文摘

积累可溶性β淀粉样蛋白(Aβ-)诱导异常神经网络活动可以直接导致认知障碍,这是最杰出的阿尔茨海默病(AD)的特征。内嗅皮层(EC)是最早的广告影响的大脑区域。EC神经元的损伤负责广告的认知缺陷。然而,小的努力已经取得了可溶性的影响进行调查β在EC神经元的放电特性在活的有机体内。本研究旨在研究可溶性的影响β₁₋₄₂在EC神经元的放电特性,使用在活的有机体内细胞外单单位记录。天麻的保护作用(气)也与调查β₁₋₄₂全身的改变EC神经元活动。结果表明,EC神经元的自发放电增加了可溶性的本地应用程序β₁₋₄₂气体可以有效地扭转β₁₋₄₂全身浓度的方式自发放电的便利化。此外,全细胞膜片箝结果表明,气体的保护功能异常兴奋过度可能是部分由其抑制作用β₁₋₄₂引起的电流在EC神经元。我们的研究表明,气体可能提供神经保护作用β₁₋₄₂全身的EC神经元的过度活跃的老鼠。

1。介绍

阿尔茨海默病(AD)是最常见的但无法治愈的神经退行性疾病,是导致老年人痴呆。β淀粉样蛋白(β)肽,源自于淀粉样前体蛋白,被认为是最关键的有毒物的广告,引起多种神经病理变化,如突触丢失,神经传递的障碍,和神经元死亡1]。最近,越来越多的证据表明,Aβ全身的神经网络活动的扰动可能是一个主要贡献者早期AD发病机制。异常的神经元网络活动是AD患者观察和转基因小鼠模型的广告,认为引起功能障碍和记忆缺陷(2,3]。

entorhinal-hippocampal网络是一个重要的电路在记忆的巩固和回忆4),严重影响在广告的发展(3]。内嗅皮层(EC)已被证明是最早的大脑区域受损在广告5]。放射学研究也提供了证据表明,早期AD病人表现出结构和功能改变的EC (6,7]。先前的研究表明,高浓度的β,特别是β_1-42已被描述为最有毒的变体β,改变大鼠海马神经元的兴奋性8,9]。高水平的β_1-42提升suprasynchronization个别大鼠前额叶皮层神经元之间通过增加他们的兴奋性10]。此外,据报道,一个β_1-42可以打扰自发放电的模式在大鼠的海马CA1区(11]。然而,几乎没有相关的神经元电生理数据EC在高水平的环境中β_1-42。

天麻(气)是一种传统的中药隔绝天麻(图1),被认为是最重要的一个东方国家的传统药物。是正式列入中国药典和用作抗惊厥的,镇痛,和镇静剂眩晕,全身瘫痪,癫痫,破伤风12]。现代临床研究证明其效率作为一种抗癫痫药物(13),对认知能力下降的保护作用与体外循环心脏手术后的病人(14]。此外,最近的在体外研究发现,气体有神经保护作用的广告诱导的细胞模型β_{25 - 35}(15和可以促进学习和记忆16]。最近的一项研究也证明了β_1-42有关的氧化损伤是减少了气体主要培养大鼠海马神经元(17]。尽管这些观察,气体是否对神经的影响β_1-42全身的神经网络活动的扰动在活的有机体内是未知的。因此,是否β_1-42可以打扰高峰EC神经元的放电在活的有机体内和是否β_1-42打扰上升气体放电可以重塑的重要问题。在目前的研究中,我们使用细胞外记录和全细胞膜片箝记录调查的影响气体在EC异常放电模式由可溶性的本地应用程序β_1-42。

2。材料和方法

2.1。动物和手术

男性Sprague-Dawley老鼠(200 - 250 g)获得的第三军医大学实验动物中心在中国。所有协议和程序批准的大学动物保健和使用委员会。动物是深麻醉之前使用聚氨酯(1.5 g / kg)被放置在一个立体定位器。头骨被曝光,一个小洞钻暴露EC区域(前囱:美联社−6.6毫米和毫升4.7毫米;从头骨表面深度:6.8毫米)(18]。

2.2。药物

所有试剂都是来自(美国Sigma-Aldrich)除了炒β_1-42肽(美国Anaspec, Fremont, CA)。可溶的β_1-42是准备如前所述19]。总之,一个β_1-42第一次被溶解在hexafluoro-2-propanol (HFIP)和整除。HFIP当时被蒸发在真空下,和由此产生的肽电影存放在−20°C。在使用之前,一个整除的β_1-42肽电影是溶解在无水二甲亚砜(DMSO)和添加到冰冷的人工脑脊髓液(ACSF)获得200的工作浓度μ在4°C m .这个解决方案然后孵化24 h和离心机。上层清液包括可溶性β_1-42准备;是一个主要的物种β_1-42单体,也包括三聚体、四聚物,以及在较小程度上,二聚体(19]。炒一β_1-42肽是准备以同样的方式β_1-42。气体溶解在0.9%无菌生理盐水的浓度。

