5-Lipoxygenase DNA甲基化和信使rna含量年轻和年老老鼠的大脑和心脏

文摘

5-lipoxygenase的表达(5-LOX)是影响衰老和受表观遗传机制包括DNA甲基化。我们使用methylation-sensitive限制内切酶(AciI, BstUI、HpaII HinP1I)评估5-LOX DNA甲基化在大脑和心脏组织样本(2个月),老少(22个月)老鼠。我们还测量了mRNA 5-LOX和DNA甲基转移酶的内容DNMT1 DNMT3a。在年轻的老鼠,5-LOX信使rna含量也显著大于心脏与大脑;5-LOX DNA甲基化是较低的,除了在AciI试验它更高的心脏。老化减少5-LOX信使rna含量增加心脏和大脑。老化也增加了5-LOX DNA甲基化和这个影响站点——(即。、酶)和组织。一般来说,DNMT1和DNMT3a信使rna含量较低的大脑区域相对于心;唯一的老化效应观察DNMT3a的信使rna含量,减少在老老鼠的心脏。这些结果表明复杂的组织和aging-dependent DNA甲基化系统和5-LOX信使rna相互作用的内容。 Interpretation of this data must take into account that the tissue samples contained a mixture of various cell types.

1。介绍

5-lipoxygenase (5-LOX;EC 1.13.11.34;由ALOX5基因编码)是关键酶生物合成的脂质信号分子,即炎症白细胞三烯和抗炎lipoxins [1,2]。5-LOX系统被认为是炎症的关键球员之一(3),心血管系统的重要途径(尤其是在动脉粥样硬化)4,5),和一个假定的调制器的中枢神经系统(CNS)功能和病理学6- - - - - -8]。此外,5-LOX通路已经被认为是神经可塑性的机制从神经发生和神经分化(9)调节突触可塑性(10,11]。例如,代谢物源自5-LOX活动涉及长期萧条的表达在海马切片(10]。

相信nonleukocyte白细胞三烯的合成不需要5-LOX在中枢神经系统和心脏,可以通过transcellular产生白细胞三烯生物合成途径(12,13]。然而,有证据表明5-LOX表达在这些器官/系统(6,14- - - - - -16]。因此,调节大脑的表达5-LOX参与神经保护机制(8]。在大鼠和小鼠的中枢神经系统,5-LOX表达式中增加老化(14,17)在脑缺血(18,19]。在人类的大脑,5-LOX蛋白质含量升高在阿尔茨海默病(7,20.和应对缺血21]。在心脏,5-LOX内容似乎心脏重塑过程中保持稳定(16),但可以通过饮食改变修改(22]。此外,在心脏,心肌细胞,药物如他汀类药物和thiazolidinediones引发抗炎过程和提高生产的抗炎lipoxins取决于5-LOX,尤其是5-LOX磷酸化的状态(15,23]。

5-LOX基因表达调控的表观遗传机制包括修改DNA甲基化的1,24- - - - - -26]。实验胚胎学包括染色质结构的修改,导致基因表达的调节和表型。表观遗传修饰进一步受到环境的影响(“生活经验”),通常是持久的,有时是可遗传的。最近,表观遗传机制已经与精神疾病的病理学27]。因此,DNA甲基化的网站CpG二核苷酸与基因调控在几乎所有的组织,包括大脑(28]。Siegmund et al。28]研究人类大脑皮层样品老化对象,发现进步aging-associated上升的DNA甲基化CpG岛某些中枢神经系统基因,通常结合相应的mrna水平下降。这些作者得出的结论是,DNA甲基化是人类大脑皮层动态监管的整个生命周期,包括分化神经元,并影响很大一部分主要由增加与年龄相关的基因。此外,数据可以在表观遗传机制和心血管基因调控。例如,观察到基因组DNA甲基化在冠状动脉疾病患者明显高于在控制29日]。

被假定5-LOX途径可能参与某些心脏和大脑疾病的共病(30.,31日]。此外,它提出了比较研究的心脏和大脑组织从同一科目将改善的努力在这个领域的研究(32]。在这里,我们调查是否老化影响大脑和心脏5-LOX信使rna和DNA甲基化水平。因为老鼠被用于许多5-LOX-related实验模型,包括5-LOX-deficient老鼠,我们研究了老鼠的组织样本。然而,中枢神经系统的表观遗传研究的一个难题,不仅在于cell-specificity heart-expressed基因的表观遗传机制,而且在他们的种特异性。因此,人类5-LOX基因是10号染色体上,而在鼠标是6号染色体上。比较的DNA区域5-LOX启动子和外显子1(1844元、人力;1937元、鼠标),我们发现132 CpG二核苷酸在人类,只有59老鼠基因的启动子区域。研究该区域的甲基化状态,我们使用我们的最近开发methylation-sensitive限制性内切核酸酶测定(33]。由于DNA甲基化取决于DNA-methyltransferases (DNMTs),我们调查的组织内容mrna DNMT1和DNMT3a维护,和新创分别DNMTs [34]。

