MMP-9 Deafferentation-Induced MMP-2的再分配,而不是,取决于GAP-43阳性轴突的出现在成年大鼠耳蜗神经核

文摘

的基质金属蛋白酶MMP-9 MMP-2,细胞外基质(ECM)的主要调节器,在数量和分布改变老鼠前腹侧的耳蜗核(AVCN)感觉传入神经阻滞后耳蜗消融。来确定因果关系之间存在的再分配MMP-9 MMP-2 deafferentation-induced神经移植,红藻氨酸stereotaxically注入腹侧核的梯形体(VNTB)耳蜗消融之前,杀死细胞提供生长相关蛋白43 (GAP-43) AVCN。Deafferentation-induced模式的变化MMP-9染色仍然受到VNTB病变的影响。相比之下,分布的变化通常MMP-2唤起的感觉传入神经阻滞是逆转如果GAP-43阳性轴突在AVCN阻止增长。总之,GAP-43-containing轴突在AVCN新兴耳蜗消融似乎因果MMP-2-mediated ECM重塑的维护。

1。介绍

耳蜗消融需要沃勒变性的听觉神经纤维和损失的突触终端耳蜗核(CN) [1]。lesion-induced不利的阶段所得一些天,离开CN兴奋传入的大规模减少输入(2,3]。后续的退化轴突和突触末梢,发起组织重组的建设性的阶段,显然包括神经再生和神经移植术4,5]。

生长-蛋白43 (GAP-43)是一个标记的轴突生长和突触发生在中枢神经系统(CNS) [6]。高表达在早期大脑个体发生,GAP-43表达式是拒绝与产后的恶化发展(6,7),但高企在某些大脑区域或可能再次上升如果需要修改和突触重塑网络(8,9]。感觉传入神经阻滞后,GAP-43再度出现在纤维和突触前终端成长为前腹侧的CN (AVCN) [10,11]。这些纤维来自神经元的内侧olivocochlear (MOC)系统产生腹侧核的梯形体(VNTB) rhombencephalic区域特征明显大的胆碱能神经元(10,12]。在内耳、商务部神经元发出轴突络脉的耳蜗核(13- - - - - -15),终止在略微位于颗粒细胞层AVCN在正常动物(16,17]。这些轴突络脉发芽到中部地区AVCN耳蜗消融后,取代失去听觉神经的兴奋性输入(12]。在目前研究GAP-43用来标记轴突生长和被动的突触发生。

神经变性和再生需要,需要广泛的组织动力学包括死亡的结构元素和他人形成,失踪的一些分子组件和其他的崛起,和膜的运动,细胞器,和分子,所有影响不同类型的细胞和细胞外基质(ECM)。基质金属蛋白酶(MMPs) ECM在神经组织的关键调节器。他们组成一个大家庭的主要细胞外地操作酶(18[](异常19,20.])。它们是合成和分泌活性的酶原和激活pericellular地区(17,18)来执行基本功能神经可塑性和沃勒变性的过程以及轴突生长和再生(审查[21- - - - - -23])。除了提供分子信号通过处理然后绑定到特定的细胞表面受体的配体,基质金属蛋白酶也函数的物理重组pericellular环境(24]。

明胶酶MMP-9和MMP-2属于最丰富的大脑中基质金属蛋白酶(25]。在早期研究中我们能够显示神经纤维网MMP-2积累的时空关系的出现神经纤维和剑头GAP-43-positive sensory-deafferented AVCN [26并建议MMP-2参与神经网络的补偿重组遭受巨大损失的突触联系。相同的MMP-9不能声称。根据文献,MMP-9通常与早期有关组织反应由于神经退化和相关事件伤害像神经元死亡后(27- - - - - -29日],胶质疤痕形成[30.),开放血脑屏障的29日]。

与目前的研究中,我们旨在解决两个问题。首先,我们绘制的染色模式MMP-9和MMP-2 AVCN消融后不同时间点的耳蜗为了看看他们的数量、分布,或两者都改变了由于感觉传入神经阻滞。因为我们很快注意到小的变化发生在全球染色MMP的准备(手稿),但本地更改围绕神经细胞体显而易见,我们关注神经元的MMP染色及其周围。第二,我们试图确定是否有因果关系deafferentation-induced重新分配AVCN基质金属蛋白酶和神经移植的。因此我们进行VNTB之前感觉传入神经阻滞防止轴突发芽和突触发生在AVCN [12]。偏离正常的MMP-9 deafferentation-induced相关和MMP-2记录。

