文摘

许旺细胞移植(SC)表现出巨大的潜力为脊髓损伤(SCI)维修和使用它作为一个治疗方法已经发展为亚急性和慢性人类科学的临床试验。尽管SC植入提供一个接受环境支持轴突再生和功能恢复的实验SCI模型、轴突再生主要局限于本地系统和行为改进温和没有额外的组合方法。在当前的研究中,我们调查是否并发的聚胺腐胺,开始30分钟或1周SCI后,可以提高SCs的功效,当植入亚急性(伤后1周)到大鼠脊髓撞伤。多胺是无处不在的有机阳离子扮演重要的角色在细胞周期的调控,细胞分裂,细胞骨架组织和细胞分化。我们与SCs表明,腐胺的结合提供了一个显著增加植入物尺寸,轴突(感官和羟色胺)的增强节约和/或增长,和改进的开放领域SCI后运动,相比SC单独植入。这些研究结果表明,聚胺补充可以增强SCs使用时的有效性为亚急性SCI修复治疗方法。

1。介绍

到目前为止没有治疗能彻底扭转临床结果与脊髓损伤(SCI)有关。组织损伤SCI后发生在两个阶段:首先是主要的机械损伤本身,而第二个是进步的,调解在SCI后数天到数周不等的由多种细胞毒性因素损伤环境中。宿主细胞努力限制进步组织损伤,包括胶质反应活性,细胞外基质沉积,病变部位和疤痕形成,随后引起轴突再生和内生非许可的环境恢复功能(1]。这个外在neurorepair拮抗作用加剧了减少成人中枢神经元的内在增长能力(2]。发现新疗法战斗二次伤害,病变部位克服阻碍增长的环境,和/或增强神经元再生的内在能力对于SCI后恢复功能是必需的。策略结合细胞与药理、分子或生物材料的方法显示最承诺在克服这些障碍达到有意义的解剖和功能修复(3]。

一个鼓励辅助战略跨越的growth-inhibitory环境损伤和刺激内在再生的海拔环腺苷酸(环腺苷酸),第二信使分子(4]。持续提升环腺苷酸可以促进神经突的扩展在抑制基质如髓鞘和myelin-associated糖蛋白,通过提升凋亡蛋白,促进神经保护和抑制免疫细胞的激活和随后的炎症4]。环腺苷酸途径的主要目标是DNA-bound,本构转录因子,分子在磷酸化的循环活化蛋白激酶A (PKA)发起许多基因的表达,包括那些编码某些神经肽,神经营养因子和精氨酸酶1(多胺的合成的关键酶;图1)[5]。精氨酸酶1的下游产品,包括聚胺腐胺,已被证明调解的几个环腺苷酸对神经突的影响结果(6]。补充glial-derived神经营养因子基因传递与精氨酸酶的底物1,精氨酸,证明挫伤大小显著减少在创伤性脑损伤模型中,虽然没有改善认知功能(7]。SCI的范例,向周围神经移植补充酸性成纤维细胞生长因子增加精氨酸酶1表达和聚胺合成和与有利的M2巨噬细胞反应和轴突再生8,9]。此外,人类间充质基质细胞植入物中多胺的合成的关键酶,精氨酸脱羧酶,导致改善运动恢复和减少疤痕形成SCI后(10]。根据我们以前的研究表明环腺苷酸的能力高度改善SCI后SC植入物的有效性和越来越多的证据表明,聚胺合成可能调解几环腺苷酸的下游影响轴突再生(3,4,6),我们调查是否SC植入物和腐胺的补充,给出在30分钟或1周后延迟contusive SCI后,可以改善SC implant-host集成、轴突生长的支持,和运动恢复的实验contusive SCI范例。

2。材料和方法

2.1。雪旺细胞

SCs坐骨神经的成年女性得到费舍尔老鼠(哈伦有限公司,印第安纳波利斯)如前所述[11,12]。SCs增长融合和三次通道上新菜。以前的方法后,植入SC纯度是测量在95%和98%之间,据我免疫反应性(13]。

