文摘

神经调质,如血清素(5 -羟色胺、5 -)和去甲肾上腺素,起到至关重要的作用在调节脊髓的运动和感觉功能。之前我们已经表明,大鼠脊髓芳香L-amino酸脱羧酶的活性(AADC)从它的前驱细胞产生5 - (5-hydroxytryptophan 5-HTP)是完整的脊髓横断后显著增加。在这项研究中,我们调查了5 -神经支配的部分损失是否可以同样增加AADC活动。成年大鼠脊髓半切在胸水平(T11 /病人)是用于术后间隔5天或60天。使用免疫组织化学,首先,我们观察到在5-HT-immunoreactive纤维的密度显著降低受伤的一侧脊髓病变以下两组。第二,我们发现AADC细胞也表达了对受伤和受伤两组。第三,增加产量的5 - AADC细胞后5-HTP被认为在5天而不是60天postinjury组。这些结果表明,塑料的5 -系统可能发生的主要变化subchronic阶段和长时间的函数可以由塑料补偿其他内在的变化和/或脊椎上的调制系统。

1。介绍

脊髓损伤(SCI)严重影响患者的日常生活。最重要的和令人沮丧的症状是感官的损失,电机,和/或自主功能(1- - - - - -5]。脊髓损伤可以是完整或不完整的,和不同的症状SCI个人根据创伤的严重程度可能会有所不同。神经可塑性随时间发生在网站上下的损伤,导致病理生理并发症和功能恢复(6,7]。单胺能的系统是一个系统,进行激烈的塑料SCI后脊髓的变化(8- - - - - -16]。哺乳动物脊髓单胺神经递质,例如,血清素(5 -羟色胺、5 -)、多巴胺和去甲肾上腺素,是重要的调节器的感觉和运动功能。一般认为,不仅在脊髓源自不同的脊椎上的大脑区域(17,18]。因此完全科学类,在很大程度上消失但仍然剩余金额(11,19),而在不完整的科学类,在脊髓丢失不同程度取决于损伤的严重程度(20.]。

最近我们的研究小组一直专注于塑料的变化在脊髓血清素激活的系统。使用骶脊髓横断大鼠模型我们发现5-HT2 (a和C)受体是调节反应完成SCI (13,14,16]。更重要的是,我们发现细胞表达芳香L-amino酸脱羧酶(AADC)脊髓,通常不包含类(21),增加他们的活动,可能会产生5 - 5前体,5-hydroxytryptophan (5-HTP) [22]。不完整的SCI后,挫伤或半切术,还有大量的5 -下面的脊髓损伤。例如,一半切除后剩余的5以下病变约为8 - 40%的正常水平3 - 8天后病变根据数据从不同的实验室9,10,23- - - - - -25]。更重要的是一些研究报道逐渐恢复5 -由于神经移植到损伤随时间(9,10,24尽管这不是不断观察[25,26]。问题是这是否从5 - 5生产萌芽纤维从受伤或内在5-HT-producing细胞,如AADC细胞。这个问题是用半切术SCI大鼠模型研究了在目前的研究。我们使用老鼠postinjury时间在5天或60天检查5 -基于事实的表达下降5 -纤维已经退化在横断后5 - 7天14,27从4到8周后),不完整的SCI塑料的重大变化发生在脊髓包括下行皮层和皮层下脊髓纤维(6),在两个时间点AADC细胞显示稳定增加的能力从5-HTP合成5 -22]。

2。材料和方法

2.1。实验动物

所有实验指南之后的欧盟指令2010/63 /欧盟和被丹麦动物实验检查机构批准。努力采取减少动物的数量和他们的痛苦。29岁男性Sprague-Dawley老鼠的初始体重160 - 490 g在行动中被用于这项研究。动物受到要么胸脊髓半切术操作()或骶脊髓横断()。所有的老鼠12/12-hour光/暗周期和能获得食物和水随意。老鼠受到半切术被分成四组,每组大鼠接受不同治疗前灌注(参见下面的更多)。

