文摘

我们的先前的研究表明,活性氧(ROS)拾荒者通过脊髓机制对神经性疼痛镇痛效果的老鼠。过氧化物的研究表明脊髓是持续性痛的重要介质之一。来测试假设superoxide-derived中间体的增加导致中枢敏感化和疼痛,鞘内注射的效果的化学ROS捐助者释放,(即H₂O₂检查在痛苦的行为。治疗后t-BOOH (捐赠),机械刺激的背角神经元反应在正常大鼠和神经元兴奋性的变化进行了探讨胶状质(SG)的神经元使用全细胞片夹紧录音。囊内的管理t-BOOH或NaOCl (捐赠),但不是H₂O₂,大大降低了机械阈值后的爪子。宽动态范围神经元对机械刺激的反应增加在本地应用程序t-BOOH。的t-BOOH增加兴奋性突触后电位的频率和振幅,在SG神经元去极化的膜电位,增加了由去极化电流脉冲引发动作电位的频率。这些结果表明,ROS升高,特别是在脊髓致敏背角神经元和正常大鼠痛觉过敏。

1。介绍

活性氧(ROS)生成的正常细胞代谢和提供正常的生理和病理生理功能1,2]。ROS的许多类型包括超氧化物自由基()、羟基自由基()、过氧化氢(H₂O₂)、一氧化氮(NO)和过氧亚硝基2,3]。活性氧的主要来源在中枢神经系统中电子传递链内的线粒体膜产生三磷酸腺苷。泄漏的电子在电子传递生产超氧化物阴离子(),将在过渡金属的存在,如自由铁。活性氧的生产过剩导致脂质过氧化,蛋白质氧化、核酸氧化(4]。

活性氧与各种疾病的发病机制,包括类风湿性关节炎,哮喘,炎症性肠病、动脉粥样硬化和阿尔茨海默病。先前的研究表明,ROS批判性地参与各种疼痛,包括神经性和炎性疼痛。ROS拾荒者,如超氧化物歧化酶模拟(5),N -苯t-butylnitrone [6,7]5 5-dimethyl-1-pyrroline-N-oxide [6],和维生素E [8)减少痛觉过敏的行为在一些痛苦的大鼠模型。ROS在神经性的主要行动网站6,8]和capsaicin-induced疼痛[7,9是脊髓。周围神经损伤也增加了活性氧的产量在持续的脊髓疼痛(10]。这些发现表明,活性氧在脊髓严重参与神经性和炎性疼痛。此外,我们先前的研究已经表明,增加产量的主要活性氧,,从脊髓背角神经元的线粒体介导敏化,从而持续疼痛(7,11]。简而言之,食腐动物减少持续疼痛,背角神经元兴奋过度(7),和脊柱长期势差11]。水平的线粒体歧化酶中枢敏化水平,进而决定了痛觉过敏(12]。而人们普遍认为没有跨膜扩散(13),目前尚不清楚如何在线粒体形成扩散到细胞质和调节脊髓神经元可塑性和疼痛。线粒体是迅速转换成膜渗透过氧化氢(H₂O₂),超氧化物歧化酶,细胞内扩散,顺序,可以转换为高活性氧化剂,如哦^•和次氯酸盐()[14]。在这里,我们假设增加superoxide-derived中间体在脊髓背角神经元导致中枢敏感化和痛觉过敏。

在目前的研究中,我们审查如果人工增加可能过氧化物中间体-,,——在正常大鼠脊髓背角产生疼痛行为。进一步探索的作用在痛苦中,我们使用在活的有机体内细胞外记录检查叔丁基氢过氧化物(t-BOOH,捐赠者)增加宽动态范围(WDR)神经元的兴奋性脊髓背角,我们使用在体外细胞内记录检查t-BOOH产生膜兴奋性的变化在胶状质(SG)的神经元在脊髓切片准备。

2。材料和方法

2.1。实验动物

我们使用男性Sprague-Dawley老鼠(哈伦Sprague-Dawley有限公司休斯顿,德克萨斯州,美国)的实验。老鼠们被安置在12/12-hour逆转(暗周期,每个周期早上8:00下午8点之前)至少1周的实验。所有实验进行了按照全国卫生研究所的指导的护理和使用实验动物,和动物使用批准的协议是德克萨斯大学医学分支机构动物保健和使用委员会。