2.3。单一单元录音

一个铰链的玻璃微电极(总齿顶圆直径3 - 10μm,抗5 - 20 MΩ)是用于电生理记录和micropressure注入。玻璃微电极记录充满了0.9%氯化钠溶液。其他四个桶与4-channel压力注射器(PM2000B微数据工具,Inc .)、美国)并根据需要充满了不同的药物。药物被驱逐在放电细胞表面的气体压力(20.]。intrabarrel药物的浓度选择基于先前建立的作品(8,21,22)改变神经元活动及其疗效可靠。0.5μL(在注射药物应用于神经元。记录电极喂养的信号是系统放大器(Carlsborg,佤邦,美国)和过滤的带通0.3 -10千赫。一个单元分离和分析使用高峰2(英国伦敦剑桥大学电子设计有限公司)。信号是存储在一个电脑配备了MATLAB分析系统进行进一步的离线分析。单位活动随后分析了每500年代时期平均放电率(本宽度,10 s),归一化相对于500年代的基线值。为了避免注射的瞬态效应,windows的分析是500年代开始注射药物后的利益。

2.4。全细胞膜片箝记录

Sprague-Dawley老鼠(P12-21)被用于这项研究。氟烷麻醉后,每只动物被斩首,大脑很快被删除。大脑随后被淹没在寒冷ACSF包含(125毫米)氯化钠,氯化钾的2.5,25 NaHCO₃1.25 KH₂阿宝₄1.2 MgSO₄2 CaCl₂和10个葡萄糖,洋溢着95% O₂-5%的公司₂,pH值为7.4。大脑被阻挡,和一个振荡组织切片机(徕卡、VT1000位于德国)被用来减少400μ米厚的水平切片20°角的部分。片最初孵化在室温下至少90分钟(ACSF 22 - 24°C),然后转移到被淹没在记录室,他们连续灌注carbogen缓冲ACSF室温。全细胞膜片箝记录了EC星状神经元的细胞体。进行了数据采集与EPC10放大器(HEKA Elektronik Lambrecht /法尔兹,德国)。离线分析的信号存储与脉冲/脉冲适合v.8.74 (HEKA Elektronik)和伊戈尔Pro v.4.03 (WaveMatrics)。吸量管(4 - 8 MΩ)全细胞记录了在水平微量吸液管拉出器(p - 97、萨特仪器)纤维毛细玻璃和满心吸管的解决方案包含145 K-gluconate(毫米),0.5 EGTA 2 MgCl₂5玫瑰5钾离子,0.4 Na-GTP, pH值7.4,290 - 295 mOsm。液体接界电势计算大约10−mV的内部解决方案,和膜电压修正离线。串联电阻补偿80%,并持续监控整个实验。神经元是丢弃如果串联电阻改变15%以上。

2.5。数据分析

8.0统计分析使用统计分析软件的起源(Microcal公司,北安普顿,妈,美国)和SPSS 18.0 (IBM,纽约,纽约)。值提出了均值±S.E.M.意味着值组间的差异进行了分析使用学生的以及和单向方差分析。的值被认为是重要的。

3所示。结果

3.1。可溶的β_1-42EC神经元的自发放电活动增加

EC神经元的活动变化测定可溶性的自发放电前后的应用β_1-42。图2(一个)显示了一个典型的单元活动的记录从一个神经元。所有的峰值记录在本研究显示两相的正/负波形。spike-sorting技术用于分离单一神经元的活动。基于不同的振幅和波形的峰值,记录活动是按主成分分析(PCA)。图2 (b)显示波形的代表性样本从一个神经元欧共体在1800年代。在基础条件下,波形稳定,表明所有的记录来自单个神经元确实是峰值。图2 (c)提出了离线分类与PCA峰值。很明显,PCA分析显示一个数据集群在PCA-feature空间,进一步表明所有的峰值记录从一个神经元。