2.2。动物

成年女性费舍尔老鼠(哈伦有限公司;180 - 200 g)被安置根据指南推荐的美国国立卫生研究院和动物保健和使用指南。所有动物程序批准的机构动物保健和使用委员会迈阿密大学的。在手术之前,老鼠麻醉(70毫克/公斤氯胺酮、5毫克/公斤甲苯噻嗪)腹腔内注射。

2.3。温和的胸挫伤受伤

MASCIS体重下降装置被用来产生一个温和的胸(T9)挫伤受伤14]。在T8椎板切除术进行胸椎受伤之前为了暴露底层脊髓的背侧表面(T9)没有扰动硬脑膜。当时暴露脊髓受到中度受伤下降了10 g杆从一个12.5毫米的高度。挫伤冲击高度、速度和压缩距离监控了所有的动物。那些高度或速度误差超过6%或压缩距离不是在1.25 - -1.75毫米范围内立即被排除在外(3,15]。根据这些损伤参数标准没有动物需要被排除在研究之外。受伤后,肌肉缝合与金属层和皮肤被关闭伤口剪辑。动物被允许恢复在温暖的笼子里,容易获得食物和水。庆大霉素(5毫克/公斤;雅培,北芝加哥,IL)肌内注射后立即手术,7天每天重复。镇痛丁丙诺啡(0.03毫克/公斤;利洁时公司,里士满,弗吉尼亚州)是手术后皮下注射,然后每天2天,伴随着术后治疗如前所述[16]。

2.4。皮下微型泵的腐胺

SCI感应之前,动物被随机分配到一个以下三个治疗组:(i) SC植入0.9%生理盐水(车辆)控制(),(ii)与急性腐胺(SC植入管理在30分钟的损伤,),(3)SC植入与延迟腐胺(管理注入损伤后1周时间,)。腐胺(100毫米)的速度是0.5μL /人力资源使用两个顺序植入皮下Alzet微型真空泵(型号2001;库比蒂诺Durect Corp .), CA)政府2周时间;清空泵取代后1周(17]。图2提出了一种时间轴的方法。

2.5。许旺细胞移植

在移植之前,SCs使胰蛋白酶化、收获、DMEM / F12媒体统计,resuspended整除,放在冰手术前。一周后损伤大鼠脊髓受伤与2%氟烷麻醉和表现。老鼠然后重新植入了流体SCs其他地方所述的3]。细胞移植后2小时内准备。植入,所有的动物都收到2×10⁶SCs在6μL DMEM-F12媒体撞伤的中心区域,在中线注射1毫米的深度。注射的速度进行2μ使用10 L / minμL硅化汉密尔顿把注射器,斜切的玻璃吸管(120μ米直径),在显微操纵器附带一个显微注射器(世界精密仪器,萨拉索塔,FL)。注射吸管在地方举行一个额外的3分钟接受最小化泄漏撤军。一种动物被排除在研究由于故障的显微注射器在细胞移植。注射后,肌肉层和皮肤分别被关闭和动物收到术后护理如上所述。

2.6。组织学

老鼠安乐死在受伤后10周(9周后植入;100毫克/公斤氯胺酮,10毫克/公斤甲苯噻嗪)和4%多聚甲醛灌注transcardially (PFA, 0.1米,pH值7.4)。组织被切割,冷冻切片机切片进行免疫组织化学分析按照以前的程序(3]。脊髓受伤(2厘米)包括震中在40分段矢状μ米到五大系列自由浮动。

2.7。免疫组织化学

如前所述,每个第五矢状切面是免疫化学染色为后续使用双标记荧光显微镜分析过程涉及单克隆和多克隆抗体15]。这些抗体是针对低亲和力生成受体(第七页;1:5000;Abcam、剑桥、马)、5 -羟色胺(5 ht;1:5000;Immunostar,哈德逊,WI)、降钙素基因相关肽(CGRP怎样;1:1000;半岛实验室、圣卡洛斯、CA)植入SCs识别或描述特定的降序或提升轴突数量的增长,分别在我内⁺SC植入。部分被清洗和孵化与相应的荧光二次抗体(Alexa 488 - 594 -共轭或Alexa山羊anti-rabbit或anti-mouse抗体,1:200;分子探针,尤金或)。部分被安装到Snowcoat X-tra幻灯片(Surgipath,里士满,IL)和cover-slipped Vectashield安装介质(向量实验室,伯林盖姆,CA)包含核染料赫斯特对存储在4°C。