2.2。行为测试

2.2.1。鞘内导管插入术

鞘内导管植入了腰椎扩大如前所述[6,8]。短暂,成年大鼠(200 - 350 g)与异氟烷麻醉维护感应(3%和2%)的氧气,然后后正中切口是由T11 L1椎。后关节突和病人椎板被一对咬骨钳暴露脊髓脑膜。小尼克是硬脑膜,和准备导管(消毒油管充满生理盐水;PE10 Becton Dickinson)插入鞘内空间。导管轻轻引导尾直到提示达到的水平脊髓腰增大(约1厘米尾最初插入点)。油管的其余部分是与PE50油管和美联储皮下midthoracic水平与锚的肌肉在多个网站为了使尖背中线位置。外面的油管密封,关闭切口。从麻醉完全康复后,老鼠回到笼子里,单独住了1星期。导管冲了10μL无菌生理盐水3天后导管保持开放。这个实验排除大鼠后爪的拖或导管插入后7天体重的5%的损失。鞘内导管的位置检查后动物安乐死的实验。

2.2.2。鞘内ROS捐助者的应用

要么t-BOOH或NaOCl(从σ化学公司,圣路易斯,密苏里州,美国)通过鞘内注射导管2 - 3分钟,而动物是有意识的腰动脉导管插入术后至少1周。的捐赠t-BOOH管理在11日,28岁或55μ摩尔体积的15μl .次氯酸盐捐赠NaOCl注入在134年μ摩尔在15μl .控制老鼠服用15μL无菌0.9%生理盐水。此外,H₂O₂直接注入L5和16种椎骨之间的椎间空间光异氟烷麻醉在15日,44岁,74年,还是148年μ摩尔在50μl

2.2.3。行为测试机械阈值

行为进行了测试测量脚机械阈值50%机械刺激反应应用于两个后爪左派和右派在盲目的情况下。我们记录了机械阈值的爪子是刺激更敏感。进行测试,每个动物都放置在一个塑料箱(8.5×8.5×28厘米)放在一个筛网,和机械刺激足底表面的后爪与冯·弗雷单丝。上下阈值确定的方法(15]使用·冯·弗雷单丝4.10,4.31,4.52,4.74,4.92,5.16(相当于1.26,2.04,3.31,5.50,8.32,和14.45 g,职责)。冯·弗雷细丝是垂直地应用于足底作用最敏感区域的近端部分和第二,第三或第四趾与足够的力量2到3 s的灯丝轻微弯曲。突然收回脚在刺激或刺激去除后立即算作一个积极的回应。第一个刺激总是发起4.74丝。如果有一个积极的回应,next-lower-strength丝使用,如果没有,next-higher-strength大小灯丝应用。这个测试模式一直持续到我们有记录反应6·冯·弗雷刺激计数(即第一个变化的反应。,a positive response to a stimulus after a negative response to the first stimulus or a negative response to a stimulus after a positive response to the first stimulus). The responses were then converted into a 50% threshold value using the formula,在那里最后的值是冯·弗雷灯丝使用对数单位,是积极/消极的表值响应,然后呢是刺激之间的平均差在对数单位(0.22)16]。当积极或消极的反应仍然是观察到的刺激会话,3.54或5.27的值被分配,分别通过假设值的±0.5在这些情况下。行为数据绘制使用线性范围以及克·冯·弗雷值。

2.3。细胞外记录的世界发展报告》在脊髓神经元

成年大鼠(200 - 350 g)与聚氨酯的腹腔内注射麻醉(1.5 g / kg)。气管插管提供畅通无阻的通风,和一根导管插入左颈外静脉。进行椎板切除术在T13-L2椎暴露脊髓水平。老鼠被放置在一个立体定位器,脊髓沐浴在温暖的矿物油。核心体温维持在37°C控制加热毯。动物是瘫痪的初始剂量静脉丸泮库溴铵(1毫克/公斤)和通风人为维持end-tidal有限公司₂在4.5%和3.5之间。双水平持续静脉注射是由(0.4 -0.6毫克/公斤/小时)。