2.2。脊髓半切术和横断操作

半切术操作之前,老鼠和2.0%异氟烷麻醉气体的混合物的O₂(500 psi)和N₂O (200 psi)。外科领域刮,用酒精清洗和整个操作在无菌条件下进行。0.2毫升镇静剂和局部麻醉(利多卡因12.5毫克/毫升,Marcaine 2.5毫克/毫升)有肌肉。同时,非甾体类抗炎药和术后镇痛药物(Rimadyl 5毫克/公斤)皮下注射。手术显微镜下进行操作。为半切术胸椎骨的椎板切除术是T10-T11水平。硬脑膜被打开了,约1 - 2毫米的脊髓水平T11-T12被一方在不损害背静脉或腹侧动脉。伤口缝合随后关闭了肌肉,筋膜和皮肤分别单丝缝合。一个老鼠受到脊髓横断在第二骶级别(S2)手术过程被描述在其他地方(22];即脊髓组织的一小块在S2级完全移除。手术后,大鼠皮下注射治疗镇痛(Temgesic 0.1毫克/公斤)每8小时48小时。动物的福利控制每天直到实验结束。

最初的28大鼠脊髓半切时间分为两组:16大鼠在术后五天组和12个老鼠在60天术后组。在每次组老鼠进一步分为两个子组进行不同的治疗方法。然而,由于破坏三种动物的福利前5天集团必须安乐死计划时间。因此最后总共有25个老鼠在四组:14老鼠实验中使用组或治疗组(8 5天组和6在60天组,分别地。、表1),受到腹腔内(i.p)注入5-HTP(50毫克/公斤)结合卡比多巴(20毫克/公斤)与少量盐酸酸盐水灌注前30分钟。其他11个老鼠被用作控制动物或未经治疗组(5 5天组和6在60天组,分别地。、表1),没有之前注射任何药物灌注。大鼠的脊髓横切S2级相同的方式对待那些在实验小组。

所有的老鼠都安乐死与戊巴比妥50毫克/毫升和灌注intracardially与200 - 300毫升0.01米磷酸缓冲盐(PBS) 3 - 4分钟,紧随其后的是一个400毫升4%的多聚甲醛0.1磷酸缓冲溶液超过15分钟。整个脊髓被和后缀在原来的固定剂24小时在4°C和cryoprotected PBS为30%蔗糖24小时在4°C。在病变部位切除脊髓手术显微镜下检查。在这项研究中使用的所有大鼠脊髓半切被证明是把一侧T11或病人的水平。脊髓是分为不同的部分和腰椎和骶部位横向切成40μ米的部分。如果脊髓没有48小时后,在0.01 M cryoprotected PBS溶液含15%蔗糖、30%乙二醇,0.05%硫柳汞和存储−20°C。

2.3。5、AADC免疫组织化学

每秒钟从腰椎节(L1-L6)和骶(S1-Ca3)水平处理所有的小鼠5 -和AADC双重免疫荧光染色。部分是在PBS两次冲洗10分钟,在PBS 0.1% Triton x - 100 (PBST)一次10分钟。那部分在PBST preincubated包含2%牛血清白蛋白和5%正常血清驴一个小时。在PBST冲洗10分钟后,部分被孵化在同一个解决方案包含兔子anti-5-HT(1: 10000年,Immunostar)羊anti-AADC (1: 200;Millipore-Chemicon)主要抗体稀释在室温下24小时以上。PBST清洗四次后15分钟每个部分孵化一个小时在驴anti-rabbit Alexa萤石594(1:200年,表达载体),驴anti-sheep Alexa萤石488(1:200年,英杰公司)PBST 1%牛血清白蛋白、血清和正常的驴在室温下2%。在PBS冲洗三次10分钟后每部分安装,干,盖玻片荧光安装介质(Dako)。

2.4。数据分析

荧光显微镜观察脊髓部分(徕卡DM6000B徕卡微系统,位于德国)。所有捕获的图像数字化(徕卡DFC420 C数码相机系统)和处理Adobe Photoshop密室。比较结果与我们之前的研究在大鼠脊髓横切S2级(22)我们只从sacrocaudal水平在这项研究中获得的数据进行了分析。

