定向纤维产物从移植胚胎Cortex-Derived Neurospheres成年老鼠的大脑

文摘

神经移植已成为一个有吸引力的替代战略的神经元已经迷失在中枢神经系统。多功能神经祖细胞作为供体细胞可能有用的,退化的地区。移植策略的一个重要方面是移植细胞能够纤维产物,目的是重建大脑内轴突连接主机。为了解决这个问题,我们扩大了皮质的神经祖细胞胚胎第15天无所不在地绿色荧光蛋白表达转基因老鼠neurospheres体外和嫁接到内嗅皮层8-week-old小鼠后立即穿甲弹通路病变。后移植到宿主的大脑的损伤entorhino-hippocampal投影,neurosphere-derived细胞延长长纤维预测针对齿状回。neurosphere-derived的结果表明,移植细胞可能是一个有前途的战略替代丢失或损坏的轴突的预测。

1。介绍

各种神经系统疾病和损伤最终会导致失去功能的神经元之间的连接(轴突病变)或完全丧失的神经元(神经退行性或血管病变)。在两种情况下,受影响的系统将变得越来越不正常导致永久性的功能缺陷。发生这种情况,因为疾病或伤害相关损失的神经元或轴突连接在随后的成年和老年大脑通常不是通过足够的自我修复或适当的重组使轴突连接(1,2]。功能改善的一个重要因素是实现轴突损伤轴突的再生以恢复神经回路(3,4]。

胎儿神经细胞的移植致力于特定的神经细胞表型到适当的网站在大脑受损的年轻或老被发现是有用的对于促进修复中断电路,防止不适当的形成突触重组(5,6]。最近,这是表明胎儿运动皮层移植到成年宿主后,长纤维预测可以具体重建(7]。神经祖细胞似乎也支持自我修复后的成人大脑损伤或疾病(8- - - - - -11]。先锋治疗帕金森病的研究表明,神经前体细胞胚胎的移植确实实现良好的功能恢复的潜力对一些病人来说(12),但主要的伦理问题和实际问题限制使用人类胚胎神经移植(8]。一个重要的替代方法是使用培养的神经干细胞。在以前的研究中,嫁接neurosphere-derived干细胞被证明在几个神经元损伤模型是可行的。所示的移植细胞能够存活很长一段时间和分化成神经元和胶质细胞13- - - - - -16]。此外,neurosphere-derived细胞移植后功能改进已报告在一些研究[17,18]。在之前的体外研究使用organotypic slice-culture entorhino-hippocampal形成,我们已经表明,移植的胚胎大脑皮层能够形成特定的预测海马齿状回的(19]。我们现在扩展这些研究和探索潜在的移植胚胎cortex-derived neurospheres形成纤维预测体内。我们的结果表明,neurosphere-derived细胞移植后的病变穿甲弹路径发达大量纤维投射投影是专门针对主机海马。

2。材料和方法

所有程序涉及动物保健进行符合欧洲共同体1986年11月24日理事会指令(86/609 / EEC)和综述了瑞士当局所允许的。

2.1。准备和维护Neurospheres

从E15胚胎神经干细胞分离时间怀孕小鼠表达Tau-GFP融合蛋白(20.)这是backcrossed C6BF1老鼠作为主机。胎鼠大脑被剔掉,放置在制备培养基(PM)组成的MEM和2毫米glutamax pH值7.3。胚胎皮质两半球解剖。组织切成2毫米的立方体,转移到无菌15毫升管。皮质组织从垃圾集中和转移到新鲜点。解剖组织块冲洗两次点,使胰蛋白酶化15 - 20分钟胰蛋白酶化停止了马血清(四分之一卷)和DNase (0.01%)。然后细胞在台离心机离心5分钟在室温下600 g。颗粒是re-suspended和100000个细胞/毫升无血清完全培养基上培养1 (GM1)表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子(包括10 ng / mL) (21]。GM1由neurobasal介质(Gibco)、葡萄糖(25毫米),L-glutamin(1毫米),B-27补充(Gibco), 0.25毫米Glutamax (Gibco)、青霉素G (50 U /毫升)和链霉素/氨苄西林(50g / mL)。文化,大约7天后细胞已经自由浮动neurospheres。使,球体分离机械,resuspended在同一介质的密度50.000细胞/毫升。台盼蓝排斥表示,这87 - 98%的制备是可行的细胞。

neurospheres-derived细胞的分化潜能被涂镀到poly-L-lysine文化调查菜7天。培养皿中被涂上了50 - 10010g / mL poly-D-lysine,使用10%热灭活FCS为2小时。细胞被播种密度细胞/和分化中孵化(GM1包含脑源性神经营养因子、细胞概念,20 ng / mL)文化是美联储每4 - 6天。