一个细胞外记录是为在背角WDR神经元。这些神经元对无害的和有害的机械刺激。细胞被搜索的L4和L5段脊髓使用一个低阻抗的(0.4 - -0.8 MΩ)碳丝电极(阳离子科学、明尼阿波利斯,美国)安装在电子显微操纵器。刷刺激被用来寻找背角神经元。WDR神经元与接受领域位于足底侧表面后爪记录细胞外地。录音是只对单一神经元的峰值振幅可以很容易地歧视与其他神经元的高度(至少两次)。电生理活动是放大,显示在一个示波器,传输到数据分析系统(美国PC CED 1401) Spike2软件。在整个实验过程中,峰值大小和配置不断监控使用Spike2软件确认数据是被收购来自同一个WDR神经元,神经元的记录电极的关系保持不变。

WDR神经元的感受野后证实,分级机械刺激应用:软笔刷,nonnoxious(1或2 g)·冯·弗雷细丝和有毒(20 g)·冯·弗雷灯丝。所有刺激都是每秒一次的速度申请10的10年代间隔刺激。后台活动记录政府之前的三倍t-BOOH。10毫升的t-BOOH解决方案(1或10μ摩尔)是应用于一个小棉球在脊髓上的电极。棉花球一直在脊髓中的应用t-BOOH直到实验结束。WDR神经元的放电记录每30分钟后管理t-BOOH。机械刺激的反应会算作放电期间每秒10年代的刺激,和三个独立的数量为每个动物了。

2.4。膜片箝SG脊髓神经元的录音

2.4.1。脊髓切片制备

Sprague-Dawley老鼠(14到20天,30-55 g)与氨基甲酸乙酯麻醉(1.5 g / kg,腹腔内),和腰骶椎板切除术。腰椎脊髓迅速解剖和浸在冰冷的人工脑脊液(ACSF)。硬脑膜和蛛网膜膜和腹侧/在腰椎脊髓背根被移除。脊髓是安装在一个752 Vibroslicer(登仪器,莱斯特,英国),切成300μ米厚的横向切片。ACSF片被孵化,饱和5%的股份有限公司₂在氧气32°C 1 h,转移到一个记录室,与充气ACSF灌注持续3 - 4毫升/分钟的速度。的离子成分ACSF 117毫米氯化钠,氯化钾3.6毫米、1.2毫米不₂阿宝₄,1.2毫米MgCl₂,2.5毫米CaCl₂11毫米和25毫米NaHCO的葡萄糖₃(pH值7.4)。铂金网格被放在片的顶部,防止切运动。

2.4.2。膜片箝记录

用膜片钳全细胞记录技术进行SG腰椎脊髓的神经元。贴片电极是由硼硅玻璃毛细血管(直径1.5毫米和0.25毫米壁厚)拉在一个p - 80微量吸液管拉出器(萨特仪器,诺瓦托、钙、美国)。当一个电极充满了内部解决方案,贴片电极的电阻是6 - 8 MΩ。150毫米的内部解决方案是由葡萄糖酸钾、氯化钾5毫米,0.1毫米glycol-bis乙烯(β-aminoethylether) - N, N, N′, N′-tetraacetic酸(EGTA), 10毫米N-2-hydroxyethylpiperazine-N′2-ethanesulfonic酸(玫瑰),和5毫米MgATP (pH值7.25)。录音是由神经元在SG,可见作为一种独特的半透明的乐队在显微镜下在背角(BX51WI、奥林巴斯、东京、日本)。Current-clamp录音都是使用一个Axopatch 200 b放大器(轴突仪器,福斯特城、钙、美国)。使用低通滤波器过滤后2 KHz,数据获得使用Digidata 1322接口和pClamp软件(版本9.0,轴突仪器)进行后续分析。所有记录都是在室温(20 - 25°C)。

超过1 GΩ成立后,全细胞访问与负压通过破坏细胞膜。静息膜电位测量5 - 10分钟后全细胞配置。只有神经元静息膜电位更负比−50 mV。兴奋性突触后电位(EPSPs)进行了分析与迷你分析程序(6.0版本,Synaptosoft迪凯特,乔治亚州,美国)。EPSPs的频率是由设置一个检测阈值水平(1.0 - -2.0 mV)。SG神经元的兴奋性量化是通过检查的动作电位(峰值/秒)诱发响应电流25 pA或50 pA (1 s时间adapting-firing神经元(机器人)和3 s持续时间tonic-firing神经元(tfn))从持有−60 mV的潜力。t-BOOH ACSF是由重力灌流系统应用于灌注浴(阿拉巴马州BPS-4科学仪器,韦斯特伯里,纽约,美国)。