以前的电生理结果阐明,β_1-42可以激活海马神经元在体外(9]。在接下来的实验中,我们进一步研究了可溶性的影响β_1-42在麻醉大鼠EC神经元的活动在活的有机体内。代表插图EC神经元的放电变化后车辆或可溶性的应用β_1-42如图3(一个)。200年的政府μ米一个β_1-42EC神经元的放电率增加,起始时间约300 - 900年代。作为显示在图3 (b),意味着燃烧率的增强作用建立在第一次注射后的1000年代β_1-42500年代,稳定。然后,意味着燃烧速度逐渐回到基线值,表明溶性的影响β_1-42EC神经元的放电是可逆的。在1000年代后注入的β_1-42,平均发射率%的基线值(图3 (b),,与基线(500年代之前注射))。相比之下,汽车集团控制,没有明显的对EC神经元的放电活动的影响(图3 (b),,对基线)。汽车组的平均燃烧率在1000年代后注射%的基线,这是明显不同的β_1-42组(图3 (c),对于每一个群,)。确保流量的增加引起的β_1-42不是由于非特异性肽效应,我们应用一个炒β_1-42肽EC神经元。如数据所示3(一个)- - - - - -3 (c),炒β_1-42肽没有显著影响意味着EC神经元的放电频率。炒的平均燃烧率β_1-42集团在1000年代107.3±26.0%,注射后并没有显著不同的汽车集团(图3 (c),炒一β_1-42组,)。总之,这些研究结果表明,可溶性β_1-42,但不是炒的形式,可以显著提高EC神经元的自发放电。

如图3 (d),我们进一步分析之间的关系β_1-42全身的兴奋在1000年代后注入和11个神经元的基础发射率。虽然温和,有负相关(,)这两个参数,表明神经元与慢基底燃烧速度影响更大β_1-42在欧共体。

3.2。气体使可溶性β_1-42增加全身的发射活动

然后我们测试气体是否能抑制可溶性β_1-42全身的自发放电的扰动。盐水(用作控制)和10毫米气体本身没有明显的效果在EC神经元的放电活动实验(图4(一))。平均发射率在1000年代后的应用生理盐水或10毫米气体% (,与基线)和% (,分别对基线)(数据4 (b)和4 (c))。200年的政府μ米一个β_1-42增加了EC神经元的自发放电(图4(一))。在1000年代后注入的β_1-42,平均发射率%的基线值(数据4 (b)和4 (c),,对基线)。应用10毫米气EC神经元显著抑制β_1-42增加全身的发射活动(图4(一))。发射率在2000年代之后β_1-42应用程序(等于在1000年代后气体应用程序)%的基线值,显著低于Aβ_1-42一组时间点(数据4 (b)和4 (c),%,对于一个β_1-42组,)。

进一步研究气体浓度和抑制的影响之间的关系,我们记录的EC预处理神经元与不同浓度的气体之前β_1-42注入。代表说明发射的变化仅在EC神经元使用天然气图所示5(一个)。生理盐水或10毫米气体应用500年代自发放电时稳定。如数据所示5(一个)和5 (b)200年,政府μ米一个β_1-42EC神经元的放电频率增加使用生理盐水。在1000年代后注入的β_1-42(等于盐水应用程序)后,在1500年代,平均发射率%的基线值(图5 (b),,对基线)。相比之下,与10毫米天然气预处理后,没有明显的增加,EC神经元的放电活动后发现200年的应用程序μ米一个β_1-42(数据5(一个)和5 (b),%,,对基线)。发射率的分析,1000年代后的应用程序β_1-42(等于1500年代与不同浓度的气体)预处理后显示的抑制性影响气体的反对β_1-42浓度(图5 (c),生理盐水组:%,生理盐水+β_1-42组:%,100μM气体+一个β_1-42组:气体+ % 1毫米β_1-42组:%,气加上10毫米β_1-42组:%,对于每一个群,^# ,^{# #} 与生理盐水组,^& ,^{& &} 与生理盐水+β_1-42组,,)。这些结果表明,气体异常有保护作用,β_1-42全身的EC神经元的活动。

3.3。气体阻塞β_1-42引起的电流在EC神经元

探讨细胞机制保护气体的影响β_1-42全身的神经活动的扰动,我们分析了气体对可溶性的兴奋性的影响β_1-42对待EC神经元中在体外切准备。星状神经细胞是最丰富的EC神经元(23),我们将记录从8随机选择EC星状神经current-clamp模式。符合在活的有机体内结果(图3),浴300纳米的应用β_1-42显著增加所有记录EC的兴奋性神经元(图6(一))。与此同时,强劲的一个β_1-42全身的EC神经元逐渐减弱,完全废除100年coapplicationμ气体(数据6(一)和6 (b))。我们下一个检查的影响β_1-42和天然气全细胞电流的EC神经元。在电压钳模式下,记录EC神经元−举行70 mV。一个简短的300 nM(100年代)的应用程序β_1-42引起了大多数神经元内稳定电流(6/8)。有趣的是,气体明显受阻β_1-42引起的电流在剂量依赖性的方式(数字6 (c)和6 (d))。的振幅β_1-42引起的电流逐渐减少剂量的气体从10增加μM - 100μM(图6 (d),一个β_1-42单独组:pA, 10μM气体+一个β_1-42组:pA, 50μM气体+一个β_1-42组:pA, 100μM气体+一个β_1-42组:8.0±2.3 pA,对于每一个群,^# ,^{# #} 而β_1-42组,,)。总之,这些结果表明,气体抑制β_1-42全身的多动症通过阻断β_1-42引起的电流在EC神经元。

