微分感应水平与长期势差的柱状表面的连接层二世内嗅皮层细胞

文摘

内嗅皮层(EC)是一个节点和独立的助记符元素的内侧颞叶的记忆电路形式大脑皮层和海马之间的双向接口。在欧盟内部,内部,inter-lamellar联想的连接通过水平和柱状发生预测,分别。我们进行了一个比较研究这两个输入的收敛在EC层二世在成年大鼠细胞使用全细胞修补技术电子商务水平切片制备的最深层次(第5)被切割出来。第三层的电刺激我和GABA封锁期间允许我们研究兴奋性突触特性和可塑性在水平和柱状纤维系统,分别。通路AMPA展出和门冬氨酸受体介导的传输和后都表现出长期势差(LTP)高频(强直)刺激。LTP的水平,但不是在柱状通道,被NMDA受体拮抗。有趣的是,LTP的似乎是由突触的增加这可能是耦合不同的第二信使途径。因此,肤浅的兴奋水平和柱状关联路径层二世有发散机制LTP可能赋予欧盟比此前认为的更加复杂和动态处理特点。

1。介绍

内嗅皮层(EC)是一个著名的组件内侧颞叶的记忆系统。浅层(II和III) EC接收大量输入的多通道感知联想的皮层和领域,反过来,项目海马结构的所有条件。海马体的输出站,包括CA1和菌丝层,项目的深度层内嗅皮层(VI & V),往复式输入通道(<一个href="#B1">1,<一个href="#B2">2]。因此,欧盟作为一个大脑皮层和海马结构之间的双向接口,因此形成一个节点cortico-hippocampo-cortical循环的一部分,是大脑的硬件为陈述性记忆的形成。

欧共体在内存中处理的重要性,然而,被认为是超越与海马体的互联。一个建议是,欧盟和其他海马旁的地区作为临时记忆存储hippocampal-dependent记忆是至关重要的正常处理(<一个href="#B3">3]。行为的研究表明,病变涉及欧共体紧随其后在哺乳动物学习和记忆的赤字(了<一个href="#B4">4])。的确,早期组织从老年痴呆症患者记忆障碍的亚临床表明神经退化的表层EC专门(<一个href="#B5">5,<一个href="#B6">6]。还有其他的研究表明,胚胎嗅皮质移植部分改善赤字在成年大鼠的空间记忆与EC病变(<一个href="#B7">7]。也许最有力的证据为一个独立的角色EC的内存是嗅皮质细胞的数量证明持久的活动延迟阶段的记忆任务相关信息的保留必要的执行在随后去阶段(<一个href="#B8">8,<一个href="#B9">9]。的确,嗅细胞也展示内在的“存储器像”持续放电特性依赖于联想的兴奋性输入和胆碱能神经调节(<一个href="#B10">10]。

兴奋性突触可塑性的glutamatergic反应,通过长期势差(LTP),提出了作为一个潜在的学习和记忆的机制。最常见形式的研究涉及一个门冬氨酸受体依赖的过程,突触后Ca^{2 +}通过这个ligand-gated涌入通道诱发变化通过一系列细胞内第二信使(通常从钙/ calmodulin-dependent激酶:CaMKII),导致增强的神经传递<一个href="#B11">11]。我th一个s also been shown that LTP can occur through non-NMDA dependent triggers such as activation of either voltage-dependent calcium channels or metabotropic glutamatergic receptors which can also lead to increases in Ca^{2 +}流入和LTP可能通过重叠的细胞内机制(<一个href="#B12">12- - - - - -- - - - - -- - - - - -- - - - - -- - - - - -- - - - - -<一个href="#B14">14]。此外,non-CaMKII-dependent过程也被阐明(<一个href="#B11">11,<一个href="#B15">15,<一个href="#B16">16]。尽管可能不同的细胞诱导机制,所有上述被认为表达他们的影响主要是通过突触后更改AMPA-type谷氨酸受体,导致增强的响应能力。改变突触前释放(由于新关系的发展和增强释放机械)也被认为扮演一个角色(了<一个href="#B11">11,<一个href="#B15">15])。

存在不同形式的LTP似乎涉及到一个完全不同的诱导和表达机制。这种形式,首先阐明在长满苔藓的纤维在海马CA3锥体神经元的输入,不需要NMDA受体激活或增加突触后Ca^{2 +}(<一个href="#B17">17]。感应的轨迹和表达这种形式的LTP是突触前<一个href="#B18">18- - - - - -- - - - - -- - - - - -- - - - - -- - - - - -- - - - - -<一个href="#B20">20.),包括突触后接受没有变化。这个假定增加神经递质释放伴随明显和持久降低paired-pulse便利化率(<一个href="#B18">18]。