2。材料和方法

2.1。组织样本

两个月(年轻),22个月大(老)男性C57BL / 6 j小鼠获得的国家老龄研究所(马里兰州贝塞斯达)。他们被安置在4 - 6组在温度控制的房间,可以免费获得实验室食物和水。小脑、额叶皮质、海马和心脏(统一的顶端部分被选为来源心室细胞(35)组织得到致命的麻醉(160毫克/公斤氯胺酮;σ,圣路易斯,密苏里州)和transcardial灌注0.9%冰冷的盐水去除血液细胞(即。从右心房,直到流出很清楚)。实验协议是动物保健委员会批准的机构。

2.2。RNA隔离和实时PCR (qPCR)

总RNA提取使用化学分离方法与试剂盒试剂(表达载体,卡尔斯巴德,CA)制造商的指示。为了消除可能的DNA污染,已经没有DNA RNA样本处理DNase试剂、细胞(Ambion, Inc .,奥斯汀,TX)。总RNA (3g)与200 U的反向转录克隆Moloney小鼠白血病病毒(M-MLV)逆转录酶(Gibco BRL,卡尔斯巴德,CA)。的执行qPCR Stratagene Mx3005P qPCR系统(Stratagene拉霍亚,CA)使用Maxima SYBR绿色qPCR大师混合(Fermentas,格伦小溪,MD)两步循环协议描述的制造商。最初5分钟变性紧随其后40周期95°C的变性15秒和退火/伸长60°C 1分钟。表1显示引物序列用于检测5-LOX DNMTs,还有mrna(引物是从综合购买DNA技术,Inc .,珊瑚镇,IA)。为验证目的,放大产品的above-noted基因在琼脂糖凝胶上运行。对于每个产品,我们得到一个预期大小的乐队(数据没有显示)。此外,5-LOX PCR产品被测序验证。反应进行了使用三种不同浓度(12.5,25、50 ng)的反向转录材料(每个样本一式两份)。还有qPCR结果归一化对相应的内容。数据是在单位计算变异系数(36]。

2.3。液态氧DNA甲基化分析

从above-noted组织提取基因组DNA。他们均质均质化缓冲(100毫米氯化钠,10毫米Tris-HCl pH值8.0,25毫米EDTA, 0.5% SDS, 0.1毫克/毫升蛋白酶K), 100年l每10毫克的组织,培养4 - 5小时37°C。DNA与苯酚纯化,phenol-chloroform (pH值8.0),用异丙醇沉淀,溶解在H₂o . DNA甲基化分析设计如下:的promoter-exon-intron结构亩骶5-LOX基因被调整重建5-LOX (ALOX5) mRNA (NM_009662)启动子,翻译区(UTR)和部分编码区序列(AF393814)老鼠基因组序列。本程序确定一系列约53 kb。虽然老鼠5-LOX基因启动子不包含典型的CpG岛,鼠标5-LOX启动子-UTR-first外显子,相邻基因内区部分,的基因包含C和G密度最高。的UTR-first外显子和相邻的基因内区地区(包含519个核苷酸)包含66%的C和G核苷酸。此外,该区域包含41 CpG二核苷酸;14个位于上游的ATG翻译开始密码子和27下游(图1)。多个methylation-sensitive核酸内切酶识别网站位于那部分。因此,我们研究了甲基化率(即。,upstream and downstream from the ATG translation start codon) with the aid of four methylation-sensitive endonucleases—AciI (),BstUI (),HinP1I ()和HpaII ()(各自的识别序列切割网站显示在括号)。测量5-LOX DNA甲基化水平,我们使用了限制digest-quantitative PCR (SYBR绿色RD-qPCR)。所选方法运用的能力methylation-sensitive内切酶消化只有unmethylated识别网站,和他们无法按照网站与甲基化胞嘧啶。因此,如果目标* CpG甲基化,这个网站是屏蔽酶核酸内切酶的活动,因此,大量的模板可供Taq DNA聚合酶的作用。执行分析如下:1克基因组DNA是用于限制为四种内切酶消化反应。消化的DNA样本稀释用水和一个整除(100 ng DNA)是用于qPCR (Stratagene) Maxima SYBR绿色qPCR大师混合(Fermentas)根据制造商的协议。以下引物被使用:前进-agagaaggatgcgttggaaggt -和反向-gactccgggcaagtgagtgct -。这些引物扩增238元地区上游的第一ATG翻译起始密码子。这个区域包含两个识别网站为每个4内切酶分析选择。引物的exon-intron如下部分:前进-agtcatgccctcctacacggtca -、反向-agtcatgccctcctacacggtca -。他们放大344个基点的片段。输入控制,我们使用了394元地区第一个内含子,因为这个区域不包含所选methylation-sensitive识别网站内切酶。这个区域与以下引物:放大-tgatgtggctggcctcttatgtga -、反向-actgggactgagtgcaggaaatgt -。qPCR反应运行2不同的引物集(目标和输入)在不同管和变异系数相对数量的目标序列计算(36]。的一个例子如图qPCR分析性能2。