2.2。外科手术

年轻人(16-20-week-old)女性C6BF1老鼠与腹腔内(IP)剂量的氯胺酮麻醉(Intervet、苏黎世0 08 g / kg)和Climasol (Graeub伯尔尼5毫克/公斤)与Temgesic光镇静后(埃塞克斯化学-琉森,0,1毫克/公斤)和阿托品(Sintetica S.A.Mendrisio 0 5毫克/公斤)。麻醉期间,动物被给予皮下(SC)剂量的Metacam (Bohringer殷格翰集团,1毫克/公斤)作为手术后的抗炎剂。老鼠被放置在一个立体定位器和一个洞钻颅骨。wire-knife到立体定位器安装在坐标AP + 0.25毫米,0.05毫米和V0.45毫米以上的耳朵零平面的阿特拉斯·富兰克林和Paxinos [22]。wire-knife被插入在110侧角。4毫米腹侧硬脑膜,电线被收起展开和穿甲弹路径被切割刀3.2毫米。为细胞注入,汉密尔顿针插入0.6毫米后和1.9毫米前囱侧。两毫升neurosphere悬挂与大约100000 - 200000细胞使用汉密尔顿注射器注入内嗅皮层外侧。移植后,伤口被关闭,一个盐溶液注入皮下注射,和激烈的笼子里的老鼠被允许恢复完全清醒时,回到动物设施。

2.3。组织学和免疫组织化学

21天后,老鼠被杀的过量戊巴比妥钠(100毫克/公斤),用4%多聚甲醛灌注transcardially (pH值7.4)。大脑的颅骨被移除和后缀的夜晚。组织学评价,日冕部分30米厚度vibratome被削减,安装在Superfrost +幻灯片(门泽尔,德国)。Neurospheres 7和10天后文化在PLL-coated盖滑落在4%多聚甲醛溶液固定15分钟,洗两次,并保持在0 01 M磷酸盐(PBS)进行进一步处理。Vibratome部分和neurosphere文化孕育了1小时在室温下在屏蔽解决方案包含PBST和3%正常山羊血清第一抗体晚上紧随其后以下使用抗体:兔多克隆抗体对胶质原纤维酸性蛋白GFAP (DAKO) mouse-monoclonal抗体SMI-31对磷酸化神经纤维细丝(斯特恩伯格合并),NeuN mouse-monoclonal抗体-III-tubulin (Chemicon)和兔多克隆抗体对喜欢的《忍者外传2》(微孔)。在PBS 3洗后,部分或细胞培养1小时在室温下与适当的二次抗体(1:250年,Alexa共轭分子探针)在PBST稀释1%的门店在室温下2小时。

3所示。结果与讨论

3.1。Neurosphere-Derived细胞分化为星形胶质细胞和神经元在体外

神经祖细胞从GFP-expressing胚胎分离皮层扩散生长因子的培养基和neurospheres形成的。在体外七天之后,这些细胞形成集群测量约50 - 90米直径(数字1(一)和1 (b))。许多neurospheres呈现包含胶质前体细胞,GFAP(数据未显示)或染色与喜欢的《忍者外传2》(数字1 (c)和1 (d)),通常是位于中央部分neurospheres越多。Tau-GFP表达式如预期是整个neurospheres(数据无所不在地礼物1 (e)和1 (f))。neurosphere细胞健壮的神经元分化的能力是评估通过直接培养neurospheres的衬底(poly-L-lysine)涂层中板块包含分化培养基(GM1 + BDNF)。电镀后一周,许多细胞分化成一个典型的神经元轴突形态,生长锥,树突分枝(数据开始1 (g)- - - - - -1(我))。疣状神经元标记(-III-tubulin),星形胶质细胞(GFAP)(数据未显示),和少突细胞抗原(喜欢的《忍者外传2》)(数据未显示)清楚地显示所有三个的存在中枢神经系统细胞类型分化的细胞来自neurospheres。我们的标准条件下的分化,我们获得了50 - 70%的神经元血统(-III-tubulin), 15 - 20%病患血统(GFAP)和10 - 20%少突细胞谱系(少突细胞祖标记喜欢的《忍者外传2》)由手动计数分离immunolabeled细胞。