LTP的EC细胞机制仍然可以理解。现场的录音LTP现象在层已报告二世和一些有趣的差异深和表面的联想的通路已报告(<一个href="#B21">21,<一个href="#B22">22]。到目前为止,没有研究评估,在相同的表面层II细胞,LTP的微分性质在这两个重要的途径。这里,使用whole-cell-recording技术,我们调查了生理学、药理学和可塑性水平和第二柱状联想输入层细胞在体外使用完整的细胞技术准备。这些结果之前发表在抽象形式(<一个href="#B23">23]。

2。材料和方法

2.1。一般

大脑切片是由男性Long-Evans老鼠(100 - 200 g)使用标准程序(<一个href="#B24">24]。所有方法符合准则建立的加拿大委员会动物保健和神经科学学会。动物很快被斩首,大脑迅速删除,封锁,并放置在寒冷(4 - 6^°C)正常林格氏溶液含有含氧(毫米):5 124氯化钠,氯化钾。1.3不₂阿宝₄2.0 CaCl₂2.0 MgSO₄26 NaHCO₃和10个葡萄糖(pH值7.4,通过气体饱和度95% O₂&有限公司5%₂)。水平切片retrohippocampal地区被削减的厚度400使用vibratome m(美国加州Pelco,整理)。至少一个小时后恢复期间他们淹没在正常的林格氏室温(23^°C-25^°C),个人片被转移到一个记录室位于舞台的直立,fixed-stage显微镜(Axioskop,蔡司)。片被淹没,包括不断饱和(95%啊₂+ 5%股份有限公司₂)解决方案包含(126毫米)氯化钠,氯化钾的2.5,1.3不₂阿宝₄2.4 CaCl₂1.4 MgSO₄26 NaHCO₃0.05、10葡萄糖和苦味毒(GABA_一个在室温下受体拮抗剂)。在转移之前,削减了V第三层与层之间的区域内嗅皮层,防止癫痫样的活动的传播。显微镜是配备了水浸客观(40 - 63 x:工作距离),Nomarski光学和近红外电荷耦合器件(CCD)相机(索尼xc - 75)。使用这种设备,单个细胞层II可以可视化通过视频显微镜和针对记录(<一个href="#B25">25]。

2.2。记录

体全细胞电压钳记录(<一个href="#B26">26使用4 - 7)是由视觉控制MΩ电极。全细胞的解决方案包含(毫米):130 K-Gluconate MgCl 5氯化钠,2₂0.5,10玫瑰,EGTA 2 ATP, 0.4三磷酸鸟苷(pH值与1 M KOH;渗透性:290 - 300 mOsm)。在实验设计为细胞内钙螯合物^{2 +},10毫米BAPTA代替克分子数相等的K-Gluconate。调查的诱发EPSCs属性不同的膜电位,Cs-Gluconate 130毫米和0.8毫米QX314-Cl代替K-Gluconate全细胞中使用的解决方案。液体接界电势估计使用内尔(1992)和方法被发现8 mV。没有修正的跨膜电位应用液体接界电势除非另有指示。

全细胞电压钳记录了使用Axoclamp2A或Axopatch200B放大器(轴突仪器,加州福斯特城,美国)。低通滤波器(−3 dB)被设置为1 kHz,和由此产生的电流跟踪数字化计算机在1320千赫使用Digidata模拟转换器由Pclamp7(轴突仪器)。

细胞被举行60 70−−mV在录音除非另有指示。串联电阻自动测量使用Pclamp7软件和那些值高于30 MΩ全细胞配置被丢弃。在其余,串联电阻补偿放大器内置的补偿电路> 40%。输入电阻的细胞(平均MΩ,)是通过测量电流计算变形量在5 mV超极化电压脉冲的潜力,是通过每个监控记录。短期超极化电压的步骤(−5 mV, 250 millisecods)总是应用于每一扫之前刺激来监视任何输入电阻和串联电阻的变化。细胞表现出可发觉的变化引起当前过程的超极化在记录被丢弃。

2.3。刺激和实验性的协议

电刺激的传入通路层二世是通过双相,不锈钢电极绝缘除了在他们的技巧。这些都是定位的片层表面的I / II或III(见图<一个href="//www.newsama.com/journals/np/2008/814815/fig1/" target="_blank">1(一))。传入输入被激活以这种方式通过短(100s)电流脉冲的0.5 - -4.0 mA使用脉冲发生器(pg - 4000天鹅座理工,纽约)耦合到一个刺激隔离/直流发电机(模型A395 WPI)。EPSCs诱发每隔30秒,EPSCs的基底振幅是设置为100 - 200 pA通过调整刺激强度。EPSCs被接受为单突触的如果他们表现出短暂的和一致的延迟没有发生变化,随着刺激强度。