5-HT-immunoreactive密度的分析(IR)纤维,图片来自5或6脊髓部分。配对图像拍摄成像面积1000μm×750μ米从中间灰质/区和腹侧运动神经元区域两边的所选部分。为了避免偏见的定量数据分析由于各种受伤和受伤的脊柱位置图片取自同一rostrocaudal水平(主要是在S2-S4级别)。5-HT-IR纤维的密度进行了分析与图像J软件(13,14]。首先这样做图像阈值,然后计算上面的面积阈值水平和受伤,受伤的数据比较。AADC细胞的分布和发病率的5-HT-IR AADC细胞在过渡带S1-Ca3进行了分析使用MD-plotting系统(Accustage)一直在前面描述的(22]。所有包含AADC细胞中间的部分区域被绘制。AADC细胞和5-HT-IR AADC细胞与不同的符号绘制。AADC细胞表达细胞的相对数量数量每节的发病率5-HT-IR AADC细胞表达为每个动物AADC细胞百分比。

标准偏差(SD)是用来表示数据平均值的变化。组值表示为平均值±SD。统计分析是Sigmaplot (Systat软件版本11日)。配对以及(或魏克森讯号等级测试如果数据不对称分布)或未配对以及(或Mann-Whitney rank-sum测试如果数据是不对称分布)是用于比较两组之间的数据和设置在显著性水平。

3所示。结果

3.1。身体活动的后腿和尾巴后脊髓半切术

脊髓半切术手术之后会受伤的一侧后肢瘫痪在所有动物。一般来说,老鼠笨拙的表达影响肢体的运动模式5天,7 - 8天运动模式是更多的功能。三周后受影响的肢体,从定性的角度,在运动功能齐全。我们没有得分或量化的痉挛状态。没有尾巴痉挛状态发展为所有老鼠不管受伤。

3.2。5 -神经纤维的密度在不同的动物群体

调查脊髓半切术是否完全删除5 -在同侧神经支配,神经支配是否恢复的密度随着时间的推移,我们比较5-HT-IR纤维和5-HT-IR AADC细胞受伤和受伤一侧的腰和sacrocaudal部分脊髓的治疗和治疗组在5天,受伤后60天。因为我们发现了一个类似的标签模式5-HT-IR纤维和AADC细胞在腰椎和sacrocaudal水平,在本研究中我们主要集中在sacrocaudal一部分为了与我们以前公布的结果完全脊髓横切大鼠(22]。

首先我们分析了5 -纤维在5天,60天组的中间地带。在5天治疗组大鼠5-HT-IR纤维的密度大幅减少受伤的一侧而受伤(图1(一))。进行定量分析时中间区5-HT-IR纤维受伤一侧只有在受伤方面(表的23.42%1)。因此受伤一侧5-HT-IR纤维平均占据分析区域的%,而受伤的一侧5-HT-IR纤维占领%的分析领域。这种差异具有统计学意义(,配对以及)(图1 (e))。在治疗组中,我们观察到增加5-HT-IR纤维受伤和受伤一侧虽然5-HT-IR纤维受伤一侧明显低于未受伤害的一方(数字1 (b)和1 (e))(,配对以及)。因此,面积百分比5-HT-IR纤维受伤的一侧%,高于1.4倍受伤方面治疗组虽然没有达到显著差异(未配对以及)。受伤一侧5-HT-IR纤维密度%,高于1.1倍的治疗组。治疗组中定量5-HT-IR纤维的密度在受伤的一侧是30.0%(1.26/4.2)的受伤,这是1.3倍高于对照组(23.42%)。然而,对于同一边治疗,治疗组之间没有显著差异(未配对以及)(图1 (e))。

受伤后60天5-HT-IR纤维的密度在治疗组显著降低受伤的一面而没有受伤的一面(表1,图1 (c))。5-HT-IR纤维受伤一侧的密度减少到11.11%的受伤。因此受伤的一侧的密度只有5-HT-IR纤维%的平均,而受伤的一面%。差异具有统计学意义(,配对以及)(图1 (e))。治疗组中,受伤的一侧5-HT-IR纤维的密度明显增加(图1 (d)),达到32.59%的受伤一侧虽然密度在受伤方面仍明显高于受伤的一面(,配对以及)(图1 (e))。因此受伤的一侧5-HT-IR纤维的密度%,高于2.2倍受伤方面治疗组,差异具有统计学意义(,Mann-Whitney rank-sum测试)(图1 (e))。受伤一侧5-HT-IR纤维密度%,这似乎比受伤方面治疗组低41%,但差异没有统计学上不同的(未配对以及)(图1 (e))。