2。实验程序

2.1。动物

34个女Wistar鼠的大脑年龄在6到10周被用于这项研究。动物保健和使用报道是通过适当的机构(德国弗莱堡Regierungsprasidium许可数量35/9185.81 / G-07/22)。外科手术,老鼠深深麻醉的腹腔内注射氯胺酮的混合物(50毫克/公斤,接受,Parke-Davis,安阿伯市,密歇根州,美国)和甲苯噻嗪(5毫克/公斤,Rompun,勒沃库森,德国)。动物被分成4个实验组(表1)。组1由控制动物,没有收到任何手术。组2包括动物接受注射磷酸盐缓冲盐水(PBS) VNTB单方面和动物注射海人酸(KA) VNTB。动物在3组收到了单侧耳蜗消融并存活下来,术后3或7天(PODs)。组4由动物接收KA注入VNTB右边的脑干耳蜗消融左边1到3周后。耳蜗消融后,动物存活3或7天(表1)。调查在POD1没有完成这组因为GAP-43不明显出现在AVCN POD3 [4]。在这项研究中,大脑的一侧的耳蜗消融是被称为侧完成的。

2.2。耳蜗消融

麻醉后(见上图),鼓膜检查完整性和透明度。单侧耳蜗消融了左边使用retroauricular方法(4]。面部神经被切割后退出头骨,鼓膜鼓膜处被移除和开放的大疱定音鼓是扩大至耳蜗的提供良好的能见度。耳蜗的骨墙开了金刚石钻头和耳蜗的内部,包括螺旋神经节,被完全移除。耳蜗和大疱满心明胶海绵(Marbagelan / Spongostan Ferrosan, Soeborg,丹麦)和手术伤口关闭。

2.3。立体定位注射KA VNTB

动物被定位在一个立体定位头部固定器。颅骨切开术是由直径约3毫米和硬脑膜打开。孔集中在2毫米尾和2毫米横向点λ31日]。汉密尔顿注射器连接到一个玻璃微量吸液管与齿顶圆直径约为50μm用于单边(右)压力注射KA(红藻氨酸一水,Sigma-Aldrich, Taufkirchen,德国,K0250-10MG,每注入100 nL, 1毫克/ 100μL洛克的解决方案)。与立体定位注射集中在VNTB目标横向坐标1.8毫米,0.7毫米的腹侧,0.3毫米吻侧两耳零的老鼠的体重约200克。注入持续了5分钟和吸管了在位置5分钟前撤军。头骨开放明胶海绵覆盖,头皮是手术关闭。老鼠从注射在耳蜗消融相反(左)边或直接组织学处理他们的大脑。双边注射KA没有做有两个原因。首先,商务部神经元的交叉投影驻留在VNTB主导着交叉投影(13]。相应地,实验侧注射KA紧随其后耳蜗消融显示大量减少耳蜗ablation-induced GAP-43表达式在AVCN [12]。第二,老鼠接受双边KA注入后脑足以覆盖VNTB有生存下来的机会很小12]。

2.4。免疫组织化学

动物收到了致命剂量腹腔Trapanal(50毫克1毫升蒸馏水/体重200克、奈科明GmbH,康斯坦茨,德国)灌注,transcardially与一个固定的解决方案包含4%的多聚甲醛和0.1%的戊二醛在pH值7.4 0.1磷酸盐缓冲剂。大脑被移除的头骨和切成40μ米厚的额叶部分与振动切片机刀片(德国徕卡VT 1000年代,Benzheim)和收集到的部分0.37%甘氨酸磷酸溶解在0.1缓冲pH值7.4。主要抗体用于抵抗GAP-43所有实验群体、MMP-9或MMP-2(表2)。