图1

μ 属性的诱发EPSCs EC II层神经元。(a)原理图的提升柱状(箭头)和横向(箭头b)输入第二集中在一层细胞内嗅皮层(I, II, III指浅层次的EC)。(b)的第三层诱发兴奋性突触后电流刺激不同的概要文件在超极化(−70 mV)和去极化的(+ 30 mV) APV潜力和敏感。这些实验,130毫米CsGluconate和0.8毫米QX314-Cl代替KGluconate记录吸管。修正了液体接界电势。在控制条件下(左边的面板),EPSCs证明只有快速衰减分量−70 mV,但显示慢衰减组件在30 + mV。在50岁M DL-APV(中间面板),只有快速观察组件在持有势(直接比较是叠加的痕迹在右边的面板中所示)。(c)的电流-电压关系EPSC组件测量在高峰和30毫秒后峰值相同的细胞(b)(见虚线)。峰值振幅(封闭广场地块)显示线性关系跨膜电位的全套测试(70−+ 30 mV)。这是改变后的应用APV(露天广场的情节)。在控制条件下,峰后的振幅测量30毫秒(满圈)低,显示负斜率地区去偏光膜电位水平(60−−20 mV),但几乎线性。在APV(圆圈),负斜率地区被废除,合成图线性跨膜电位的全部范围。

稳定的基线记录至少5分钟后,LTP是引起使用高频强直刺激列车(HFS中:100赫兹;1秒)在同一强度用于基线记录。通常,HFS中是不超过大约15分钟后,形成完整的细胞结构。没有增强作用观察如果HFS中应用有时大于30分钟后实现完整的细胞模式。成功LTP是评价统计相比基线值在一个时间点30分钟后HFS中为每个实验。

配对脉冲便利化协议使用为了评估任何更改在突触前释放机制。这两个途径刺激单独或者以很短的间隔(50 - 70毫秒)。PPF率计算的峰值振幅第二EPSC除以每个实验的第一个峰值振幅。

应用的药物是由股票的解决方案直接添加到过冷媒介做出适当的最终浓度。DL-APV (Tocris)和CNQX (Tocris)是由10毫米原液在同等体积的混合1 m氢氧化钠和二甲亚砜。这些都是用移液器吸取在较小的卷到离心管和储存冷冻(−20^°),直到使用。苦味毒和BAPTA购买“σ(密苏里州圣路易斯)。”

2.4。数据分析

EPSCs的振幅测量离线使用Clampfit 6(轴突仪器),通过计算峰值之间的差异相对于平均保持电流水平变位计算前10毫秒的刺激。平均轨迹如图insets代表5 - 10个人EPSC清洁工的手段。峰值振幅或paired-pulse便利(PPF)比率从这些平均值计算。EPSC振幅的强化或PPF比率被正常化振幅表示应用程序后HFS pre-HFS基线值。报道值反映了算术意味着±标准平均误差(SEM),和统计意义是由成对和未配对的学生t测试。

3所示。结果

3.1。表征EPSCs第二层细胞

应用电刺激侧位置层I / II或深在第三层诱发纯II层细胞兴奋性突触后电流(EPSCs)在我们的记录和过冷条件下(添加50米苦味毒)。这些EPSCs经常被塑造成单突触的但偶尔多突触的甚至逆行的反应观察。后者在这些情况下,刺激电极是身体表面调整甚至感动片,直到它唤起一个纯单突触的反应。响应的延迟我刺激毫秒(层)刺激毫秒(第三层)。这些反应都完全被TTX (1米)、镉(200米),非特异性谷氨酸拮抗剂,犬尿酸(0.5毫米)(没有显示)。

以诱发EPSCs的基本属性的特征,我们记录的响应范围广泛的膜电位(见图<一个href="//www.newsama.com/journals/np/2008/814815/fig1/" target="_blank">1(b),<一个href="//www.newsama.com/journals/np/2008/814815/fig1/" target="_blank">1(c)第三层刺激在这种情况下)。EPSCs显示只有一个快速衰减分量时,膜电位−举行70 mV。缓慢衰减分量明显持有潜力去极化的(参见图<一个href="//www.newsama.com/journals/np/2008/814815/fig1/" target="_blank">1(b),)。这些快速和慢速衰减组件EPSC出现类似AMPA,门冬氨酸受体介导的电流在中枢神经系统的其他部分。为了进一步详细地研究这种可能性,我们构建了电流电压(电流-电压)关系EPSC响应测量的峰值和峰值后30毫秒(见图中虚线<一个href="//www.newsama.com/journals/np/2008/814815/fig1/" target="_blank">1(b))。峰值电流-电压关系(方块图<一个href="//www.newsama.com/journals/np/2008/814815/fig1/" target="_blank">1(c))是线性在整个电压范围的潜在逆转0 mV而测量的电流-电压关系30毫秒后峰值(圈图<一个href="//www.newsama.com/journals/np/2008/814815/fig1/" target="_blank">1(c))是非线性区域负斜率的阻力在60−−20 mV。这种非线性电流-电压的行为是典型的门冬氨酸受体介导EPSCs。事实上,浴NMDA受体拮抗剂的应用DL-APV (50米)废除的慢衰减分量EPSC在去极化的潜力没有任何显著的影响在早期组件(参见图<一个href="//www.newsama.com/journals/np/2008/814815/fig1/" target="_blank">1(b),<一个href="//www.newsama.com/journals/np/2008/814815/fig1/" target="_blank">1(c))。结果是,在DL-APV峰值电流-电压关系保持不变(开放的方块图<一个href="//www.newsama.com/journals/np/2008/814815/fig1/" target="_blank">1(c))。小的突触电流仍可以以30毫秒,但这显示一个完全线性(打开圆电流-电压关系图<一个href="//www.newsama.com/journals/np/2008/814815/fig1/" target="_blank">1(c)),因此由于快速EPSC的后期阶段。相比之下DL-APV,选择性non-NMDA受体阻滞剂CNQX (10米)完全废除了EPSC超极化电位(没有显示)。这些数据表明,的属性EPSCs刺激诱发的水平和柱状传入EC细胞层二世是相似的在海马体glutamatergic同行,或事实上,其他地区的中枢神经系统。