2.5。统计分析

综述了数据的平均值和标准错误的意思和分析使用统计程序SigmaStat(3.1版本,Systat软件、圣何塞、钙、美国)。统计学意义()确定使用的学生以及一个或双向重复测量方差分析有一个重复的因素之后,邓肯测试。

3所示。结果

3.1。囊内的t-BOOH NaOCl产生短暂的痛苦的行为

囊内的管理t-BOOH(11或28μ摩尔在15μL)减少机械阈值剂量依赖性的方式(图1(一))。机械阈值开始下降后10分钟28的管理μ摩尔的t-BOOH,达到最低的点(冯·弗雷规模)在25分钟,并且恢复到基线水平在55分钟。机械阈值后的11μ摩尔的t-BOOH降至在注射后15分钟。因为,在初步研究中,鞘内55μ摩尔的t-BOOH引起剧烈疼痛行为如身体扭曲,发出后管理、剂量没有进一步的测试。5.5μ摩尔剂量的t-BOOH不影响机械阈值(数据未显示)。

鞘内管理134μ摩尔NaOCl显著降低机械阈值之间的政府(图后25分钟和65分钟1(一))。在121μ摩尔,NaOCl显著降低40分钟之间的机械阈值()和50分钟()。100年μ摩尔的NaOCl没有痛觉过敏的效果(数据未显示),表明NaOCl诱发痛觉过敏在狭窄的剂量范围。

机械阈值与观察到t-BOOH 28岁μ摩尔或NaOCl报134μ摩尔明显低于观察生理盐水在30分钟后管理(图1 (b))。管理的盐水机械阈值没有影响。领域的最敏感的爪子·冯·弗雷细丝的基地和近端部分第三和第四位。

鞘内H管理局₂O₂44岁的15岁或74年μ摩尔并不影响机械阈值,直到90分钟后管理。因为148μ摩尔H₂O₂产生严重的副作用和死亡,剂量超过148μ摩尔没有测试。

由于鞘内注射H₂O₂未能产生疼痛的行为在正常大鼠和因为我们最近的研究表明,NaOCl SG神经元的兴奋性增加(17),以下实验关注的影响捐赠t-BOOH神经元兴奋性。

3.2。t-BOOH增加脊髓背角神经元的响应能力

脊髓背角神经元对各种机械的刺激反应良好,包括皮肤的抚摸刷和重复的应用·冯·弗雷细丝与弱(1和2 g)和强(20 g)弯曲力(图2)。囊内的t-BOOH电极应用于一个棉花球,和棉花球一直到实验结束。在的应用t-BOOH剂量的1μ摩尔在10μL脊髓背表面,七WDR神经元的放电率在刷牙和冯·弗雷丝开始增加/分钟。排放达到峰值分钟后,政府和回到基线水平附近分钟后管理(图2(一个))。在的应用t-BOOH剂量的10μ摩尔在10μL到脊髓,《世界发展报告》神经元的放电率在刷牙和冯·弗雷丝开始显著增加30分钟。同时,突然出现从其他WDR神经元放电。因此,10μ摩尔剂量的t随后-BOOH没有使用。图2 (b)显示了应用程序后的放电率为1μ摩尔的t-BOOH。治疗后的洪峰流量率t从基线-BOOH增加了约180%(183%刷牙,180% 1 g, 185%为2 g, 171%, 20 g)。

3.3。t-BOOH SG神经元的兴奋性增加脊髓切片

因为SG的主要终止网站无髓鞘的传入纤维,在疼痛机制中起着重要的作用18),我们获得的全细胞膜片箝记录是否进行调查t-BOOH可能会改变在脊髓切片SG神经元的兴奋性。只有SG神经元静息膜电位更负比−50 mV检查。−静止膜电位mV ()。当细胞−60 mV,举行的应用t-BOOH 7分钟诱导(2毫米)mV去极化,维持冲刷后约30分钟,然后恢复到基线(图3(一个))。SG神经元的自发EPSPs的测量基线(控制)是记录至少10分钟后在ACSF全细胞记录配置,样本和过冷t-BOOH (ACSF解决方案2毫米)7分钟,然后洗15分钟。过冷的t-BOOH显著增加EPSP频率(与赫兹,)和振幅(与mV,)(基线(图)3)。这些数据表明,羟基自由基水平的增加SG神经元兴奋性传播的影响了突触前和突触后机制的老鼠。