不同采用免疫程序了。的可视化GAP-43 AVCN,自由浮动部分preincubated Triton x - 100年的0.1%,0.15%的H₂O₂和正常血清,5%在0.02 PBS pH值7.4在室温下30分钟。MMP-2和MMP-9染色相同的预培养的步骤了,但是特里同x - 100取代了二甲亚砜浓度增加应用于4 5,10,20,40%。特里同x - 100相比,二甲亚砜不穿透深入部分,提供两个清晰可分焦平面定量粒子检测。部分是孵化主要抗体(表2)在晚上4°C。孵化与匹配的二级抗体(表2),形成一个avidin-biotin复杂(Elite-ABC;向量实验室,美国伯林盖姆)花了1 h,其次是染色,0.05% 3.3 -diaminobenzidine tetrahydrochloride(轻拍;σ,Taufkirchen,德国)和0.005% H₂O₂在50 mM三羟甲基氨基甲烷缓冲液pH值7.2。染色的GAP-43免疫反应性,0.3%硫酸镍铵被添加到民建联的解决方案。部分染色GAP-43是安装在gelatin-subbed幻灯片,空气干燥,脱水在增加等级的酒精,和cover-slipped Entellan(默克公司,达姆施塔特,德国)。部分染色MMP-9和四氧化锇MMP-2孵化在0.1%卡可基酸缓冲在pH值为7.2 4 - 7分钟。部分被脱水在提高分数的乙醇和flat-embedded epon(嵌入- 812,科学服务,慕尼黑,德国),支持形态的完整性。树脂硬化后,感兴趣的领域被拍到在光学显微镜下,选择进一步分析。部分reembedded在明胶胶囊,在横向平面切成0.5μ米厚semithin部分使用一个超微切片机(Reichert-Jung Ultracut,维也纳,奥地利)。这些部分是安装在玻璃幻灯片,风干,cover-slipped Glycergel(美国加州Dako, Carpinteria)。

验证所有主要的特异性抗体,消极的控制由省略主要抗体相应的孵化步骤(数字1(j),1(k)4(一)插图)。特异性抗体的提出对MMP-9另外验证通过预孵化MMP-9肽在室温下2小时前暴露部分之前所描述的免疫组织化学染色。一个等价的产品是MMP-2不可用。染色也同样明显的失败后,这些嵌入部分削减semithin部分进行分析。

2.5。尼氏小染色

大脑部分运往尼氏小染色洗在0.02 PBS pH值7.4,安装在gelatin-coated玻璃幻灯片,和空气干燥。他们然后在酒精脱脂,孵化甲酚紫(浓度,斯图加特,德国,1 a396;2分钟在蒸馏水)为1%,增加分数的乙醇脱水,二甲苯清除,封面与Entellan下滑。

2.6。定量数据采集

照片是通过一个×5×100目的使用数码相机(AxioCam,蔡司,耶拿,德国)8位深度灰色基调。为每个类型的染色、孵化参数、显微镜设置,曝光时间,全球呈现的照片进行严格常数在所有实验。

我们确定的整体染色水平GAP-43 AVCN免疫反应性的灰色基调意味着×5照片(图4)使用Photoshop CS (Adobe版本。8日,加州圣何塞,美国)。分析异构GAP-43染色法是通过测量灰色基调意味着两个字段相等的大小,放在AVCN这样一个字段撒谎在该地区的染色和其他地区最强的染色(图4(f)),避免边际AVCN区。在部分显示均匀分布式GAP-43免疫反应性在AVCN和控件(数字4(一)-4(e)测试领域集中在背侧和腹侧AVCN的一半,分别。染色强度测定在AVCN两岸的脑干和从左到右或ipsilateral-to-contralateral比率或比率为成对测试领域内的侧AVCN计算。

MMP-9和MMP-2定量数据采集是两种不同的策略。首先,免疫反应性的粒子的密度在神经元胞浆和神经纤维网的AVCN检测与分析(软成像系统GmbH德国明斯特),设置阈值的灰色基调严格检测,而高和常数每×100的照片彩色MMP-9或MMP-2 semithin部分,分别(图2(a))。Semithin部分包含免疫反应性的粒子在只有一个焦平面,让他们没有量化(图2(c))。照相后文档的第一个削减(图1 - 3 semithin部分2()),cover-slips被拆除,复染色的部分以亚甲基blue-azure(1%的azure II在蒸馏水和1%的亚甲蓝(默克公司,达姆施塔特,德国,9211年和6045年,分别地。)在硼砂,混合等量)可视化细胞体和核(图的边界2(b))。部分被cover-slipped Entellan和照片相同的地点已经记录。当时可能大纲3感兴趣的区域(roi),旨在检测MMP-9和MMP-2正粒子的迁移从细胞质到周围神经纤维网的AVCN神经元,如果他们发生。第一个ROI概述了细胞质的神经元细胞核附近(ROI₁)。第二个ROI概述了等离子体附近的细胞质膜(ROI₂)。如果细胞内基质金属蛋白酶的动作向质膜发生,我们应该能够检测到它们通过对比染色在这些roi术后不同时间点。三分之一的投资回报率(ROI₃)位置的周围神经神经纤维网立即somata(图2(b))来确定有一个增长pericellular地区各自的MMP postlesional时间。ROI₃是面向的前沿部分,以防止错误在粒子检测由于减少DAB-staining强度以外部分深度达到初级抗体扩散(数据吗2(b)和2(c))。从神经胶质神经元是杰出的大小和形态。统计数据采集,所有与清晰可见神经元细胞核和细胞边界考虑在内。这项研究没有区分不同类型的神经元。roi识别对比染色后被分配到适当的semithin部分的照片,用于确定染色MMP-9密度和MMP-2免疫反应性。从左到右或ipsilateral-to-contralateral比率AVCN粒子密度的计算。