3.2。独立的横向和纵向联想的通路

为了确保我们的刺激条件诱发活动独立集的输入在第二层融合,我们使用同源性突触heterosynaptic配对脉冲便利化(PPF)协议。这两个途径刺激独立或者以很短的间隔(50 - 70毫秒)和我们测量是否EPSCs诱发的第二个刺激脉冲的振幅增加第一。由于PPF反映了神经递质释放的增加基于相同的突触活动之前,任何便利观察在不同网站刺激反映重叠的激活突触。与这个想法一致,每个通道可以独立展示PPF(见图<一个href="//www.newsama.com/journals/np/2008/814815/fig2/" target="_blank">2(一个),<一个href="//www.newsama.com/journals/np/2008/814815/fig2/" target="_blank">2 (b):左面板)。相比之下,heterosynaptic刺激协议(第三层我跟着层或亦然)未能表现出任何PPF(见图<一个href="//www.newsama.com/journals/np/2008/814815/fig2/" target="_blank">2(一个),<一个href="//www.newsama.com/journals/np/2008/814815/fig2/" target="_blank">2 (b):对面板)。共有三个细胞中使用相同的协议,我们获得了类似的结果,表明这两个融合途径确实是独立的。

(一)

(b)

传入提升柱状和横向联想的通路之间的独立性。这两个途径刺激重复(左面板)或者(右面板)使用短脉冲间隔的时间间隔(60毫秒)。平均每个跟踪代表16个清洁工。虽然paired-pulse便利(PPF)在提升(a)和(b)水平独立通路当刺激(右面板),没有观察到当刺激每个便利或者(左面板)。虚线表示的最大振幅第一脉冲在每种情况下。

3.3。LTP的横向联想的途径

先前的使用领域和细胞内的方法证明了输入层二世被刺激激活层我(包括水平协会纤维层二世和extraentorhinal传入纤维系统)具有同源性突触LTP (<一个href="#B21">21,<一个href="#B27">27]。我们确认这个在我们自己的全细胞记录使用HFS协议条件。Posttetanic势差现象观察(PTP)在所有记录细胞的应用高频刺激(100 Hz, 1秒)层我在网站横向记录电极位置(见图<一个href="//www.newsama.com/journals/np/2008/814815/fig3/" target="_blank">3(一个))。LTP的EPSCs PTP在65%的细胞检测23(15)和HFS后持续了超过30分钟。的平均归一化值峰值EPSCs在这些细胞增加的一个因素基线值(参见图30分钟后HFS<一个href="//www.newsama.com/journals/np/2008/814815/fig3/" target="_blank">3 (b))。这个值是显著不同基线()。

(一)

(b)

LTP的横向关联路径表面内嗅皮层。刺激电极定位层表面的我,横向记录电极。(a)规范化了振幅峰值EPSCs诱发细胞测试脉冲在一层二世与时间绘制。HFS在时刻0 EPSCs导致立即和持久的增强作用。插图显示了两个痕迹反映平均EPSCs post-HFS基线(pre-HFS)和30分钟。(b)平均归一化了的振幅峰值EPSCs跨15单元。在30分钟post-HFS价值()是明显不同于基线()。

确定感应LTP的途径需要NMDA受体激活,我们测试片与NMDA受体拮抗剂治疗DL-APV (50米)。在这种情况下,HFS中横向网站层我只产生一个短期内(PTP)的便利化EPSCs在所有细胞测试。这些值恢复到基线水平在10分钟后HFS中(见图<一个href="//www.newsama.com/journals/np/2008/814815/fig4/" target="_blank">4(一))。归一化平均峰值EPSCs的价值在30分钟后HFS APV并没有显著不同基线值(,见图<一个href="//www.newsama.com/journals/np/2008/814815/fig4/" target="_blank">4 (b))。

(一)

(b)