图1

鼠标5-LOX启动子的序列UTR第一exon-intron地区受到methylation-sensitive核酸内切酶分析四个endonucleases-AciI, BstUI HinP1I, HpaII。黄色高亮显示第一外显子包括起始密码子(ATG,红色)。四个endonuclease-targeted methylation-sensitive核酸内切酶识别网站突出了四个不同的颜色。选中的DNA序列包括2 AciI-sensitive网站(上游的起始密码子)、6 BstUI-sensitive网站(2起始密码子的上游和下游4),8 HinP1I-sensitive网站(6 2上游和下游的启动密码子),和3 HpaII-sensitive网站(2上游和下游的启动密码子)。用于定量PCR扩增引物地区有下划线,使用引物如下。启动子-UTR:向前=aga棉酚gga tgc gtt gga aggt -和反向=广汽太极拳ggg caa gtg agt gct -;exon-intron:向前=agt猫gcc ctc cta cac ggt ca -和反向=agt猫gcc ctc cta cac ggt ca -。输入控制,我们使用以下引物:=tga tgt ggc tgg有条件现金援助ctt atg tga -反向=行动ggg呕吐tgc gg aaa tgt -行动。

(一)

(b)

(一)
(b)

图2

SYBR绿色RD-qPCR分析的一个例子5-LOX DNA甲基化(见图表获得10小脑样本)。样本与methylation-sensitive消化内切酶(AciI, BstUI、HinP1I HpaII)中描述的材料和方法。启动子- PCR反应UTR(10个样本:AciI =蓝色,BstUI =红、HinP1I =绿色,和HpaII =灰色)和相应的输入控制区域(黄色所示)进行了单独的管道。面板显示了离解曲线数据,这表明只有一个PCR产物的存在(峰值)为每个特定的引物(荧光(一阶导数的原始荧光读数乘以)轴与PCR产品熔化温度(°C)在x轴上)。面板B显示的例子用于计算定量数据的放大图(放大块荧光(baseline-corrected原始荧光)在x轴上的轴与周期数)。在这个试验,阈值周期成反比的日志最初的拷贝数。换句话说,最初模板存在越多,所需的周期数越少的荧光信号检测背景之上。

2.4。统计数据

统计分析,我们使用SPSS软件(版本12.0)。数据分析通过单向方差分析Dunnett紧随其后的多重比较检验,或由一个独立的样本以及。结果表示为均值±S.E.M.从5到10的动物。的值被接受为显著。

3所示。结果

图3表明5-LOX mRNA的表达水平心脏组织在脑组织大约50倍。类似于先前公布的数据,我们发现在老化,大脑5-LOX内容(例如,小脑和额叶皮质)增加。然而,在心脏,老化导致显著降低5-LOX mRNA水平(图3)。

图3

^{* *} 5-LOX mRNA水平心脏和大脑组织年轻和年老的老鼠。5-LOX mRNA的内容的组织(丽江,开酒吧)和老少(22个月大,关闭酒吧)老鼠是通过实时PCR来衡量的。结果归一化对还有相应的mRNA内容和提出单位(变异系数值放大了1000倍,有关详细信息,请参阅文本)。数据表示为均值±S.E.米();*和在年轻(和相应的值以及)。