知道MMP-9 MMP-2粒子密度semithin部分显著降低AVCN神经元的胞浆后传入神经阻滞(图2),我们使用的染色强度MMP-9和MMP-2 AVCN神经元的胞浆40μ米厚flat-embedded部分识别可能transcellular运动的MMP的传入神经阻滞。在第二个战略量化数据采集灰色基调意味着测定AVCN神经元的胞浆染色MMP-9或MMP-2(图1(e))的照片flat-embedded部分×100的目标。从左到右或染色强度(图ipsilateral-to-contralateral比率6)和不同彩色字段的比率在侧AVCN(仅MMP-2)计算(图7)。

统计分析是使用Prism4 (GraphPad 554软件有限公司、拉霍亚加州,美国)。组间显著差异的测量测定采用单向方差分析(方差分析)其次是Newman-Keuls测试或,如果适用,双尾学生的t以及。重要性水平显示为* * *,* *或*。#重要性水平表示的数据识别与控制水平上存在显著差异。

3所示。结果

3.1。时间的MMP-9整合后AVCN耳蜗消融

在正常成年大鼠,AVCN MMP-9高表达在神经元细胞的细胞质的身体(图1(a))。在神经纤维网MMP-9水平较低,导致他们的独特的外观(图1(a))。耳蜗消融后,MMP-9表达减少许多神经元somata一旦POD1(图1(b))。同时,许多小MMP-9免疫反应性的粒子成为串珠项圈神经元周围等离子体膜(图1(b))。而这些影响被POD1和POD3(数据强劲1(b)和1(c)), MMP-9染色的模式几乎回到POD7的术前状况(图1(d))。尽管组织的大规模错乱造成的听觉神经变性,整体染色密度基本上保持不变在这些flat-embedded部分术后期间检查(数字1(一)-1(d))。负控制osmicated, flat-embedded部分显示现在染色(图1(j)),也没有孵化的主要中和抗体(图1(我))。

来测试假设MMP-9进行再分配,而不是在本地不同退化和reexpression,我们确定的密度MMP-9 semithin部分通过AVCN定量数据的免疫反应性2(一)-2(c))。控制部分的组织,MMP-9被发现不均匀分布在细胞质的神经元(图2(d))。大多数MMP-9免疫反应性的粒子位于ROI₁细胞核附近,其余位于ROI₂质膜(图2(d))。这个比例被POD1倒(图2(d))由于明显降低粒子密度的ROI₁。粒子密度ROI₂并没有改变(图2(d))。测量密度在整个细胞质中,我们发现一个强大的净减少MMP-9免疫反应性的粒子通过POD1(图2(e)(图)相比,控制水平2(e))。同时,MMP-9粒子密度大幅上升神经元周围的神经纤维网(图2(f))。由POD3 MMP-9在POD1看到持续的细胞内分布(图2(d)),有轻微的净增加粒子密度在整个细胞质(图2(e))。染色的神经纤维网POD1相比保持不变(图2(f))。由POD7 MMP-9粒子密度的ROI₁显著增加(图2(d)),返回控制水平。同样,粒子密度的神经纤维网下降到(图恢复控制水平2(f))。没有在ROI检测粒子密度的变化₂在任何的生存时间。

3.2。时间的MMP-2整合后AVCN耳蜗消融

类似于MMP-9, MMP-2重新在AVCN由于感觉传入神经阻滞。在正常成年大鼠,MMP-2显示染色模式让人想起与MMP-9看到。神经元细胞体强烈标记,站在反对一个隐约标记神经纤维网(图1(e))。MMP-9相比,MMP-2反应速度缓慢,感觉传入神经阻滞(数字1(f) -1(h))。POD1, MMP-2染色的模式的变化(图上依稀可见1(f)),但MMP-2水平神经元的胞浆稍微减少了POD3(图1(g))。向POD7,减少(图变得更加明显1(h))。当时,神经元细胞尸体剩下低水平的MMP-2细胞质的免疫反应性。值得注意的是,现在MMP-2染色显示串珠项圈接近神经质膜(图1(h)),也就是说,在大多数这样的衣领下可见MMP-9染色(数字1(b)和1(c))已经消失了。至于MMP-9,整体染色密度在耳蜗消融后基本上保持不变(数字1(e) -1(h))。消极的osmicated控制,flat-embedded部分未能透露任何染色(图1(k))。