2.8。Stereological植入区域的量化

在一个系列的部分,p75-positive细胞免疫反应性的平均面积是量化在包含SC植入的中心三个部分。表达我的许可描述的植入和识别implant-host线接口。可视化和定量分析,彩色部分使用一个客观的评估方法采用计算机辅助荧光显微镜和Neurolucida软件(版本4.5;MicroBrightField生物科学、威利斯顿,VT)。我的⁺区域的每个三个部分组成的中心SC植入追踪20 x的目标下,使用Neurolucida量化,然后每个动物的SC植入面积计算的平均我⁺区域跨三个部分(18]。

2.9。5 ht和CGRP怎样测定纤维的增长

量化的5-hydroxytryptophan (5 ht)标记轴突生长沿着rostral-caudal轴1000年脊髓的距离,500,100,0μm喙的植入物的中心(如确定使用我免疫反应性)进行部分使用的第二个系列63 x油浸下目标。降钙素基因相关肽(CGRP怎样)标记轴突量化类似的,但在1000年,500年,100年,0μm尾植入的中心。每部分纤维的平均数量是通过计算获得这些应用轴突穿越假想线垂直于rostral-caudal轴在1000年,500年,100年,0μ米的间隔从植入的中心19]。轴突的总数计算给定动物汇聚在部分分析(每个动物~ 10 - 12节),然后除以部分的数量来确定每个部分的纤维数(f / s)在每个距离(4]。

2.10。行为测试

田野BBB运动测试开发的低音部等人来评估总值每周运动性能SCI后10周(20.]。“此外,”的得分的BBB,允许评估分析后肢定位和位置以及平衡和尾巴在0 - 13点范围内使用也用作前面描述了我们组(3]。最后,赤字下降运动控制通过计算客流量错误检查的间隔不规则网格水平走在研究结束时,动物灌注前(4]。行为测试都是由两个人瞎了动物的治疗。

2.11。统计分析

单向方差分析和后续Bonferroni事后测试被用于比较中应用轴突计数组。每周的分析功能恢复模式后植入(BBB和“BBB”的得分),一个混合的阶乘(重复措施)方差分析其次是Tukey-Kramer后续测试工作。被公认为是具有统计学意义的差异,,相比,SC只控制或其他时间治疗组,表示。所有错误给出的标准错误的意思。

3所示。结果

3.1。SC植入大小增加延迟腐胺的补充

统计比较SC植入大小的控制和治疗组治疗显示出显著的影响(,)。相比植入大小只SC组(毫米²),这些动物接受腐胺政府开始植入时表现出植入区(增加1.8倍毫米²;,;数据3(一个),3 (c),3 (d))确定使用我免疫化学(SCs)高度表达的标志13]。相比之下,腐胺政府开始在受伤的时候没有效果(毫米²,)。

3.2。腐胺能提高血清素激活的纤维增长SC植入

含血清素的轴突降的网状结构和脑干中缝核被确定渗透SC植入5 ht免疫染色(数字4(一)- - - - - -4 (c);白色箭头)。对于所有的动物组几乎没有血清素激活的轴突,能够穿透SC植入的中心之外,没有治疗效果观察在这个位置(,;图3 (c))。然而,统计比较5 ht轴突数量在喙的SC植入的一部分显示显著的治疗效果(,在1000μ米,,在500μm,,在100μ从植入的中心)。急性腐胺补充显著增加羟色胺纤维的数量在近端SC植入与车辆控制:平均5 ht⁺每部分纤维(f / s),享年500岁μ米(,),f / s在100μ米(= 12.82,)是量化喙的SC植入的中心,而在车辆控制5 ht⁺f / s和f / s,分别观察这些距离(数字4(一)- - - - - -4 (b))。此外,更多的5 ht⁺观察轴突穿越host-SC植入界面在急性腐胺治疗动物(数字4(一)- - - - - -4 (b);白色箭头)。延迟腐胺产生显著增加补充5 ht⁺轴突数量仅为100μ米有喙的SC植入的中心(f / s,,)。