因为脊髓运动神经元接受密集的5 -纤维神经支配,调查是否在运动神经元5 -纤维发生类似塑料的变化,我们已经检查了5 -纤维密度不同的动物组用相同的方法。如表所示1和图2,5 -纤维的密度在受伤方面明显低于未受伤害的一方为5天,60天组无论治疗5-HTP和卡比多巴。因此5 -纤维的密度受伤的一侧是持续大约21 - 24%计算的不同群体中受伤的一面。这些密度差异对双方在某种程度上类似于在中间区域(11 - 33%,见上图)在不同的组。然而,令我们吃惊的是,5 -纤维的密度低于治疗组在治疗组为5天,60天组。我们将讨论这些结果进一步讨论。

我们没有试图做个比较5-HT-IR纤维密度5天至60天postinjury组。我们感兴趣的关键问题是,是否5-HT-IR纤维成为5-HTP +卡比多巴后密度在每组中的应用。然而,一般5-HT-IR密度在5天postinjury组高于60天postinjury双方无论位置的灰质和药物的应用。

3.3。AADC细胞的分布在不同实验小组

脊髓半切术是否会影响AADC脊髓细胞的表达我们调查的分布AADC细胞在sacrocaudal受伤和受伤一侧脊髓段在不同的动物群体。正如我们之前所报道的(22]AADC背角细胞被发现,中间区,两侧中央管周围的区域(数据没有显示)。为了方便与我们的脊髓横断实验的结果进行比较(22)定量分析只有在数据上执行的中间地带。

结果表明,在5天,60天的团体AADC细胞表现出相似的分布受伤,受伤一侧不管老鼠是否接受5-HTP和卡比多巴(两次组),表明半切术和药物的应用程序并没有改变的表达AADC细胞受伤(表1)。因此我们决定池中的数据一起治疗组和治疗组。5天组AADC细胞的数量在受伤的一侧的中间地带/节而受伤的一面/部分()。双方之间没有发现显著差异(,配对以及)。同样,在60天集团AADC细胞的数量在受伤的一侧的中间地带/节而受伤的一面/部分()。双方之间没有发现显著差异(,配对以及)。因为我们没有系统地阴谋AADC细胞所有的部分没有试图作出定量的比较AADC细胞之间的5天,60天的团体。

3.4。AADC细胞产生5 -的能力无关的应用5-HTP半切术

因为本研究的主要目的是调查是否AADC细胞增加的能力产生5 - 5-HTP半切术之后,我们已经检查了5表达AADC细胞在两个不同的动物组5-HTP +卡比多巴后的应用程序。5-HT-positive sacrocaudal级别检查AADC细胞治疗和治疗组在5天,60天的老鼠。除了5-HT-positive AADC细胞也检查大鼠的脊髓受到完整的脊髓横断S2水平,结果表明,100%的中间区AADC细胞成为了这只老鼠5-HT-IR(数据没有显示)。

治疗组没有AADC细胞成为5-HT-positive受伤和受伤一侧脊髓的5天,60天的团体。5天治疗组中我们发现一定数量的5-HT-IR AADC细胞在受伤,受伤在7 8例(数字3(一)和3(b))。定量分析表明,% ()AADC细胞成为5-HT-positive受伤的一侧而只% ()AADC细胞成为5-HT-IR受伤的一面。区别是明显不同(、权力= 0.85α= 0.05,配对以及)(图3(c))。60天的治疗组中我们观察到一定数量的5-HT-IR AADC细胞3的6大鼠在受伤的老鼠和2 6在受伤方面(数据3(d)和3(e))。定量分析表明,% ()AADC细胞成为5-HT-IR而受伤% (AADC细胞)在受伤方面成为5-HT-IR。受伤,受伤双方之间的差异没有统计学意义(,魏克森讯号等级测试)(图3(f))。进一步,我们比较两个时间组中的数据处理5-HTP和卡比多巴。结果显示,受伤的一侧的发病率5-HT-IR AADC细胞5天组显著高于60天集团(、权力= 0.59α= 0.05,以及),而在受伤方面差异不显著(、权力= 0.27α= 0.05,以及)。