基于动作电位(AP)放电模式向细胞注入电流引起,SG神经元被归类为(我)机器人,动作电位的频率的下降在膜去极化;(2)tfn的,重复的动作电位持续期间膜去极化;和(3)delayed-firing神经元(DFN) delayed-firing发作,正如前面观察到(19- - - - - -21]。在初步研究确定的阈值电流生成SG神经元的动作电位,我们刺激神经元去极化脉冲使用2 50 pA的增量2 pA。动作电位是由电流脉冲爸和爸爸在机器人()和tfn的(),分别(数据没有显示)。没有统计上的显著差异阈值电流的美联社一代机器人和tfn的之间。因此,我们使用了两个电流,25 - 50 pA,比较多的动作电位之前和之后的应用t-BOOH。输入电阻是MΩ()。在机器人(),应用程序后的动作电位的数量t-BOOH没有不同于之前的数量t-BOOH治疗(图4(一)和4 (c))。相比之下,治疗后t-BOOH tfn的()在动作电位的频率显著增加/秒,/ s和/秒,/ s 25 - 50 pA的电流脉冲,分别为(数字4 (b)和4 (d)),这表明t-BOOH tfn的但不是机器人的兴奋性增加。

4所示。讨论

本研究表明,鞘内ROS捐助者t-BOOH(一个哦^•捐赠者)和NaOCl(一个捐赠),但不是H₂O₂诱导后爪的机械痛觉过敏在老鼠的剂量依赖性的方式。增加WDR神经元对机械刺激的反应也看到后应用t-BOOH脊髓。在脊髓背角神经元,全细胞膜片箝记录应用程序的t-BOOH去偏光膜电位和动作电位的频率增加诱发的注入电流。这些结果表明,增加超氧化物中间体和使敏感背角神经元,从而产生痛觉过敏在正常大鼠。

ROS发挥重要作用在正常生理功能和各种病理条件2]。ROS的许多类型包括,H₂O₂,,不,和过氧亚硝基2,3]。这些活性氧与病理条件,包括疼痛。最近,许多ROS拾荒者已被证明诱发神经性和炎性疼痛镇痛效果。在几个大鼠模型的疼痛,tirilazad [22),超氧化物歧化酶模拟(5),phenyl-N -叔-butylnitrone [6,7]5 5-dimethyl-1-pyrroline-N-oxide [6],和维生素E [8)降低痛觉过敏的行为,主要是通过脊髓上的行动(6,8]。这些发现表明,自由基在脊髓严重参与神经性和炎性疼痛。然而,目前还不清楚哪种类型的脊髓中ROS的关键生产痛苦的行为。

超氧化物自由基(),一个主细胞内ROS形成,促进生产反应H₂O₂与细胞内铁(即。芬顿反应)。t-BOOH,捐赠的已被广泛应用于氧化应激实验,因为它很容易穿透细胞膜,分解产生ROS作为一个简单的化学反应,并进一步分解为通过增加的自由铁水平细胞(23- - - - - -25]。t-BOOH诱发脊髓长期势差在表面的线片,这个长期势差是20 - 30分钟后维护t-BOOH冲毁,暗示的参与(11]。t-BOOH减少抑制性突触后电流的频率(万能)而不影响万能的振幅26]。痛觉过敏的发展和增强灵敏度治疗后脊髓WDR神经元t-BOOH在我们的研究可能是由于减少抑制性神经传递源于增加在脊髓。

