是部分抽样(部分采样的数量分析/部分的数量获得染色),和TSF厚度抽样比例(计算框架的厚度/部分)的厚度(19]。

2.5。行为评估

每个老鼠都安置和15分钟在一个透明的压克力盒(8×8×25厘米)在一个金属网,避免环境压力。住宿后,冯·弗雷的六个应用灯丝(日志单元3.61 - -5.46,相当于0.4 - -26.0 g,北海岸医疗、钙、美国)被应用于足底的后爪表面的中心;这些测试测量通过细丝的咬爪子戒断反应,头转动,身体姿势的变化。爪子撤军阈值(佩恩表的编制者)丝应用程序被修改的上下决定测试模式(20.使用公式:,在那里最后的值是冯·弗雷灯丝(日志单元)代表了校正因子(从校准表)代表日志单元之间的平均差异刺激。

2.6。电生理评估

麻醉(氨基甲酸乙酯后,12.5毫克/公斤,i.p),一个管子进行诱导和维持骨骼肌肉放松,另外与气管造口术进行通风。每个老鼠的呼吸是由通风机(CWE Inc .,表现杰出,PA,美国),和有限公司₂水平监测有限公司₂分析仪(CWE Inc .,表现杰出,PA,美国)举行了稳定在3.5% - -4.5%。大鼠的体温维持在大约36 - 37°C的隔热层。椎板切除术在执行T13-L2暴露腰椎扩大,然后老鼠是固定在一个立体框架,与暴露脊髓被矿物油,防止干燥和电动侮辱环境。硬脑膜物质、蛛网膜膜和pia被移除。重新编码的神经活动,宽动态范围(WDR)神经元- 5脊髓背侧角的选择。这种选择的原因是由于脊髓WDR神经元的重要作用众所周知,在疼痛的信号sensory-discriminative组件(21,22]。此外,我们曾观察到,之间存在着相关性脊髓WDR神经元反应和疼痛的行为在脊髓损伤模型(17]。检查神经兴奋性,单个碳filament-filled玻璃微电极(2 - 4 MΩ)插入到背角(深度100 - 600μ背表面以下)使用micropositioner (Narishige、东京、日本)。WDR神经元的特征是决定根据响应模式来刷牙(使用驼毛刷),按(使用大型动脉夹,100克力,nonpainful),和缩放(使用一个小动脉夹,400克力,痛苦)刺激。WDR神经元产生的单脉冲刺激和诱发10秒被放大(大坝- 80,世界精密仪器,萨拉索塔,佛罗里达州,美国),和这些放大信号被美联储一个示波器监测以及数据采集系统(CED 1401 +,剑桥大学电子设计,剑桥,英国)进行数据分析。相同的单脉冲的形状和幅度收集使用窗口鉴别器(美国佛罗里达州萨拉索塔世界精密仪器),和收集到的信号进行分析与上升2软件(版本5.0,剑桥电子设计,剑桥,英国)。冲动的总数每个10年代刺激诱发的用于数据分析。

2.7。统计分析

重复测量的差异从基线治疗后进行了分析使用的弗里德曼重复测量方差分析排名紧随其后Dunnett多重比较的测试。比较两个不同的组,Mann-Whitney rank-sum测试使用了无与伦比的对。为测量治疗前后的比较,魏克森讯号等级测试配对使用。被认为是统计上的显著差异,如果。数据表示为±SE。

3所示。结果

3.1。时间变化的机械灵敏度的后爪CCD

一周后慢性背根神经节(CCD)第五腰椎压缩,爪子撤军阈值(佩恩表的编制者)受伤后的爪子g和显示与pre-CCD值相比明显降低(g;)和sham-operated组(g;)。减少佩恩表的编制者逐渐恢复到pre-CCD或sham-operated组的水平在受伤后14周后(图1,)。侧一侧的后爪在CCD组,没有明显的观测到佩恩表的编制者(数据没有显示)。