LTP的感应门冬氨酸受体的激活所需的水平的途径。(a)规范化了振幅峰值EPSCs诱发细胞测试脉冲在一层二世与时间绘制。应用程序的时间点50M DL-APV线所示。HFS在时刻0导致短期(PTP)但不长期势差现象。插图显示了两个痕迹反映平均EPSCs post-HFS基线(pre-HFS)和30分钟。(b)平均归一化了的振幅峰值EPSCs跨6在存在APV线所示。在30分钟post-HFS价值()没有明显不同于基线()。

以确定HFS-induced LTP也依赖于突触后Ca^{2 +}的影响,我们测试了透析快速螯合剂BAPTA(10毫米)到突触后细胞。在NMDA封锁的条件下,HFS中横向层我只导致EPSCs短期便利化。这个便利回到基线水平略低于10分钟后的应用HFS中(见图<一个href="//www.newsama.com/journals/np/2008/814815/fig5/" target="_blank">5(一个))。的平均振幅增加EPSCs post-HFS 30分钟()没有明显不同于基线(,见图<一个href="//www.newsama.com/journals/np/2008/814815/fig5/" target="_blank">5 (b))。

(一)

(b)

感应LTP的突触后钙的增加所需的水平的途径。(a)规范化了振幅峰值EPSCs诱发的测试脉冲在一层二细胞含有10毫米BAPTA绘制与时间。HFS中经常应用全细胞模式的形成约15分钟后,以确保足够的BAPTA扩散。插图显示了两个痕迹反映平均EPSCs post-HFS基线(pre-HFS)和30分钟。(b)平均归一化扩展EPSCs峰值幅度在5 BAPTA-loaded细胞。HFS中只在时刻0诱导短期(PTP)但不长期势差现象。在30分钟post-HFS价值()没有明显不同于基线()。

为了评估如果LTP的表达水平关联路径是完全依赖于突触后机制,我们研究了PPF的任何变化比率。HFS中横向层我立即和明显降低在PPF很快回到稳定(和near-baseline)水平在5分钟内(见图<一个href="//www.newsama.com/journals/np/2008/814815/fig6/" target="_blank">6(一))。在30到50分钟post-HFS PPF的比例和分别,都是轻微的,但值得注意的是,低于基线(,见图<一个href="//www.newsama.com/journals/np/2008/814815/fig6/" target="_blank">6 (b))。因此,虽然LTP的主要组件在这个途径似乎是突触后的表情,似乎也包括突触前一小部分轨迹。

(一)

(b)

LTP的表达水平的途径与轻微改变paired-pulse便利(PPF)比例。(a)标准化了的振幅峰值EPSCs诱发第一对测试脉冲由60毫秒(圆圈)和规范化配对脉冲便利化比率(圆圈)一层2单元绘制与时间。插图显示了两个痕迹反映平均成对EPSCs post-HFS基线(pre-HFS)和30分钟。PPF比率计算的振幅峰值第二EPSC除以第一。(b)平均归一化了PPF幅度比在10细胞。HFS在时刻0诱导短期减少蛀回到基线水平附近。的值在HFS后30 - 50分钟,然而,(和、职责)明显不同于基线()。

3.4。LTP的提升柱状联想的途径

应用程序传入纤维的HFS中第三层造成立即和持久的强化EPSCs 79%的细胞检测29(23)持续的时间记录情况(post-HFS > 30分钟)。短期posttetanic势差现象(PTP)是一个一致的特征,这种便利,持续了不到5分钟后HFS中(见图<一个href="//www.newsama.com/journals/np/2008/814815/fig7/" target="_blank">7(一))。的平均归一化值峰值EPSCs增加的一个因素和基线(pre-HFS值)的30至50分钟,分别在HFS中(见图<一个href="//www.newsama.com/journals/np/2008/814815/fig7/" target="_blank">7 (b))。两个值明显不同于基线()。

(一)

(b)

LTP的柱状关联(提升)表面内嗅皮层通路。刺激电极放置在第三层的表面,只是深记录电极。(a)规范化了振幅峰值EPSCs诱发细胞测试脉冲在一层二世与时间绘制。交货时间的应用HFS零导致立即和持久EPSCs的振幅增加。这posttetanic势差现象持续了不到5分钟才达到一个稳定的,水平。插图显示了两个痕迹反映平均EPSCs post-HFS基线(pre-HFS)和30分钟。(b)平均归一化了的振幅峰值EPSCs 11个细胞。在30到50分钟post-HFS值(和、职责)明显不同于基线()。