NaOCl,用作供体的次氯酸盐在这项研究中,水解,次氯酸(HOCl)解决方案。HOCl可以自然产生氯离子和H₂O₂在髓过氧物酶的存在。小神经胶质细胞,单核细胞/巨噬细胞和中性粒细胞是髓过氧物酶的主要来源(27- - - - - -29日),HOCl可以产生的神经组织。HOCl穿过等离子体膜,能灭活细胞内酶,抑制线粒体呼吸,迅速氧化细胞内谷胱甘肽(30.- - - - - -33]。此外,HOCl可以与各种官能团反应,如硫醇、硫醚、氨基酸和血红素组34,35]。它还可以生成高活性汗衫和羟基自由基与H₂O₂和(36,37]。此外,HOCl可以与亚硝酸反应,一氧化氮的主要成品,形成高活性硝基氯(38]。先前的研究表明,次氯酸盐()激活钙流入和膜电流通过中介的TRPA1(瞬时受体电位阳离子A1)通道,导致疼痛的行为(39]。在目前的研究中,鞘内注射的NaOCl后爪的机械阈值下降。因此,感应鞘内NaOCl可能引起的痛觉过敏的感觉神经元的激活脊髓背角或NaOCl转化为活性自由基,如。

在我们的在活的有机体内细胞外记录,在脊髓背角WDR神经元的诱发反应被大大增强了t-BOOH治疗,最终回到基线水平的反应。全细胞膜片箝记录显示,治疗t-BOOH脊髓背角神经元的兴奋性增强,神经元的膜电位去极化的SG,增加EPSPs的振幅和频率。EPSP SG神经元的变化开始后2 - 3分钟内的应用t-BOOH,保持30分钟后冲洗。这些发现表明,活性氧增加,特别是在脊髓严重导致中枢敏化通过调制的兴奋性神经传递。

的功能角色H₂O₂研究了在不同的大脑区域。在大脑中,H₂O₂影响神经元兴奋性调节突触传递和各种离子通道的激活。H₂O₂在丘脑神经元诱发兴奋过度兴奋和抑制性突触(通过改变之间的平衡40]。它还产生兴奋过度通过激活n -甲基- d受体(41),通过增加细胞外谷氨酸(42,43)在海马和皮层神经元。此外,H₂O₂介质中诱导膜去极化,提高兴奋性棘神经元通过瞬时受体电位通道的激活44]。相比之下,很少有研究调查了H的角色₂O₂在脊髓背角神经元痛觉过敏的发展。一项研究表明,当注入的足底表面后小鼠爪子,H₂O₂诱导剂量依赖性的方式热或机械痛觉过敏(45]。在另一项研究中,高桥et al。46)报道,H₂O₂增加gaba ergic微型抑制性突触后电流的频率在SG神经元,从而导致antihyperalgesia。在目前的研究中,脊髓注射H₂O₂未能诱发痛觉过敏或痛苦的行为。总的来说,这些发现表明,H₂O₂在脊髓背角神经元可能不会直接参与代的痛觉过敏。

SG记录神经元被归类为机器人或tfn的,基于其内在由细胞内电流所引起的发射特性注入(19,20.]。机器人产生短脉冲的峰值的去极化和他们中的大多数是生理上归类为疼痛的神经元。tfn的展览重复峰值发射和小适应在持续去极化和多数都是宽动态范围(报告)或疼痛的神经细胞(20.]。过冷的t-BOOH tfn的发射频率的增加而不是机器人在我们的研究中,表明t-BOOH治疗世界发展报告》或疼痛的神经元的兴奋性增加。结合我们的数据在活的有机体内细胞外记录表明鞘内管理t-BOOH WDR神经元兴奋性增强,引起在正常大鼠,研究结果表明,活性氧,特别是,产生痛觉过敏作用于tfn的或其他WDR神经元。

5。结论

鞘内政府ROS的捐赠人t-BOOH和NaOCl显著减少疼痛的机械阈值行为和增加在脊髓背角WDR神经元的反应在正常大鼠机械刺激。t-BOOH也增加了SG的膜兴奋性神经元在脊髓切片。我们的发现表明活性氧,特别是发挥重要作用的发展疼痛和脊髓中枢敏化的过程。减少活性氧的水平在脊髓可能因此成为一个有效的方法来治疗疼痛。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

昭熙年轻的金和Inhyung李同样对本文亦有贡献。

确认

这项工作是由国家卫生研究院授予R01 NS031680拨款2014 r1a2a1a11053104和2012 r1a5a2a42671316从韩国国家研究基金会。作者感谢科学出版物学系MD安德森癌症中心的编辑服务和英语服务。