3.2。GABA-ir细胞数量的变化在脊髓背角CCD

图2礼物照片GABA-ir和NeuN-ir腰椎背角免疫组织化学。广场区域覆盖薄层的外侧部分》两岸的脊髓,如图2(一个)。1周,8周post-CCD组,GABA-ir细胞侧薄片》出现密度较低比sham-operated和18-week post-CCD组;但是,没有密度差异侧薄片观察四组(图2 (b))。NeuN-ir细胞薄层两侧没有密度差异四组。典型GABA-ir NeuN-ir细胞被认为在每个图片的右下角insets(箭头所示)。

说明GABA-ir stereological计数和NeuN-ir细胞,在连续六次焦平面图像从上到下的析像图所示3(一个)。所示的例子中,解剖器sham-operated组包含5 GABA-ir和9 NeuN-ir细胞,和解剖器1周post-CCD组包含3 GABA-ir和10 NeuN-ir细胞(箭头所示)。stereological计数平均厚度线部分采样(10节每一只老鼠,五大鼠每组)分别为26.7,27.2,27.6和27.3μsham-operated m, 1周,8周,18-week post-CCD组,分别。细胞计数的总数- 5背角薄片》描述的每只动物根据公式估计在材料和方法部分,和四个实验的平均值组织呈现在图3 (b)。GABA-ir细胞总数明显减少(同侧侧)损伤1周(12,,667)和8周(17日,424)post-CCD组,而sham-operated组(28日没有显著差异,763),在侧端在四组。NeuN-positive细胞,然而,总数量没有显著差异。

3.3。影响脊髓GABA受体激活或失活的机械灵敏度

在sham-operated动物(图4(一)),一个鞘内(信息)管理荷包牡丹碱(15 nmol,15 nmol)或CGP52432 (,在30分钟postdrug)减少了佩恩表的编制者最大限度(g和g, resp)。相比之下,predrug控件(g和g,分别地;)以及saline-injected控件(g;;)。佩恩表的编制者持续了150分钟。大鼠与降低佩恩表的编制者在1周后CCD(图4 (b)),muscimol(信息技术。5纳摩,)或巴氯芬(信息技术。,25 nmol,)在30分钟逆转佩恩表的编制者最大限度降低postdrug (g和g, resp)。相比之下,preapplication控件(g和g,分别地;)以及saline-injected控件(g;;)。降级持续了180分钟。在与佩恩表的编制者,老鼠恢复完全pre-CCD CCD(图18周后水平4 (c)),荷包牡丹碱(信息技术。15纳摩,)或CGP52432(信息技术。15纳摩,)产生最大限度的减少在30分钟postdrug佩恩表的编制者(g和g, resp)。相比之下,predrug控件(g和g,分别地;)以及saline-injected控件(g;;)。佩恩表的编制者持续了150分钟。

3.4。激活或失活的影响脊髓GABA受体神经元兴奋性

sham-operated组(数字5(一)和5(b)),局部应用荷包牡丹碱(15 nmol,)显著增加脊髓WDR神经元反应刷牙,紧迫,摁在15分钟postdrug刺激(,,峰值)与predrug控件(,,峰值;)。的应用CGP52432(15纳摩,)也显著增加这样的反应(,,峰值),相比之下,predrug控制(,,峰值;)。这个GABA受体拮抗作用也增强WDR神经元放电活动后。

在老鼠CCD(数据后1周5(c)和5(d))、《世界发展报告》的三个机械刺激的神经反应明显增强predrug条件下(,,峰值premuscimol和,,prebaclofen峰值),相比之下,那些在sham-operated组(指predrug控制数据的值5(一)和5(b);)。这些增强的反应被抑制局部应用muscimol (,,峰值;5 nmol;)和巴氯芬(,,峰值;25 nmol;),分别。《世界发展报告》后神经元放电活动中看到老鼠后1周CCD也抑制了GABA受体的激活。