3.3。腐胺的补充提高感官在SC植入纤维的增长

小直径感觉轴突来自背根神经节内CGRP怎样的免疫反应性的量化的SC植入(数字5(一个)- - - - - -5 (c);白色箭头)。CGRP怎样的统计比较⁺轴突数量组间表现出显著的治疗效果在100年μm尾(,在SC植入的中心)和(,)。在100μm SC植入中心的尾,急性和延迟腐胺的补充导致2.3倍(f / s,,)和1.7倍(f / s,,)增加CGRP怎样⁺轴突数量分别比车辆控制(f / s)。此外,急性腐胺管理局(f / s)显著增加CGRP怎样⁺在SC的中心轴突长在肉内植入物相对于车辆控制(2.80.4 f / s,,,增加了3.9倍)。急性腐胺也显著促进CGRP怎样更有效⁺轴突的生长比在100年延期交货μm尾(f / s,,,增长了1.4倍),在中心的SC植入(5.30.7 f / s,,,增加了2.1倍)。

3.4。腐胺的补充提高运动的复苏

运动性能和功能恢复SCI后,SC植入,和腐胺治疗使用BBB评分进行评估,“BBB”的得分,间隔不规则网格测试。BBB评分的统计比较组间表现出显著的治疗效果在端点(,)和植入后在不同的时间点(,在星期3;,在星期5;图6(一))。相比SC植入、车辆控制(SCI), 10周后,户外运动性能也显著大于在急性(端点,,)和延迟(,,腐胺与SC植入治疗组。BBB部分的得分的统计比较组间表现出显著影响治疗的周后植入(,SCI后,10周;图6 (b))。SC移植相比,车辆控制(,10周post-SCI),后爪位置和尾定位明显优越在急性(,,)和延迟(,,腐胺与SC植入治疗组。统计比较的网格上的脚步声错误数量走治疗组间表现出显著的影响(,;图6 (c))。急性腐胺与SC植入导致政府更好的后爪位置表现证明了降低电网的脚步声走(脚步声)相比,延迟管理局(脚步声,,)和SC植入、车辆控制(脚步声,,)。

4所示。讨论

桥接的敌意环境与植入脊髓受伤的SCs已被证明是一个有效的基础方法的组合修复策略多样化实验SCI模型(3,4,19]。除了鞘和髓鞘轴突,SCs提供刺激神经营养因子,这可能会限制组织损失和鼓励轴突克服growth-inhibitory伤害环境。重要的是,SCs可以安全地从病人自身的周围神经和自体移植回他的脊髓,其使用的主要优势在临床设置(4]。然而,SC植入物本身不能吸引大量的轴突受伤退出网站,无法支持大多数脊椎上的轴突的强劲增长人口除了在特定条件下,和只提供适度的改善功能结果(13,15,21]。为了调解重要解剖修复和/或功能改进,SC植入必须增强各种药理、分子、或生物材料的方法克服轴突生长的内在或外在的抑制剂,如生成的补充,chondroitinase ABC, polysialic酸,矩阵暂停,或环腺苷酸海拔4,19,22]。

在当前的研究中我们已经证明了政府最初的聚胺、腐胺,结合SC植入时,显著提高植入物的大小~ 2倍,从而有可能幸存的数量,SCs植入。此外,急性腐胺政府增强发芽和/或保留降血清素激活的和提升肽能的轴突内植入病变/网站高达400%。延迟的腐胺反映急性模型的影响,但一般有效性降低。植入物尺寸和轴突生长的改进支持腐胺后管理是伴随着增强的功能恢复,包括户外运动能力显著提升和后爪位置相对于动物接收SC单独移植。