使用5-LOX DNA甲基化分析,基于能力的methylation-sensitive内切酶消化只有unmethylated识别网站,我们发现四个endonucleases-AciI BstUI HinP1I, HpaII-revealed微分组织——和brain-region-specific 5-LOX DNA的甲基化状态(图4)。DNA区域的目标AciI更心脏与大脑中甲基化;而DNA区域的目标BstUI, HinP1I, HpaII更在大脑中甲基化(额叶皮层和海马但不是小脑)比心脏(图4)。老化通常增加5-LOX DNA甲基化,但这种影响是微分的DNA区域研究,组织/器官的类型(例如,心脏和大脑),我们的大脑区域调查。专注于启动子-UTR区域(图4),我们发现老化的影响在地区AciI的目标,BstUI, HpaII但不是HinP1l。因此,甲基化水平化验AciI和BstUI增加衰老组织研究,而研究的甲基化水平只在海马体HpaII增加。关注exon-intron地区,我们发现老化增加甲基化DNA地区只有在大脑中,只有敏感BstUI(单位如图4(双尾以及);额叶皮质:年轻= 11014日,老= 163±14日,;海马:年轻= 86±8岁= 136±17日,;小脑:年轻= 36±6,老= 58±10 n。;心:年轻= 42±20日老= 54±10;ns,)。

(一)

(b)

(c)

(d)

(一)
(b)
(c)
(d)

图4

1 ^{* * * * *} 老化的影响在该地区启动子- 5-LOX DNA甲基化UTR。四endonucleases-AciI methylation-sensitive酶测定,BstUI, HinP1I, HpaII-was执行文本和表示在图中描述。心脏和大脑(C:小脑,FC:额叶皮质,H:海马)组织样本来自丽江老鼠(开放酒吧)和22个月大的老鼠(关闭酒吧)。结果表示为单位(变异系数值乘以1000倍,有关详细信息,请参阅文本)和显示为±S.E.米(心脏、C和H:;舰队指挥官:)。*,,在样本2个月大的老鼠和相应的值(以及)。

DNMT1和DNMT3a mRNA的内容(维护和新创DNMTs、职责)通常是更大的心脏与大脑,尤其是DNMT3a mRNA(图的内容5)。唯一aging-associated区别我们观察到的是DNMT3a信使rna含量的减少年老和年轻老鼠(图的核心5 (b))。

(一)

(b)

(一)
(b)

图5

^# DNMT1 (a)和DNMT3a (b)的mRNA水平心脏和大脑组织年轻和年老的老鼠。DNMT1的内容/ DNMT3a mRNA在年轻和年老老鼠的组织是通过实时PCR来衡量的。结果归一化对还有相应的mRNA内容和提出单位(变异系数值放大了1000倍,有关详细信息,请参阅文本)。数据表示为均值±S.E.米()。注意,只有aging-associated DNMT3a信使rna含量的差异观察心脏(,以及)。DNMT mRNA的内容一般都是更大的心脏与大脑;*和*心中与相应的值在同一年龄组(Dunnett测试)。

4所示。讨论

符合之前的报道(14),我们确认5-LOX mRNA表达在老鼠大脑,尽管水平明显低于5-LOX mRNA水平以心脏组织。我们还证实,老化的大脑5-LOX信使rna含量增加。与大鼠的脑组织在我们以前的工作,我们发现了一个aging-associated 5-LOX小脑和海马体(37]。与老鼠在这项研究中,我们发现了一个aging-associated 5-LOX小脑和额叶皮质,但不是在海马体。这些差异似乎没有与(例如,老鼠和老鼠)因为别人发现老化增加5-LOX表达小鼠海马但不是在小脑和大脑皮层14]。这些差异的原因是不明显的,但考虑到公认的表观遗传调控5-LOX表达式,很可能个人生活经历的各种旧殖民地啮齿动物可能导致带有蚁穴aging-modified表观遗传调节5-LOX表达式。不管观察到的地区差异,所有先前的研究(14,17,37),我们目前的结果是一致的(即方向。,increase) of aging-associated changes in brain 5-LOX expression. In contrast to the observed effects of aging in brain tissue, we found that in heart tissue aging was associated with a decrease in 5-LOX mRNA content. To our knowledge, this is the first time that heart 5-LOX expression has been investigated in the context of aging. Previous studies reported that 5-LOX content in the heart remains stable during cardiac remodeling [16),但可以通过饮食改变修改(22]。另一方面,在主动脉5-LOX蛋白质含量显著增加与成人相比,老(24个月)(6个月)的老鼠38]。

DNA甲基化是表观遗传机制参与基因表达的调控,包括老化和组织表达的影响。我们观察到心脏,它表达了约50倍5-LOX mRNA水平比大脑的DNA区域BstUI,甲基化HinP1I, HpaII低于那些在大脑中。通常,近端启动子的甲基化含有高密度的CpG二核苷酸(CpG岛)会导致长期的基因沉默。