在大鼠18周后CCD(数字5(e)和5(f))、WDR神经元反应的三个机械刺激回到sham-control水平(指predrug控制数据的值5(一)和5(b)) predrug条件下(,,峰值prebicuculline和,,pre-CGP52432峰值)。这些恢复反应增强了局部应用荷包牡丹碱(,,峰值;15纳摩;)和CGP52432 (,,峰值;15纳摩;),分别。见sham-control集团这GABA受体拮抗作用导致增强后WDR神经元的放电活动。

4所示。讨论

先前的报道表明,压缩引起的第五腰椎DRG神经性疼痛在受伤的一侧的后爪3,23]。此外,我们和其他人已经报道,减少脊髓gaba ergic抑制,或gaba ergic去抑制,导致神经性疼痛,之后直接损害脊髓和周围神经,分别为(17,18,24]。在目前的研究中,我们建议减少脊髓gaba ergic抑制没有神经元的减少导致机械过敏后爪和脊髓神经元兴奋过度在CCD后的早期阶段。

大量研究已经寻求执行的潜在机制CCD-induced DRG神经元和脊髓疼痛的兴奋过度,导致神经性疼痛。例如,异位CCD神经元的自发和诱发活动被激活的炎症介质通过增强蛋白激酶(25,26由protease-activated受体2 (PAR2) [],27,28),钠离子通道,离子通道活动减少(增加29日),由upregulation单核细胞趋化因子受体2 (CCR2)诱导的化学引诱物蛋白1 (MCP-1) [30.),通过激活P2X受体(31日),分别。然而,脊髓gaba ergic抑制解除的含义在CCD-induced神经性疼痛没有得到充分的研究。

在先前的研究中,几个可能的解释的脊髓gaba ergic去抑制周围神经创伤性提出了神经性疼痛。第一种可能性是GABA细胞神经损伤后的损失。创伤性神经冲动引发大规模释放谷氨酸在脊髓背角,紧随其后的是细胞会导致gaba ergic细胞的损失,因此导致减少gaba ergic抑制功能(8- - - - - -10,32,33]。然而,这个假设受到了挑战;定量分析显示,脊髓GABA神经元的数量与周围神经损伤大鼠不同于控制(11- - - - - -13,34]。此外,我们的数据显示,在神经元的总数没有变化- 5腰椎背角薄片》后的CCD,建议没有GABA神经元的减少有CCD的老鼠。第二次提出的解释是合成GABA的减少。周围神经损伤模型的研究报道,谷氨酸脱羧酶的水平- 65 (gad - 65)在周围神经损伤后脊髓背角下降(8,10]。我们的数据,证明GABA神经元的减少比例的总NeuN-ir细胞在早期阶段的薄片》CCD后,同意提议的神经创伤性减少GABA合成、GABA神经元有察觉GABA水平可能被排除在细胞计数。然而,它仍然是进一步研究评价CCD是否会引起这种减少的迦得活动。第三个可能性是降低或减少差别GABA受体的功能通过对这些GABA神经元的亲和力,没有任何损失。支持这个理论,先前的研究已经证明-受体的减少mRNA水平在初级传入终端脊神经结扎损伤后(35)以及GABA-B受体的亲和力降低事务坐骨神经损伤后脊髓背角[36,37]。

然而,没有报道失去脊柱-受体在大鼠没有神经损伤(34]。我们的数据表明,脊髓GABA受体活动CCD后仍然完好无损,因为脊髓GABA受体的失活和激活神经元兴奋性可能会影响机械敏感性和CCD后的早期和晚期阶段。我们的数据还证明密切相关性脊髓GABA含量的时间变化和机械敏感性CCD后,显示一个参与脊髓GABA ergic函数在CCD-induced神经性疼痛。CCD后的早期阶段,沿着脊骨应用GABA受体受体激动剂降低CCD-induced机械过敏,建议减少脊髓GABA ergic抑制。机械敏感性的回归正常水平后在后期阶段,沿着脊骨GABA拮抗剂应用再生机械过敏,建议恢复脊髓GABA ergic抑制。我们假设的可行机制时间变化后脊髓gaba ergic抑制CCD如下。DRG压缩引起的不锈钢棒插入到椎间孔的主要原因是发展机械过敏症的后爪。后的早期阶段CCD、DRG compression-induced增强感官输入触发增加脊髓GABA释放,在兴奋和抑制通常保持平衡。增加脊髓GABA释放可能导致脊髓GABA减少合成GABA神经元,从而降低脊髓GABA ergic抑制,从而产生机械过敏症。在以后的阶段,然而,增加脊髓GABA合成可能发生,脊髓GABA ergic抑制恢复减少CCD-induced机械过敏症。