测试重新分配的假设的MMP-2 AVCN感觉传入神经阻滞,后的密度MMP-2免疫反应性(数据2(一)-2(c))决心在semithin部分(数据2(g) -2(我))。在控制动物的AVCN, MMP-2不均在神经元的胞浆(图2(g)),在相同的方式作为MMP-9。虽然大多数MMP-2免疫反应性的粒子位于ROI₁在细胞核附近,其余位于ROI₂质膜(图2(g))。耳蜗消融后,粒子密度MMP-2免疫反应性降低逐渐靠近细胞核(ROI₁),而它仍然在ROI的控制水平₂生存时间(图2(g))。逐渐减少的MMP-2 cytoplasmatic ROI的免疫反应性₁从POD1 POD3向POD7(图2(g))导致了反演cytoplasmatic MMP-2粒子密度的比值的ROI₁和投资回报率₂(图2(g), POD7)。平行的净减少细胞质AVCN神经元(图2(h)), MMP-2阳性颗粒的密度增长逐步向POD7神经纤维网(图2(我)),这表明MMP-2从细胞到细胞外领域的重新分配AVCN由于耳蜗输入的损失。

3.3。注射KA

为了确定如果有因果依赖关系而不仅仅是巧合deafferentation-dependent表达式和分发MMP-9和MMP-2时,一方面,和相关的神经移植术GAP-43免疫反应性另一方面,KA是stereotaxically注入VNTB耳蜗消融之前,破坏神经元细胞体驻留在这个核(12]。尼氏小染色确定成功和excitotoxic病变的程度。明显大神经元细胞体描述VNTB(数字3(一)和3(b))。全损的神经元somata VNTB表示一个完整的VNTB神经元的损伤(数字3(c)和3(d))。在一些实验中,然而,由于偏心KA注入,神经元被毁只在部分VNTB而其他地区经历了治疗(数字3(e)和3(f))。控制注射PBS代替KA VNTB未能诱导显著减少Nissl-stained细胞体(没有了)。

3.4。GAP-43模式表达式后耳蜗消融前VNTB病变有或没有

一只健康的老鼠脑干是双边对称的,染色的组织在任何抗原AVCN应该导致一个从左到右的密度比接近于1。无论是在正常动物(对于左派和right-staining密度)也仅在动物接受单方面PBS或注射KA (和左和右染色密度、职责)我们找到一个不对称的AVCN GAP-43染色。在这些情况下,GAP-43染色很低(图4(一)),确认一项研究[12]。负控制省略主要抗体没有任何染色(图4(一)、插图)。由于耳蜗消融,GAP-43染色出现在越来越多的细纤维网络和剑头和身体的同侧的染色密度大幅上涨AVCN一旦POD3(数字4(b)和4(g),左黑条)。由POD7 GAP-43染色是强劲的(数据4(c)和4(g),对黑条),纤维和剑头现在突出。和耳蜗螺旋神经节总是完全切除在当下的研究(不完整的耳蜗病变cp。5]),GAP-43免疫反应性被发现在均匀分布的纤维网络在整个身体的同侧的AVCN组3(数据4(b),4(c)4(h)、黑条)。

KA单方面注射时完全摧毁VNTB消融耳蜗另一方面,之前的崛起GAP-43免疫反应性失败的发生或强烈减少耳蜗病变(数据在任何时间4(d)和4(e))。相应地,ipsilateral-to-contralateral GAP-43-staining强度的比例仍然接近1(图4(g))。当VNTB神经元的人口是不完全摧毁了(图3(e)),异构或片状的模式GAP-43染色后出现在AVCN耳蜗消融(图4(f)),反映出部分完整投影VNTB AVCN。斑片状分布而不是用以缓和GAP-43免疫反应性表明,一些地形秩序必须存在投影。比较黑暗的灰色基调的区域彩色GAP-43区域显示更少或没有GAP-43染色,在同侧耳蜗消融,AVCN显示显著差异(和POD3和POD7职责。图4(h)、阴影酒吧)。