我们以前所示的治疗潜力结合SC植入与环腺苷酸海拔(4]。环腺苷酸水平升高是至关重要的在促进轴突的生长抑制基质,如髓磷脂在体外(2),和整个阻滞脊髓受伤(的环境方面大打折扣3]。的upregulation精氨酸酶1环腺苷酸的下游效应,综合多胺的前体,同样被证明能够促进轴突再生,而阻止鸟氨酸脱羧酶脱羧基的速率限制酶精氨酸酶1的产品成腐胺,变弱的能力dibutyryl环腺苷酸和脑源性神经营养因子,以克服增长对抗myelin-associated抑制剂(6- - - - - -10]。聚胺的腐胺可以进一步被转换成多胺亚精胺和精胺;然而相反的反应释放有毒的醛副产品,使腐胺聚胺的选择实验或临床应用的多胺(23,24]。除了促进轴突生长能力,腐胺也已被证明能够充当neuroprotectant,防止神经细胞死亡后缺血或创伤,可能通过其抗氧化和自由基清除行动(25,26]。此外,多胺被认为是纳入elF5A因素,已报告给调解神经生长因子的神经营养和神经保护作用[27]。综上所述,这些研究证据使用多胺的治疗效益提高SCI后细胞植入物的功能。

在当前的研究中,SC植入物被可视化对我使用抗体免疫组织化学,低亲和力神经生长因子受体高表达在SCs文化和脊髓移植。我受体被使用之前确定SC植入在活的有机体内(4]。我们表明,延迟,但不严重,补充的SC植入腐胺导致了植入物的大小增加80%。重叠的管理急性和延迟范式之间的时间和没有急性腐胺的影响,不太可能观察到增强植入大小将直接刺激SC生存和增殖的腐胺,而是需要额外host-supplied因素的存在。既是内生SC迁入和轴突长在肉内发生1-3-week延迟SCI后,腐胺的晚交货可能增强内生SC迁入和/或在工作过程中有信号的刺激植入SCs扩散(轴突3,28]。创伤SCI后,内生SCs已被证明在脊髓神经根,去分化迁移到损伤部位,增殖,并显著上调我表达(28,29日]。内源性SCs的迁移和扩散后1 - 3周发生损伤,暂时与我们推迟腐胺的补充模式。此外,轴突的存在是最强的一个信号诱导SC有丝分裂发生和扩散,而且可能有足够的增长轴突内植入/病变部位在第一周SCI后刺激SC敏锐地扩散。因此,植入SC核扩散和随后的增加植入大小可能最受益的腐胺和轴突生长信号延迟政府时期。是否我的区域增加免疫反应性表示一个增强扩散植入SCs或一个增强的增殖和/或内源性SCs迁移到损伤很难确定明确没有细胞跟踪方法。然而,消耗的多胺在不同的细胞类型可以影响细胞迁移的f -肌动蛋白重组板状伪足,阻碍微管改革,和预防的积累β肌动蛋白和α微管蛋白mRNA (30.- - - - - -32]。因此腐胺能提高内源性SCs的迁移能力。另一方面,SCs大多mitotically静止在正常生理条件下,扩散只在开发期间,沃勒变性、脱髓鞘疾病或侮辱。SCs的增殖能力增强在沃勒变性与海拔鸟氨酸脱羧酶活性密切相关,表明腐胺的补充可以促进内源性或外源性SCs的扩散在病变(33,34]。放大鸟氨酸脱羧酶的活性和多胺elF5A翻译因素来自聚胺类都可以移植增殖的细胞类型(35,36]。还需要进一步的调查来确定我的具体原理和SC植入大小是增强SCI后,植入,延迟腐胺的补充。