人类5-LOX相比,老鼠5-LOX DNA序列缺少典型的CpG岛。nonisland CpG位点的甲基化状态似乎同样相关的基因调控(39]。例如,坂本等。40)报道,tissue-dependently和差异甲基化区域不成比例的分布在nonisland CpG位点,这些位点是位于不仅在区域的基因也在intronic和nongenic地区。鼠标5-LOX启动子-UTR序列具有相同数量(即。,2) of recognition sites for each of the four endonucleases used in our assay. Nevertheless, the effect of aging on this 5-LOX DNA sequence was extremely heterogeneous. For example, aging did not affect the methylation status assayed at the HinP1I sites, it only affected the HpaII sites in the hippocampus and produced a similar effect on AciI and BstUI sites in all tissue samples studied. On the other hand, the exon-intron sequence has 4 BstUI, 6 HinP1I, 1 HpaII, and 1 AciI site. However, the only effect of aging in this 5-LOX DNA sequence was observed in brain tissues and only in BstUI sites.

DNA甲基化的模式取决于酶如DNMTs,特别是DNMT1参与维护的DNA甲基化模式和DNMT3a导致新创DNA甲基化为主。衰老与改变有关DNMT活动(41)和表达(28]。尽管DNMT1的表达和DNMT3a显示一些组织和地区差异,我们没有观察到主要aging-associated mRNA水平这两个酶的改变,唯一的例外是降低DNMT3a信使rna含量老老鼠的心脏。然而,这一发现并不排除的可能性aging-altered DNMT大脑的活动。此外,多个酶机制参与确定DNA甲基化的模式,包括DNA-demethylases [42]。例如,最近的研究表明,神经活动能够引起表观遗传的DNA脱甲基作用[43),它还有待调查这个过程是影响衰老和是否可以改变5-LOX DNA甲基化在缺乏重大DNMT变化。

进一步的研究需要阐明如果5-LOX DNA甲基化的观察到的变化可以扮演一个角色在aging-associated修改组织5-LOX mRNA水平。等功能作用,DNA甲基化状态会影响各种methylation-sensitive监管因素的绑定(例如,转录激活物和阻遏蛋白)。我们受到5-LOX DNA序列用于我们的实验(图1)分析软件搜索转录因子结合位点(TFBIND),它使用转录因子数据库中的权重矩阵TRANSFAC R.3.4。(44]。这一分析,随着可用文献的调查,表明在该地区上游的鼠标5-LOX ATG起始密码子,可能是转录因子:AHR / ARNT NMYC, E2F, AP4, AP2,普遍服务基金,SP1。编码区,假定监管因素包括AHR / ARNT,普遍服务基金,ELK1, HSF1, HSF2, ARP1, RFX1, GATA1, AP4, E2F, ARP1。然而,我们必须考虑到我们在这项研究中使用的组织样本中细胞的混合物,5-LOX mRNA和5-LOX DNA甲基化之间的联系可能取决于细胞类型。固有的研究组织样本相对于细胞培养是研究5-LOX DNA提取组织样本来源于两个5-LOX mRNA-expressing和mRNA-nonexpressing细胞。这个技术限制负面影响的能力直接相关的信使rna和DNA甲基化状态的内容。同样,细胞类型可能是决定性的决定5-LOX代谢物的类型(例如,白细胞三烯与lipoxins)生产。

尽管白三烯的合成可能发生在中枢神经系统和心脏通过transcellular生物合成途径,认为不需要5-LOX表达式(12,13在海马体[],aging-increased白三烯的合成14和主动脉38似乎与5-LOX表达增加有关。建议在中枢神经系统,代谢产物来源于5-LOX活动可能会影响神经可塑性,如海马长期萧条的表达(10]。此外,它已经建立,白细胞三烯的生物效应在中枢神经系统8)和心脏(23检测不到发炎)可以抵消迹象5-LOX代谢物lipoxins。没有数据可对老化的影响中枢神经系统和心脏lipoxins的生产。这些信息似乎需要一个完整的理解的生物影响5-LOX aging-altered表达式的大脑和心脏。

总之,我们发现,除了改变5-LOX信使rna含量心脏和大脑组织老化增加5-LOX DNA甲基化,而且这种影响是DNA-site和组织。必须强调,我们在组织样本的结果包含一个混合的各种细胞类型和进一步洞察功能影响DNA甲基化的5-LOX mRNA表达需要程控定向研究。例如,一种可能性是专注于脑组织神经元DNA样本通过应用神经核的方法隔离(45]。

确认

这项工作得到了国家老龄研究所,批准号R01AG015347-05A2(莫莱森)。作者感谢Tolga是乌斯帮助获取组织样本。

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