确定感应LTP的途径需要NMDA受体激活,我们测试片与NMDA受体拮抗剂治疗DL-APV (50米)。令人惊讶的是,LTP的感应和维护出现不受这个影响操纵即使片过冷HFS之前至少10分钟,在某些情况下,不断地在整个实验协议。结果对冲刷(10到20分钟后高频刺激)和持续灌注条件汇集在一起观察统计分析因为没有区别这些条件。在控制条件下,加强EPSCs APV-treated片之后变得稳定而持久的短期(见图<一个href="//www.newsama.com/journals/np/2008/814815/fig8/" target="_blank">8(一个))。平均归一化值的峰值EPSCs APV的存在增加的一个因素和基线(pre-HFS)值在30 - 50分钟,分别值1显著不同基线值()和2不显著增加在不同控制条件(,见图<一个href="//www.newsama.com/journals/np/2008/814815/fig8/" target="_blank">8 (b))。在一个额外的两个实验中,我们还检测了更高浓度的APV(100年的影响米),但LTP的诱导和表达仍不受影响(数据未显示)。

(一)

(b)

LTP的感应门冬氨酸受体的提升途径不需要激活。(a)规范化了振幅峰值EPSCs诱发细胞测试脉冲在一层二世与时间绘制。应用程序的时间点50M DL-APV由线表示(注意,所有参与实验的溢出APV超过10分钟前应用在时刻0的HFS)。HFS中导致短期(PTP)和长期势差。插图显示了两个痕迹反映平均EPSCs post-HFS基线(pre-HFS)和30分钟。(b)平均归一化了的振幅峰值EPSCs在10在存在APV线所示。30 - 50分钟后的值和分别从基线值都明显不同()。

鉴于通量因钙激活突触后钙通道或metabotropic谷氨酸受体也能导致突触可塑性独立NMDA受体的激活,我们测试是否快速免费的胞内钙的螯合BAPTA将阻止LTP的途径。高频刺激应用15分钟后整个单元配置,允许的胞内透析BAPTA发生。与10毫米BAPTA吸管的解决方案,LTP的振幅明显降低虽然一直诱导。在这种条件下(见图<一个href="//www.newsama.com/journals/np/2008/814815/fig9/" target="_blank">9(一个)),平均增加EPSCs只是的规范化的峰值30分钟post-HFS,值反映显著减少(86%)的突触增强控制实验(见图<一个href="//www.newsama.com/journals/np/2008/814815/fig9/" target="_blank">9 (b);)。当我们在录音包括20毫米BAPTA吸管可以完全废除LTP(但不是PTP:)。然而,这种操纵也显著降低了输入电阻的突触后细胞平均20%(数据未显示)。

(一)

(b)

感应LTP的提升路径没有被隔离的免费突触后钙。(a)规范化了振幅峰值EPSCs诱发的测试脉冲在一层二细胞含有10毫米BAPTA绘制与时间。HFS中经常应用全细胞模式的形成约15分钟后,以确保足够的BAPTA扩散。插图显示了两个痕迹反映平均EPSCs post-HFS基线(pre-HFS)和30分钟。HFS-induced增强EPSCs还观察到。(b)平均归一化扩展EPSCs峰值幅度在5 BAPTA-loaded细胞。HFS在时刻0诱导短期(PTP)和长期势差。在30分钟post-HFS价值()相比略减少控制条件,但从基线明显不同()。

上面的数据,尽管不是完全确凿,部分表明,突触后钙条目可能发挥作用在LTP感应层II-II通路。因为NMDA receptor-channels显然不是这钙的来源,然后探索两个其他的可能性:(1)通过电压门控钙钙条目^{2 +}通道和钙(2)条目通过metabotropic谷氨酸受体(mGluRs)。第一种可能性评估我们试图诱导LTP低频刺激突触前(0.05 -01 HZ)搭配大振幅突触后去极化电压钳步骤(200毫秒−20 mV)已证明能引起LTP在其他系统中。然而,该协议并没有造成任何重大变化的振幅基线EPSC(没有显示,)。第二个可能的方法来评估,我们封锁mGluRs广谱拮抗剂MCPG (100在5米)。然而,神经元测试,HFS中继续诱导LTP的类似程度控制条件(没有显示)。

之前发现使用领域潜在的录音(<一个href="#B22">22)表明,LTP升层V层关联EC部分NMDA-independent的途径。通过测量变化paired-pulse便利(PPF),这些研究人员认为,这non-NMDA LTP的组件增加反映在突触前释放发射器。评估是否在第三层的输入层LTP presynaptically II细胞表达,我们计算PPF的变化比之前和之后LTP的表情。从内在提升层PPF三世通路细胞中观察到77%(17 23细胞)在控制(pre-HFS)在2.4 mM细胞外钙的存在条件^{2 +}。比率的范围之间观察到的是1.08和1.96,平均价值。只有细胞显示PPF和LTP(参见图检查<一个href="//www.newsama.com/journals/np/2008/814815/fig10/" target="_blank">10 ())。(1分钟后)后直接HFS中(即。,during the expression of PTP) the normalized PPF ratio was reduced by a factor of相对于基线值(,见图<一个href="//www.newsama.com/journals/np/2008/814815/fig10/" target="_blank">10 (b))。这种减少,然而,只有瞬态自PPF值显示最初的快速和后缓慢增加,让他们重新接近基线(团结)值(见图<一个href="//www.newsama.com/journals/np/2008/814815/fig10/" target="_blank">10 (b))。归一化平均PPF比率测量30 - 50分钟后HFS中的应用和分别仅略,但值得注意的是,不同于在基线期()。因此,看起来只有一小部分表达的LTP的途径反映神经递质释放的增加。