由于脊髓突触回路,包括抑制我们的知识(主要是gaba ergic / glycinergic)和兴奋性(主要是glutamatergic)中间神经元是有限的,很难解释为什么脊髓gaba ergic神经元容易CCD。门控制理论提出的痛苦(38),输入从疼痛的和低门槛(LT)初级传入纤维收敛到一个背角投射神经元疼痛信号传输到大脑。在这个提案,LT输入激活抑制性中间神经元,产生突触后抑制的投射神经元和突触前抑制LT输入。此外,疼痛的投射神经元的输入是通过一个兴奋性中间神经原disynaptic。虽然投射神经元响应和疼痛的LT输入,LT输入的有效性通常是减少抑制性中间神经元的活动。如果这种抑制作用是破坏,LT投射神经元的输入会导致更强的激励,这已被证明在这个研究。先前的研究显示高发病率的自发的异位放电后生成大型DRG神经元的CCD受伤神经节(39]。这个观察表明,抑制传输比兴奋传播影响CCD后脊髓突触回路,因为过度的异位放电受伤的LT传入的输入。此外,gaba ergic中间神经元数量glycinergic中间神经元,神经元总数的35%和18%的人口,在背角的薄片》(40]。因此,LT传入的CCD-induced异位放电会导致损失比glycinergic抑制gaba ergic抑制。

据报道,恢复腰椎椎间孔空间可以提高机械过敏症和减压的DRG减少compression-induced DRG神经元的减少(41]。因此,可以预计,逐步衰减CCD-induced机械过敏是由于CCD受损神经元的复苏逐渐扩大的椎间孔损伤后经过一段时间。在临床数据,60%的神经性疼痛患者接受手术扩大缩小孔显示衰减的神经性疼痛在一年内(42]。综上所述,受损周围神经的恢复和随后的恢复脊髓gaba ergic抑制至关重要的改善慢性神经性疼痛CCD。

5。结论

CCD调节脊髓gaba ergic抑制功能。CCD后的早期阶段,脊髓GABA ergic抑制减少通过GABA含量GABA神经元的减少,导致机械过敏症的后爪和脊髓神经元兴奋过度。在稍后阶段,GABA ergic抑制水平是通过恢复GABA含量恢复正常,从而减轻这样的机械超敏反应和神经兴奋过度。因此,控制脊髓GABA水平可能是一个有用的工具CCD后治疗神经性疼痛。

突出了

(我)GABA-ir神经元减少神经元总数没有变化在CCD损伤方面在早期阶段,而没有GABA-ir神经元在后期阶段的变化。(2)机械过敏症和脊髓WDR神经元兴奋过度发达CCD受伤的一侧在早期阶段,在后期阶段恢复正常。(3)GABA受体受体激动剂减少CCD-induced机械超敏反应和神经兴奋过度的早期阶段。(iv)GABA受体拮抗剂reinduced机械超敏反应和神经兴奋过度后期阶段。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

月球Chul李了最初的研究数据,回顾的分析数据,并通过了期末论文。Taick唱南看到最初的研究数据,回顾的分析数据,并通过了期末论文。Se荣格荣格原始研究数据,通过了期末论文。年轻的美国Gwak原始研究数据,审核数据的分析,通过了期末论文作者和存档。Joong吸引Leem原始研究数据,回顾了分析的数据和通过了期末论文作者和存档。

承认

这项工作是由干细胞研究中心21世纪的前沿研究项目(SC4140)从科学技术部和国家研究基金会(nrf - 2014 r1a1a4a01004179)韩国。