由于大变化5-HT-IR AADC细胞在不同的药物治疗组,我们猜测这是否与5 -去神经纤维的变化。因此我们的发生率之间的皮尔逊积差相关分析5-HT-IR AADC细胞和5 -纤维的密度不同的药物治疗组,结果显示没有相关性5-HT-IR纤维的密度和5-HT-IR AADC细胞。实际上,5-HT-IR纤维的密度的变化相对较小的在一个特定群体/(表1),这意味着更高的发病率5-HT-IR AADC细胞在某些情况下是由于其他的事实(见讨论)。

4所示。讨论

在目前使用胸一半切除大鼠模型研究我们发现,首先,5-HT-IR神经纤维在中间区和腹侧角运动神经元地区相比大大减少了受伤的一侧为5天,60天组与未受伤害的一方,这种减少动物没有恢复和更长的生存时间;第二,没有显著表达差异的AADC细胞受伤,受伤两次团体;第三,AADC细胞增加了他们能够从其前体合成5 -,5-HTP在5天,但不是在受伤后60天。这些结果表明不同塑料的变化可能发生的脊髓受到部分或完整的损伤。

4.1。塑料部分脊髓损伤后5 -纤维的变化

有很多调查研究塑料5 -纤维的变化与不同的SCI动物模型。5 -纤维的密度在SCI后脊髓不同与许多不同的因素包括,其中,受伤的严重程度,postinjury时间和脊髓的位置。例如,当脊髓完全切断通常只是几5-HT-IR纤维观察以下病变在中间区域和/或腹侧角两个多月后损伤(14,15,28]。挫伤损伤剩余5 -纤维的密度低于损伤取决于沿着背腹侧的轴的位置和损伤的严重程度20.]。半切术5 -纤维的密度在腹侧角被报道在控制范围从8%到30%的值根据不同研究postinjury时间窗口从4到7天9,23,25,26]。海等。10)发现,在背角(薄层i ii),为期3天的半切术在胸水平后,~ 30% 5-HT-IR纤维留在腰椎脊髓。我们5 - 5天动物纤维数据中间区和运动神经元地区一般协议在背角和腹侧角,表明5 -纤维可能会经历类似的退化过程的不同部分灰质。

文学中存在一个明显的差异是否5 -纤维恢复脊髓半切术后随着时间的推移。一些研究报道逐渐增加5-HT-IR纤维侧一侧病变(以下9,10,24),而其他一些没有(例如,25])。例如,Saruhashi et al。9)指出,从第一个星期到四个星期5-HT-IR纤维从20%恢复到75%的正常价值在腹侧角。Camand et al。24和海等。10)也报告了类似的结果虽然过渡带的细微变化和背角,分别。相反,Filli et al。25]报道减少4周从约30%至约10%的第四天。我们的结果非常类似于Filli et al。”年代,60天5-HT-IR纤维在中间区域的密度在5天从11%减少到23%。运动神经元地区尽管价值没有降低很多(23%比22%),它既不增加。可能有几个原因可以解释这种差异。首先,不同位置的脊髓灰质可能经历不同塑料的变化5神经支配。在我们的研究中5 -纤维密度同侧的运动神经元地区过渡带下降超过60天,这可能表明,中间带由5 -轴突再生的影响较小。第二,在受伤后5天5 -纤维可能不降至最低水平。可能需要2 - 3周的退化5 -纤维完全消失(14]。在这种情况下,神经移植需要一段时间才能达到一定的水平。因此需要更多的实验小组,窄的时间间隔。第三,它可能是更多的逻辑比较受伤的数据与正常控制动物而不是受伤,因为半切术也可以影响5 -纤维密度在受伤方面考虑跨越5 -纤维的存在。此外,不同的损伤程度,轻微损伤的变化,不同的分析方法也可能导致不同的5 -密度输出。以任何方式,还需要进一步的研究来找出哪些因素(s)(是)参与导致这种差异。