3.5。当然MMP-9调整后耳蜗消融VNTB前完整的病变

时的模式MMP-9免疫反应性研究耳蜗消融后之前的完全破坏侧VNTB,相比没有观察到的差异表达模式后耳蜗消融(比较数据1(c),1(d)与5(b),5(c))。显然,轴突生长与GAP-43 AVCN没有影响deafferentation-induced AVCN MMP-9调整的发展。神经元细胞体,富含MMP-9耳蜗消融前失去了大部分MMP-9由POD3免疫反应性(图5(b)的水平),但回到控制POD7(图5(c))独立于VNTB的状态。

3.6。当然MMP-2调整后耳蜗消融VNTB前完整的病变

通过鲜明的对比,一个前病变侧的VNTB大幅改变的动态MMP-2耳蜗消融(数据驱动5(d) -5(f))。这种变化还没有明显的由POD7 POD3但明显。一方面VNTB前引起的耳蜗MMP-2在AVCN神经元的胞浆表达增加POD7(图5(f))的水平的控制情况下(图5(d)),如果没有发生耳蜗消融了。

3.7。统计评估的时间进程和分销MMP-9和MMP-2耳蜗VNTB消融前无民事行为能力人或者完全损伤

验证在部分观察详细的统计意义3所示。5和3所示。6,染色密度MMP-9和MMP-2免疫反应性神经元的胞浆后耳蜗消融没有或前完成侧病变的VNTB量化通过测量灰色基调的意思。在染色条件病例可能可变性夷为平地通过计算ipsilateral-to-contralateral染色强度的比值。

由POD3 MMP-9染色相比,显著降低了控制(图6(一)左栏)。这种减少发生独立的VNTB是否完整(图6(一)第二条)。由POD7 MMP-9染色已重新控制水平(图6(一),第三栏),又不受VNTB状态(图的影响6(一)第四条)。MMP-2染色相比已经下降了POD3控制水平(图6 (b)左栏)。至于MMP-9发生无论VNTB的条件(图6 (b)第二条)。然而,与MMP-9 MMP-2染色后进一步减少对POD7耳蜗消融(图6 (b)第三条),提供侧VNTB是完好无损。的VNTB损伤,MMP-2染色反弹(图来控制水平6 (b)第四条)。

3.8。MMP-2分布在耳蜗消融后的侧AVCN VNTB前不完全损伤

例一个不完整的VNTB病变打开一个本地的可能性分析MMP-2调整之间的关系和神经移植的GAP-43表达式。我们注意到MMP-2染色的特点的变化模式被耳蜗的地区才会出现烧蚀后7天AVCN GAP-43阳性纤维出现在高密度(图7)。在有利的情况下,一把锋利的边界GAP-43富人和GAP-43贫困地区在AVCN(图7(b))。评估染色模式对相邻部分,GAP-43染色的异质性是忠实地伴随MMP-2染色(数字7(一),7(c)7(d))。定量分析(图7(e)显示之间的显著差异的神经元胞浆染色强度MMP-2对应地区强烈GAP-43染色(图7(c))和弱GAP-43染色(图7(d))。

4所示。讨论

作为一个耳蜗消融诱发总感觉传入神经阻滞在CN,第一个中央提升听觉系统的继电器,其组织重组以复杂的方式。显然,一个巨大的变性的感觉纤维及其突触前末梢发生快速开始,10天内完成32]。当这发生时,重组逐步从变性。重组包括不同阶段的形态和分子整合(11ECM),其中包括广泛的变化。我们想知道MMP-9 MMP-2, ECM调制的关键酶,参与这些过程以及这如何可能参与监管。

本研究的主要发现是三倍。首先,耳蜗消融后,MMP-9 AVCN MMP-2重新排列,这些整合似乎是专门与变性和神经移植,分别。第二,deafferentation-dependent GAP-43阳性纤维抵达AVCN MMP-9没有影响的变化,无论是在耳蜗消融后的早期阶段,当听觉神经纤维及其突触终端AVCN退化,也在随后阶段的神经移植时突触发生。第三,水平和模式MMP-2恢复POD7如果神经移植术是预防控制水平。这些观察表明,MMP-9往往是相关的神经纤维网重组相关纤维和终端退化,而MMP-2主要是参与协助再生和突触发生。

4.1。MMP-9 MMP-2协会与组织动力学在不同Postlesional阶段

我们的数据表明,AVCN传入神经阻滞后,整体无论是MMP-9还是MMP-2表达水平的改变。相反,基质金属蛋白酶都是重新分配在众多AVCN神经元胞质区域附近的核质膜,然后分泌到周围的神经纤维网。我们显示定量osmicated semithin部分。Osmication锇的最低浓度和培养时间,因此没有面具的免疫反应性的结构进行分析。