(一)

(b)

表达LTP的提升途径与PPF比率略有变化。(a)标准化了的振幅峰值EPSCs诱发第一对测试脉冲由60毫秒(圆圈),和规范化PPF比(圆圈)一层2单元绘制与时间。插图显示了两个痕迹反映平均成对EPSCs post-HFS基线(pre-HFS)和30分钟。PPF比率计算的振幅峰值第二EPSC除以第一。(b)平均归一化了PPF幅度比8细胞。HFS在时刻0诱导短期减少PPF的衰变回到基线水平附近。的值在HFS后30 - 50分钟,然而,(和、职责)明显不同于基线()。

3.5。分子机械的不同水平和LTP的柱状关联路径

基于LTP的感应性能的差异在两个通道检查,我们试图评估其潜在微分依赖独立的第二信使途径。我们首先测试了广泛使用的效果CamKII特定抑制剂,KN62。KN62 (3.8米)应用于片虽然浴灌注HFS之前交付超过10分钟。这种化合物有微分对LTP的影响表达水平与柱状关联路径。HFS层我的KN62未能引起LTP的细胞层二世(见图<一个href="//www.newsama.com/journals/np/2008/814815/fig11/" target="_blank">11)。post-HFS EPSC振幅的归一化平均30分钟,这实际上是显著降低对基线值()。相比之下,第三层的HFS KN62面前仍能在所有层二细胞产生LTP测试(见图<一个href="//www.newsama.com/journals/np/2008/814815/fig12/" target="_blank">12),虽然在两个细胞抑制PTP的表达式。归一化平均EPSC振幅在HFS中30分钟后一个值,反映了一个重要的便利(),哪些没有明显不同程度的增强作用表现在控制条件(未配对t以及,)。

(一)

(b)

感应LTP的完整CaMKII信号所需的水平的途径。(a)规范化了振幅峰值EPSCs诱发细胞测试脉冲在一层二世与时间绘制。时间点3.8的应用程序M KN62线所示。HFS在时刻0导致轻微的短期增强作用(PTP)但没有长期势差。插图显示了两个痕迹反映平均EPSCs post-HFS基线(pre-HFS)和30分钟。(b)平均归一化了的振幅峰值EPSCs跨6单元的KN62所表示的。在30分钟post-HFS价值(从基线)显著降低()。

(一)

(b)

感应LTP的提升途径不依赖于完整CaMKII信号。(a)规范化了振幅峰值EPSCs诱发细胞测试脉冲在一层二世与时间绘制。时间点3.8的应用程序M KN62线所示。HFS中导致只有轻微的短期增强作用(PTP),但长期势差现象突出。插图显示了两个痕迹反映平均EPSCs post-HFS基线(pre-HFS)和30分钟。(b)平均归一化了的振幅峰值EPSCs在10在存在KN62线所示。价值30分钟后HFS中这是明显不同于基线值(LTP)和不同控制条件()。

自LTP的提升途径似乎并未依赖CaMKII,我们下一个测试PKA信号的依赖。为了抑制PKA活性,我们使用催化亚基的浴应用抑制剂KT5720(250海里)。这个操作,申请前10分钟HFS中,没有完全阻断LTP层二细胞但明显抑制(见图<一个href="//www.newsama.com/journals/np/2008/814815/fig13/" target="_blank">13)。post-HFS EPSC振幅的归一化平均30分钟(),明显小于所示控制条件(未配对t以及,)。因此,至少部分表达的LTP这个途径似乎取决于PKA信号。

(一)

(b)

感应LTP的提升途径部分依赖于完整的PKA信号。(a)规范化了振幅峰值EPSCs诱发细胞测试脉冲在一层二世与时间绘制。时间点的应用250海里KT5720由线表示。HFS中导致完整的短期增强作用(PTP),但长期势差略下降的程度虽然仍然完好无损。插图显示了两个痕迹反映平均EPSCs post-HFS基线(pre-HFS)和30分钟。(b)平均归一化了的振幅峰值EPSCs在10在存在KT5720线所示。价值30分钟后HFS中这是明显不同于基线值(),但相比也明显减少了控制条件()。

4所示。讨论

在这项研究中,我们调查了突触沟通和可塑性的基本特征在两个独立的路径收敛EC层II主要神经元水平输入(包含皮质传入和intralaminar关联的细胞之间的连接层II),和升柱状(层间的)第三层输入,分别。虽然之前工作了LTP的属性在EC的表层,几乎没有人关注,没有细胞机制相比浅关联路径收敛一层二世。的确,最近的一次调查全细胞可塑性的EC层二星状认为只有有限公司存在条件类似报道这里(<一个href="#B28">28]。