4所示。讨论

在目前的研究中,我们使用细胞外单单位记录技术探讨可溶性的作用β_1-42在EC神经元放电在活的有机体内。我们的研究结果表明,可溶性的本地应用程序β_1-42在欧盟地区显著增加神经元自发放电(图3)。气体阻止EC神经元的自发放电的改变引起的β_1-42(数据4和5)。全细胞膜片箝结果显示气体阻止了β_1-42引起内电流的EC神经元(图6)。

4.1。气体可能有潜在的治疗价值β全身的异常活动

欧共体占据中心位置的边缘前脑之间提供双向互联其余的大脑皮层和海马结构(4]。动物实验和临床观察人类已经证明了EC-hippocampal-neocortical电路基本在某些形式的记忆4]。AD患者记忆障碍的某些方面已被归因于EC的损害24),这是最早的和最严重受损的大脑区域在这种疾病5]。在目前的在活的有机体内研究中,我们提供电生理学证据表明可溶性的直接应用β_1-42可能会增加EC神经元的自发放电(图3)。的生产β及其分泌到细胞外空间由神经活动严格监管。增加神经活动增强β生产,而阻断神经活动有相反的效果25]。我们怀疑β全身的多动症的EC神经元可以增加生产β,提高的可能性在一个恶性循环β促进自己的生产通过EC神经活动的变化。这种恶性循环可能会进一步削弱EC-hippocampal神经元电路的完整性和功能,作为一个β合成了EC神经元可以通过海马体的穿甲弹通路3]。因此,早期干涉欧盟打破这种恶性循环可能的疗效,可能阻止疾病进展。

中国古代草天麻被认为有几个有利影响治疗头痛、眩晕、破伤风和癫痫(12,13,26,27]。重要的是,天然气的主要活性成分天麻,能穿透血脑屏障进入大脑(13]。最近的一项研究表明,气体保护主要培养大鼠海马神经元对β全身的神经毒性,减轻记忆缺陷,减少神经病理学的小鼠模型广告(17]。这些研究结果表明,气体可能是有效的广告。目前的研究表明,气体逆转了β_1-42全身的EC神经元的自发放电蚀变(图4),这种抑制作用的气体(图存在剂量依赖的相关性5)。相比之下,同样剂量的气体本身并不影响EC神经元的放电活动(图4)。这些结果表明,气体可能会选择性地作用于自发的活动异常β州。从上面的结果我们推断出气体可能是有益的代理在缓解异常EC-hippocampal网络广告发展的活动。

4.2。潜在的气体的保护作用与离子机制β全身的异常活动

探索气体的保护作用与细胞机制β_1-42全身的异常活动,我们使用了一个在体外片准备执行全细胞膜片箝记录在EC神经元。可溶的β_1-42导致老鼠EC膜去极化和放电神经元(图6(一))。这些发现符合可溶性的观察,直接应用β_1-42可以诱导EC神经元多动症在活的有机体内(图3)。此外,我们发现一个β_1-42在EC神经元引起的电流(图6 (b))。据报道,细胞或细胞外应用β或其片段可以调节离子通道的功能,包括钾(K⁺(Ca),钙^{2 +})和钠(Na⁺)渠道28]。在野生型老鼠β_1-42减少一套K⁺导,包括延迟整流,瞬态a类型和Ca^{2 +}激活K⁺电流(28]。

在目前的研究中,我们发现的影响β_1-42被治疗几乎完全阻止气体(数据吗6 (c)和6 (d))。目前发现的一个可能的解释是气体可能发挥其有利影响部分通过Na的规定⁺或者K⁺电流。先前的研究表明,天然气可以剂量依赖性逆转病理改变Na⁺和K⁺电流在小背根神经节神经元模型的糖尿病(29日]。此外,天然气也可能通过调节Ca发挥有益的作用^{2 +}电流。它已经表明,天然气可以防止glutamate-induced Ca^{2 +}涌入(30.]。相比之下,一个β提高兴奋性活动glutamatergic突触网络和引起Ca^{2 +}涌入(31日]。我们推断这反对监管的Ca^{2 +}涌入可能导致气体上的有利影响β_1-42诱发异常的EC神经元的兴奋性。应该注意的是,离子电流可能不是唯一的目标气体,气体在其他细胞目标的影响和信号通路不能排除在外。

总之,目前的研究表明,气体治疗改善β_1-42全身的EC神经元活动的扰动。这些结果表明,气体可能是一个潜在的候选人广告疗法。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

这项工作是国家自然基金会赠款支持中国(31100759)、重庆(CSTC2011BB5039)的科学基础,重庆市高等教育教学改革项目(没有。132080)执朱博士。作者也承认支持得到了加拿大自然科学和工程研究理事会(NSERC发现格兰特)丰联许博士。