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图1

分析neurosphere体外生长和分化。(一)低功率视图(明亮的字段)neurosphere文化。许多cortex-derived neurospheres体外7天之后了。比例尺= 50m。(b) Neurospheres表达Tau-GFP融合蛋白的皮质Tau-GFP转基因小鼠。(c) DAPI染色的neurosphere文化。在培养neurospheres (d),喜欢的《忍者外传2》阳性细胞(红色)通常是位于圆花饰的中心。(e)出现在整个neurospheres Tau-GFP表达式。(f)合并图像DAPI之间,Tau-GFP,喜欢的《忍者外传2》显示喜欢的《忍者外传2》的中心位置在neurosphere阳性细胞。比例尺= 20m。(g)一周后转移到poly-D-lysine-coated盘子,Tau-GFP-positive neurosphere-derived细胞连接和扩展过程。比例尺= 20m。(h)的网络细胞过程从neurosphere-derived细胞如Tau-GFP表达式。(我)染色神经元标记-III-tubulin (H)证实了许多neurosphere-derived的神经元分化细胞。比例尺= 50m。

3.2。移植Neurosphere-Derived细胞分化成神经元和纤维形成预测针对损伤Entorhino-Hippocampal形成

在成年小鼠,穿甲弹路径进行用钢丝刀切除神经齿状回。这种病变的方法展示了以前导致,而完全丧失的嗅传入到海马结构(23]。培养neurospheres是接近病变部位注入内嗅皮层。Neurosphere移植物存活当移植后立即机械损伤。这一发现与之前的研究结果相一致(24,25]。三周后注射,许多neurosphere-derived细胞表达神经元标记NeuN(数据没有显示)。短流程是大部分移植来自四面八方。在11个20例,transplant-derived过程形成的纤维束增长对去神经的齿状回。这样的一个例子纤维束指向齿状回数据所示2(一个)- - - - - -2 (c)。GFP阳性标记可以看到纤维形成一个松散的包,直接朝着齿状回了(数字2(一个)- - - - - -2 (c))。虽然移植细胞的GFP-expression允许纤维束清晰的标识,这是不足以解决个人再生纤维和大功率的目标。在图3,强GFP-positive束。标签与SMI-31神经纤毛抗原主要出现在轴突(26),表明该包包含transplant-derived轴突(数字3(一个)- - - - - -3 (d))。进一步的例子GFP-positive纤维束的移植数据所示4(一)- - - - - -4 (c)。的纤维束定向的方式向齿状回(箭头人物4(一)- - - - - -4 (c))。这个包也SMI-31积极(图4 (b))。所示的例子中,形成的纤维束是专门针对主机齿状回。虽然大部分的这些轴突达到海马裂的面积,他们没有分支广泛的外齿状回分子层(数据4(一)- - - - - -4 (c)),而是停在海马裂的面积。优惠增长向观察齿状回在所有情况下显示纤维产物,也就是说,在11个20移植。

(一)

(b)

(c)

(一)
(b)
(c)

图2

neurosphere移植后3周的生存。移植位于内嗅皮层(EC),和一个强大的纤维束指向齿状回。GFP阳性标记纤维主要在海马裂的面积停止。(一)DAPI染色。比例尺= 100m。(b) GFP标记neurosphere移植与纤维束。(c)相结合的形象。

(一)

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(c)

(d)

(一)
(b)
(c)
(d)

图3

投影neurosphere-derived细胞向损伤entorhino-hippocampal形成。(a)一个强大transplant-derived GFP-positive纤维束延伸对海马齿状回的外分子层的面积。比例尺= 50m。(b)结合GFP的形象和SMI-31确认GFP-expressing纤维束(箭头)包含SMI-31-positive轴突。(c)的高放大GFP-positive纤维(箭头)移植领域的海马裂和外齿状回分子层。比例尺= 100m。(d) SMI-31 GFP-positive纤维的染色(箭头)移植。

(一)

(b)

(c)

(一)
(b)
(c)