我们发现5-HT-IR纤维在中间区域的密度增加了双方在5天组和受伤的一侧在结合5-HTP和卡比多巴注射后60天的集团,而密度降低了运动神经元地区双方两次组。很容易理解由于增加可用性的增加5 - 5 -纤维的前兆。然而,令人眼花缭乱,与添加5-HTP 5 -纤维密度降低。一个可能的解释可能是5 -纤维的贡献从AADC细胞非常有限可能由于他们可怜的树枝状纤维。在这种情况下,我们看到的只是结果代表运动神经元地区大约5-HTP之前那些应用程序。

4.2。可塑性SCI后AADC细胞

类似于我们的研究使用完整的脊髓横断大鼠模型(22)我们没有观察到AADC细胞表达的变化对受伤的一面。这个结果不同于李et al。(29日)观察AADC细胞只表达中央管周围的地区,只有脊髓横断后他们开始出现在中间地带。因此我们组的结果表明AADC细胞的数量没有增加对SCI虽然不能排除AADC塑料分子水平的变化。

本研究的主要目的之一是检查是否AADC细胞增加的能力产生5 -从它的前身5-HTP。据报道从我们和班尼特的研究小组,在完整的脊髓横断脊髓AADC细胞提高疗效,促进5-HTP [22,29日]。在目前的研究中我们发现增加酶的能力在脊髓受伤一侧AADC细胞5天,但令我们吃惊的是,不是在60天虽然不是结论性的结果由于低60天的统计力量组。因此我们观察到一个不同的AADC活动响应完成脊髓横断和半切术。在5日内完成脊髓横断或半切术AADC细胞显著增加其能够使用5 -前体合成5 - ([22];本研究)。这种快速反应的AADC脊髓细胞可能是应对突然的脊椎上的损失5神经支配,因此通过失活细胞AADC 5-HT1B受体被激活(22]。脊髓半切术后脊髓和脊椎上的可塑性发生最终将帮助重建脊髓的解剖和功能电路。除了降5 -途径其他下行通路,如皮质脊髓的、红核脊髓的,和reticulospinal通路,也可能对脊髓AADC细胞有抑制作用。大量的证据表明,广泛的可塑性发生通常2 - 3周后受伤的(回顾Nardone et al。30.])。事实上,技术使用微量透析可把时程延长Gerin et al。31日]发现5 -释放的腰腹侧角显示大约增加200%在18天相对于subhemisection后第八天。同时塑料改变许多其他途径,包括脊柱内的下行通道,可能重组和重建功能电路在脊髓6,32]。所有上述因素可能导致重建的抑制网络AADC一半切除后细胞在慢性阶段。在脊髓横断这些下行通路,包括5 -通路,不会恢复以下病变;因此AADC细胞在慢性阶段将继续活跃。

4.3。塑料的意义的变化在脊髓AADC系统

5是一种重要的神经调质运动和感觉功能在脊髓11,30.]。大量研究表明运动可以恢复活动后5 -或其前体5-HT-producing细胞的应用程序或移植在脊髓横断后脊髓(30.,33- - - - - -36]。因此它是非常重要的,在SCI在脊髓有来源,可以生产5 -。完整的脊髓横断研究的证据表明,AADC细胞的活动增加subchronic和慢性阶段和5从这些细胞可以诱导产生运动神经元兴奋性增加,因此肌肉痉挛。我们目前的研究结果表明,半切术一个塑料发生变化后AADC subchronic阶段的细胞,他们可以增加他们潜在的能力提供5 -如果它的前身是可用的。尽管AADC细胞活性不显著增加细胞在慢性阶段可能有助于保持重建脊柱网络对脊髓的功能恢复至关重要在以后的阶段。在协议与其他研究(例如,[9,25]),我们观察到的身体部位的运动功能恢复随时间低于半切术在60天的老鼠没有给任何外部干预。它值得进一步调查,多少AADC细胞造成这一功能恢复。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

我们感谢莉莲Karlsson Grøndahl和布丽塔一起创造他们的技术援助。这个项目得到了Lundbeck公司基础上,它是一家丹麦多发性硬化的基础,丹麦医学研究委员会。