除了中介细胞迁移和增殖,腐胺和其它下游多胺也被证明能够促进细胞的生存。腐胺水平不足引起肿胀的内质网和高尔基体,以及应力纤维的消失,都是标志与坏死(37]。细胞内多胺可以改变离子运输、阻塞渠道防止神经元会引起或促进大量(38,39]。Polyamine-induced离子大量已被证明需要诱导释放5 ht突触体,这可能有助于恢复血清素激活的轴突SCI后功能(40]。SC植入物,当用于组合方法,以前显示改善SCI后羟色胺纤维的再生(4]。我们观察到补充SC植入与腐胺羟色胺纤维的数量显著增加近端植入/病变的中心,加强管理的腐胺敏锐地产生影响。含血清素的轴突投射在脊髓内被认为是重要的运动损伤后的恢复(41]。虽然很难确定羟色胺纤维的数量的增加是由于微轴突的再生,抵押品从现有的血清素激活的纤维,或保留的轴突,一个增强的血清素激活的轴突腐胺后政府可以提供重要的刺激作用改善运动功能(42]。未来的使用一个完整的脊髓横断范式与SC嫁接(12]等确定是否将提供一个意味着5 ht轴突的生长是由于再生,发芽,或保留,当结合神经解剖学的跟踪,血清素激活的轴突是否从脊椎上的或脊柱内的神经元。

初级感觉传入纤维的生长,免疫反应性的CGRP怎样,有终端表面板的脊髓和与传输相关的疼痛,也受益于腐胺的交付,增强轴突数量在SC植入的中心。CGRP-positive神经元也被牵连的调制的精细运动控制和姿态的控制,因此他们的增长可以指示性运动功能的变化(43]。已知主要背角传入纤维发芽成更内侧板的脊髓SCI后,又使它具有挑战性,以确定是否CGRP-positive纤维数量的增加是由于再生感觉传入纤维或抵押品豆芽(44]。5 h轴突生长,急性SCI后腐胺和SC植入生成的CGR的最大数量纤维增长,几乎四倍的纤维相比,SCs独自一人和两倍多纤维推迟补充。这些CGR轴突可能出现DRGNs出席的病变或从DRGNs定位更加明确。需要进一步研究探索腐胺的机制鼓励初级感觉传入纤维克服抑制环境的主机cord-implant接口和渗透到SC深深植入物以及使用跟踪技术来识别的水平(s)回应DRGNs。

腐胺的补充SC植入物也导致重大功能改善,衡量在开放领域的BBB评分和网格走测试。无论腐胺的时间交付,增强运动能力,通过使用“BBB评分和”的得分计算,获得了与治疗SC植入相比,车辆控制。总的来说,两个急性和延迟腐胺管理生成类似的后肢的改善性能和尾巴姿态,包括一点更高的BBB评分和五点“BBB”的得分更高。只有急性腐胺,然而,客流量减少错误水平网格走测试中,25%的车辆控制。急性腐胺的效果只在这个测量结果表明,组织保护可能会是一个机械的解释效果。观察到的功能改进后补充的SC植入与腐胺除了那些已知当单独使用SC植入提供SCI后(4,13]。最明显的行为改善被“BBB”的得分显示,持续改善的结果观察移植后1周开始。这种高度急性好处可能暗示这些影响是通过putrescine-mediated神经——或者axopreservation。后来的BBB评分的改善和“持续改进”的得分可能反过来是由于赔偿的行为受到初始交付腐胺的影响。

5。结论

总之,我们提供的证据表明,调制多胺与细胞移植是一种有效的方法提高植入物的功能以及运动SCI后恢复。未来的研究应该寻求更好地理解机制腐胺对SC的影响函数,移民,和生存,以及它能促进轴突的生长,和/或萌芽。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

作者欣然承认迈阿密项目动物核心设施进行脊髓挫伤和术后动物保健,特别是,亚历山大•Marcillo保罗·迪亚兹,圣地亚哥卡斯特罗,丹尼斯Koivisto,金正日Loor,罗莎·阿布里尔。此外,作者感谢叶莲娜Pressman的雪旺细胞培养、组织学Devin参赛,贝亚特Frydel,水晶Portocarrero,为图像分析和迈克尔《图片报》,赖莎Puzis免疫组织化学。这项工作是由国家卫生研究院研究所批准号R01NS056281 (d·d·皮尔斯),迈阿密项目治愈瘫痪,夏天Buoniconti基金和路易斯教皇神经科学研究奖学金(j . b . Iorgulescu)。j·布莱恩Iorgulescu得到了多丽丝·杜克大学临床研究奖学金。