耳蜗消融后,MMP-9可用性和分布AVCN被最大限度地改变一旦POD1和恢复控制的水平直到POD7(数据1(一)-1(d),2(d) -2(f))。这些整合MMP-9内部和transcellular迁移(图2)发生早期足以暂时退化的事件相关联,也就是说,变性的轴突和轴突终端以及少突胶质细胞。

操纵的投影VNTB通过注射KA AVCN未能影响deafferentation-induced MMP-9的可用性和分布的发展,表明独立性的MMP-9后续重组的神经网络结构所表示的出现在AVCN GAP-43阳性轴突和轴突码头。一起的早期开始变化,从VNTB MMP-9完整性和独立性的AVCN神经移植术表明这个金属蛋白酶,在系统研究了这里,上下文中的行为退化。

MMP-9函数与突触可塑性和长期势差的胞外蛋白水解作用[33- - - - - -36]。然而,我们的数据未能暗示直接MMP-9参与突触发生后由于耳蜗传入神经阻滞的AVCN消融。

发病MMP-2调整略推迟对MMP-9和继续对POD7 MMP-9已经恢复正常。这一次课程不匹配与变性(32),但对应暂时AVCN deafferentation-dependent神经移植的由商务部神经元纤维被GAP-43内容(数据1(e) -1(h),2(g) -2(我),4(一)-4(c))。当GAP-43染色水平最大deafferented AVCN,许多神经somata失去了几乎所有的MMP-2(图1(h))。更重要的是,当轴突被禁止reinnervating AVCN的中央部分,MMP-2染色返回POD7 predeafferentation模式。这表明MMP-2调整的发展的因果依赖AVCN神经元的神经移植术GAP-43含有纤维和剑头。

4.2。VNTB病变的后果在CN GAP-43表达式

尽管恒定体积和浓度的KA注入VNTB,注射部位的半径之间的差异情况下,观察也为其他大脑系统中使用了KA(例如,37])。在目前的研究中我们把这个变化对我们的优势,分析不同大小和位置的病变的系统性后果在AVCN GAP-43染色后耳蜗消融。完整VNTB摧毁所有神经元的损伤可能支配中央AVCN耳蜗消融后举行GAP-43表情控制水平尽管前耳蜗消融。GAP-43的异构分布不完全损伤后免疫反应性在AVCN VNTB展示了与大型VNTB神经元的存活可能商务部神经元轴突投射到AVCN担保物(15]。VNTB神经元的存活族群这一事实不提高GAP-43染色整个AVCN但只在不同的区域显示一个独立看这个投影的地形组织已经建议的跟踪研究(14,38]。我们的研究表明,神经元外侧定位项目内侧AVCN和内侧定位神经元外侧AVCN,脑干的另一侧。

4.3。贡献MMP-9和MMP-2组织动力学在不同Postlesional阶段

我们发现的证据与MMP-9函数AVCN耳蜗消融后的退化阶段。Reeves et al。39]建议的角色MMP-9传入神经阻滞/发芽周期中的单边内嗅皮层损伤后海马。他们发现老鼠收到MMP-9抑制剂未能开发能力长期势差和显示持久的细胞碎片的退化终端不是其次是轴突发芽和突触发生,就像在控制实验。Zhang et al。40]推测upregulation MMP-9后神经损伤可能是组织的一部分努力完成突触重塑。这是符合Reeves et al。39]表明,没有再生启动如果退化阶段仍不完整是由于缺乏MMP-9活动。贡献MMP-9塑造组织结构似乎在神经变性再生和突触发生的先决条件。

MMP-2调整的变化似乎正在AVCN deafferentation-dependent感应的神经移植前。通过蛋白水解乳沟的受体、粘附分子和ECM晶格,附件网站新突触需要暴露(39,40]。发病MMP-2分泌神经移植前AVCN表明MMP-2介导重塑pericellular环境准备的组织反应性突触发生发生(39,40]。

本研究的重要发现是分布的变化后MMP-2 POD3取决于GAP-43包含轴突的存在,生长锥,或新生的突触前末梢,预示着神经移植包括突触发生。众所周知,基质金属蛋白酶参与轴突的指导。例如,广谱金属蛋白酶抑制剂的应用在活的有机体内视网膜神经节细胞导致误入歧途的轴突在发展中视觉系统(41]。基质金属蛋白酶是参与调节生长锥指导线索与受体之间的相互作用通过解理的ectodomains [42- - - - - -44]。未来的方向测试MMP-2的至关重要的作用在轴突生长和突触发生可能的实验包括特定MMP-2抑制剂或MMP-2淘汰赛。