图4

另一个投影neurosphere-derived细胞向损伤entorhino-hippocampal形成。齿状回的位置在a - c (DG)表示。(一)——(c) GFP-positive纤维束在海马裂coexpression SMI-31。纤维在海马裂区域结束。(一)Tau-GFP。比例尺= 50m。(b) SMI-31染色。(c)相结合的形象。

neurosphere移植的一个重要方面是检查是否接枝neurospheres有肿瘤形成的倾向在大脑受伤的年龄(27]。为了排除肿瘤形成的生存期间,我们对血管性血友病因子的表达在5移植后3周。这些疣状产生负面结果(数据没有显示)。负免疫染色和血管性血友病因子在癌症表观遗传对血管生成的影响表明,移植在3周没有引起肿瘤组织(27,28]。这并不排除一个长期移植细胞的致瘤的潜力。

4所示。结论

在这项研究中,我们审查的潜力不成熟neurosphere-derived神经祖细胞内形成纤维预测成年老鼠的大脑。在某些情况下,移植细胞长纤维投射似乎是选择性的,专门针对去神经的齿状回。大多数这些纤维到达海马裂但入侵外观察齿状回分子层。我们的研究结果显示,未成熟的神经细胞在文化传播有可能延长一个去神经的纤维投射指向目标区域。

4.1。移植Neurospheres分化成神经元和不成熟的神经元前体细胞的来源的移植

近年来neurosphere文化(29日,30.)已成为一个有吸引力的未成熟的神经细胞来源的神经移植。使用培养neurospheres减少与移植相关的伦理问题和实际问题的新鲜人类胚胎材料(31日]。在这项研究中,我们使用neurospheres源自E15小鼠胚胎的大脑皮层。一如预期,neurospheres产生神经元和神经胶质细胞的混合人口一直在前面描述的(30.]。为目的的移植,这种混合分化的细胞可能的优势,因为移植神经元的存活和分化可能刺激的神经胶质细胞移植。

我们已经分析了neurosphere-derived的分化细胞在体外。我们发现SMI-31阳性细胞也显示神经元的形态特征确认好这些细胞对神经元分化的潜力。这是兼容的神经细胞表型与发现neurospheres-derived细胞显示未成熟神经元的电生理特性(32]。Neurospheres培养从胚胎大脑皮层从而似乎是一个有前途的神经前体细胞来源,适合移植的研究。

4.2。大量纤维产物从成人大脑的神经前体细胞移植

在这项研究中,我们观察到大量的纤维产物的神经前体细胞移植neurosphere-derived指向,达到适当的目标地区。据报道,在一些先前的研究,过程结果相当稀疏嫁接神经元移植到成年后大脑。使用胚胎多巴胺前体良好的纤维细胞移植后只能实现产物为年轻产后主机,而不是成人主机(33]。这是在与一般随着年龄的增长而下降和再生轴突的结果(34]。良好的轴突结果和长期形成的功能连接后被报道一条神经祖细胞移植到新生儿的大脑(35]。只有很少的报道好的纤维产物后移植到成年宿主。当胎儿海马细胞被注入到CA3区海人acid-lesioned成年老鼠,预测移植到了CA1区和齿状回(6]。在我们的实验中,存活时间的三周后,在一些情况下移植细胞发出一声纤维束和扩展向齿状回。这是在协议与最近的一项研究[7)展示了广泛的胚胎移植后纤维产物成年老鼠的大脑运动皮层。我们的观察,许多transplant-derived轴突停在了海马裂可能是由于抑制线索,这阻碍轴突穿越边境。嗅轴突穿越海马裂的失败与突变在啮齿动物reelin基因,SRK鼠(36),和卷取机鼠标37]。

4.3。移植神经前体Neurosphere-Derived细胞轴突修复的潜力

最近,neurosphere移植被认为是一个潜在的治疗方法缓解老年性神经退行性疾病(38]。在先前的体外研究中,我们可以表明,胚胎cortex-derived轴突形成特定的投影entorhino-hippocampal片齿状回的文化,和这个特定的投影形成不分地区来源的胚胎皮层(19]。鼓励这一发现,我们现在使用更加成熟neurosphere-derived神经元前体细胞和能证明这些细胞移植到损伤后大脑的确能产生纤维的结果预计在相当远的距离对适当的去神经的目标区域。这项研究的结果表明,移植neurospheres可以形成纤维束在成年人的大脑,neurosphere文化可能是一种很有前途的和方便的神经元前体细胞来源的神经移植。

确认

作者感谢教授。Cordula尼奇和Olga Bollag女士与外科手术的帮助和支持,马库斯sax技术的帮助,和约翰·梅森博士Tau-GFP转基因老鼠的慷慨的礼物。这项工作是由瑞士国家科学基金会(SNF)批准号3100 a0 - 100578。

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