我们的研究结果表明,这两种联想的欧共体内的通道是独立的,有基本的生理和药理特性类似于其他glutamatergic在中枢神经系统突触。此外,两个健壮的LTP唤起在HFS中显示伴随着配对脉冲便利化比例小幅下降。重要的是,我们证实了LTP的感应机制在这两个收敛路径演示了一些重要差异的依赖NMDA受体和依靠突触后的钙。这种差异可能反映了一个微分依赖第二信使系统。虽然这不是微分可塑性的首次直接示范独立通路,终止在EC的表层,它是第一个细胞的这种类型的调查。这证实了欧共体的内在电路动态是高度复杂的。

4.1。生理水平和提升的兴奋性输入EC层二世

EC细胞中的投影层二世是内侧颞叶的记忆电路的重要组成部分,因为他们接收精加工的皮层信息并提供海马体与最大规模输入通过穿甲弹的道路。通过前馈兴奋(大概抑制)担保物,这些细胞也丰富autoassociative网络的组成部分<一个href="#B29">29日),邻近的神经元相互影响和乘火车(<一个href="#B30">30.]。,这些细胞的活动是受到输入来自薄层位于深(<一个href="#B1">1,<一个href="#B2">2,<一个href="#B31">31日,<一个href="#B32">32]。收敛的功能意义水平和提升路径层二世还不清楚虽然可能有相关为了比较结果处理的深层,在最肤浅的。

我们演示了在当下研究兴奋性前馈层间的沟通不仅是传统的海马功能的输入和输出的薄片EC(即。,the most deep and the most superficial) but is also a feature of the independent superficial laminae (III and II) which comprise the cells of origin of the temporal ammonic and perforant pathways, respectively. As well, we demonstrated that both the horizontal and ascending associative pathways have properties consistent with excitatory glutamatergic synapses at a variety of locations in the central nervous system. Both demonstrated NMDA and non-NMDA (presumably AMPA) components. Indeed, pharmacological manipulations using both APV and CNQX completely abolished excitatory synaptic responses.

也类似于其他glutamatergic整个神经系统突触,水平和提升关联途径LTP展出。这些结果形成鲜明对比的邓和雷<一个href="#B28">28)在水平或未能显示LTP提升(V)层输入EC层二星状细胞使用各种刺激范式包括HFS中。我们的条件是他们之间唯一的明显差异包含qx - 314(0.2毫米)的全细胞吸管(为了抑制动作电位代)及其基线期使用(> 30分钟),以达到稳定的系列完整的细胞透析后抗性。尽管我们发现完整的全细胞透析在这个时间大于30分钟似乎产生负面影响的概率实现LTP,邓和Lei也无法证明LTP使用穿孔修补方法。因此,全细胞冲刷可能是没有差异的原因。然而,我们注意到,这两个字段和sharp-electrode胞内记录方法一直在肤浅的EC (LTP示威<一个href="#B21">21,<一个href="#B22">22,<一个href="#B27">27,<一个href="#B33">33- - - - - -- - - - - -- - - - - -- - - - - -- - - - - -- - - - - -<一个href="#B35">35]。有趣的是,阿隆索et al。<一个href="#B27">27)建议EC的内在节奏属性层二世星状,我带来的互动_h和我_午睡(<一个href="#B25">25),可能发挥关键作用的感应的可塑性传入输入。自从qx - 314块这两个电流和抑制共振和振荡行为<一个href="#B36">36),这个操作可能确实是相关的。

我们没有测试如果我输入的表达式LTP的层是门冬氨酸或non-NMDA依赖<一个href="#B33">33,<一个href="#B35">35]虽然在一些实验的持续灌注APV我们继续观察LTP第三层途径,表明它可能是由non-NMDA谷氨酸受体。

4.2。微分的可塑性水平和提升兴奋性输入EC层二世

虽然两途径展示完整的NMDA受体介导的传播,只有LTP的感应门冬氨酸信号所需的水平的途径。,钙依赖的LTP第三层II输入似乎没有一样重要,在水平的途径。这表明,第二信使系统中介LTP在两个不同的输入通道和潜在的独立有很大不同。这使得层二细胞类似于其他中枢神经系统神经元(如海马CA3金字塔)不同的传入输入演示NMDA——依赖和独立的同时LTP (<一个href="#B18">18]。LTP的主要区别在于,大部分在EC层二两途径似乎表达了通过突触后神经元的变化。已经观察到类似的差异LTP机制在产后早期(< P9)皮质和海马体(<一个href="#B37">37,<一个href="#B38">38]。然而,这是第一个报告我们的知识显示这种差异在两个独立的路径相同的组神经元在成人大脑(> P27)。