的观察我们的研究与报告一致的含义MMP-2在突触发生和突触重塑通过解理ECM蛋白和层粘连蛋白(45]和brevican [46),以及生长因子如TNF -(47),和脑衍生神经营养因子(48),所有这些对突触可塑性产生深远的影响和突触发生(审查[25])。最终,似乎有感应之间的互惠关系的轴突生长和反应性突触发生,另一方面MMP-2的重组。而感应的神经移植术是需要维护MMP-2响应阶段的AVCN神经移植,MMP-2似乎促进GAP-43-directed轴突生长和突触发生由成型ECM分子,让越来越多的轴突渗透组织和发现他们的目标。

微分功能MMP-9 MMP-2协会还建议的类型和时间一系列特定的免疫反应性的结构。项圈的粒子空间相关神经元细胞体的质膜AVCN传入神经阻滞后被开发利用抗体针对MMP-9(数字1(b)和1(c))或MMP-2(图1(h))。这些串珠项圈让人想起synaptophysin-stained项圈被揭示突触前末梢的戒指4]。当传入神经阻滞导致许多突触前末梢灭亡49],MMP-9积极衣领迅速出现,暗示行动有关衰退的突触前末梢的退化。相比之下,MMP-2-positive项圈被POD7礼物当MMP-9项圈已经消失(数字1(d),1(h))。到那时,神经元GAP-43-positive AVCN开发了项圈的突触前末梢(4,10]。这表明行动的MMP-2特别相关的形成新的突触联系。MMP-2-positive项圈的缺席的情况下在突触发生阻碍AVCN VNTB病变提供强大支持的阅读我们的观察。

Perineuronal网是ECM的专门化,围绕神经元细胞体,抵制结构性变革现有的突触联系服务(50,51]。在神经元数量轴承perineuronal网的神经元AVCN [52- - - - - -54]。Foscarin et al。55]指出增加MMP-9 MMP-2或活动都与减少perineuronal网的完整性。这摇摇欲坠的perineuronal网在深小脑核诱导的小鼠暴露于丰富的环境中,在小脑浦肯野细胞过度表达GAP-43。再一次,这些观察不排除这种可能性,MMP-9 MMP-2差异导致突触发生,也许准备,另协助,发生在成年哺乳动物大脑神经损伤或倾斜。

4.4。结论

我们的数据表明MMP-9和MMP-2搬出神经元细胞体的AVCN耳蜗消融后总感觉传入神经阻滞。我们表明,神经移植后发生听觉神经变性是至关重要的维持和促进MMP-2分布和可用性的变化,但不是MMP-9。在我们的实验模型中,MMP-9函数直接归因于神经突触退化耳蜗消融后,而MMP-2 preactivated AVCN准备神经移植,是补偿功能由于重组deafferented神经元网络,包括轴突和突触发生。

缩写

:	“反”,主要抗体的特异性
美国广播公司(ABC):	Avidin-biotin复杂
方差分析:	方差分析
AVCN:	前腹侧的耳蜗核
c:	对侧的
CA:	耳蜗消融
肤色线:	完整的VNTB KA病变
CN:	耳蜗神经核
中枢神经系统:	中枢神经系统
任务:	控制
d:	背
轻拍:	3.3 -diaminobenzidine tetrahydrochloride
ECM:	细胞外基质
GAP-43:	生长相关蛋白43
我:	身体的同侧的
i / c:	Ipsilateral-to-contralateral比率
iL:	不完整的KA VNTB的病变
卡:	红藻氨酸
l / r:	从左到右的比率
交响乐团:	横向上橄榄
m:	内侧
MMP的:	基质金属蛋白酶
MNTB:	身体内侧核的梯形
商务部:	内侧olivocochlear
ns:	不重要
ν:	核
美国公共电视台	磷酸盐
圆荚体:	术后一天
投资回报:	感兴趣的区域
VNTB:	腹侧核的梯形的身体。

确认

米凯拉费迪李希的接受者Landesgraduiertenforderung巴登-符腾堡州,德国。作者感谢Heika Hildebrandt优秀技术的帮助,妮可Rosskothen-Kuhl深入讨论,和罗兰Laszig持续支持。

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