文摘
有一个历史悠久的体液生物标记研究神经退行性和神经炎症疾病。然而,只有少数生物标志物在脑脊液(CSF)被用于临床实践。Anti-aquaporin-4血清中抗体目前用于诊断neuromyelitis视(动),但是我们可以期待小说脑脊液生物标记,帮助定义这种疾病的预后和对治疗的反应。生物标志物研究的最关键的因素之一是研究由单中心的供电不足。调查人员之间的合作需要建立大型生物银行定义良好的样本。合作的一个关键问题是为生物建立标准化的协议,以确保获得的统计力量通过增加脑脊液样本的数量不是由pre-analytical因素妥协。这里,共识指南CSF收集和生物,基于已发表的指南BioMS-eu网络脑脊液生物标志物的研究。我们关注CSF收集程序,pre-analytical因素和高质量的临床和paraclinical信息。重要的是,生物研究协议适用于脑脊液生物银行针对任何神经系统疾病。
1。作品简介:协作的生物和生物标志物研究的必要性
动可以诊断基于血液生物标志物,aquaporin-4抗体,通道蛋白出现在星形胶质细胞,广泛讨论的其他贡献在这个特殊的问题。aquaporin-4抗体的存在已被证实为最成功的生物标志物研究的结果,并支持的想法反映在中枢神经系统(CNS)异常体液的变化。也证明了自身免疫性疾病和病态的组件相关的动谱系障碍,如纵向广泛的横向脊髓炎。
测定血清抗体水平anti-aquaporin-4基于诊断的中流砥柱,但这样的特异抗体的发现是相对近期的(1),因此,进一步研究体液是必要的。一个案例报告建议NMO-immunoglobulin G(免疫球蛋白),NMO-associated抗体活性的小脑组织(1在血清),可以缺席,但出现在CSF (2]。然而,另一项研究在一个相对大的患者显示检测CSF不会增加诊断敏感性[3]。另一个最近发现的候选生物标志物正常时差是胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)。Takano和他的同事注意到,分析脑脊液神经胶质原纤维酸性蛋白之间的鉴别诊断是有用的动和多发性硬化症或急性脱髓鞘性脑脊髓炎,其CSF水平疾病发病与扩大残疾评分量表(eds)动(4]。然而,研究之前需要更大的群组研究中得出明确的结论。综上所述,没有生物标记可用预后或治疗反应在动校正和NMO-related紊乱。因此,生物标志物的研究正在CSF。
一些先前执行的生物标志物研究的一个重要缺陷在中枢神经系统疾病一直是缺乏足够动力研究大型军团。这特别的问题诸如动,一种罕见的疾病,一个中心将无法在合理的时间内收集有一大群人。需要合作的原因是生物标志物多发性硬化的研究人员开始网络(BioMS-eu,http://www.bioms.eu/)。这种合作的目的是获得良好的,高质量的生物标记物,将通过共享患者样本,标准化和改进过程中重要的研究领域。最紧急的先决条件之一合作被认为是生物的标准化协议。因此,consensus-meeting组织和结果是收集和生物指南,网络的发达和出版于2009年5]。目前全球主要努力建立的专业化生物银行和收集和生物指南共识26组参与BioMS-eu (http://www.bioms.eu/在中枢神经系统生物标志物领域)是一个重大的成就(5]。一年之后出版的指导方针,超过90%的BioMS-eu实验室已经适应过程一致的指导方针。一个伟大的使用准则的适用性是任何神经系统疾病,包括正常时差,它为建立一个新颖的生物提供了指导方针。此外,它将极大地促进中枢神经系统生物标志物研究生物标志物研究领域。不讨论,我们之间寻求一个平衡实用性和科学原理,并提供每一个决策的背景。在达成共识之前,很明显,在收集协议之间存在巨大差异,强调需要解决这些差异(图1和表1)。在当前的论文,我们只包括原始论文的项目和他们的基本原理与生物相关的动。其他修改原始协议是一种适应性的第一项(如果多个样品应集中收集管用于一个病人),并包含一个项目解决运输(20项)和信息的一些生理混杂因素(25项)。
(一)
(b)
(c)
(d)
我们想强调的是,研究人员遵守这些协议领域的最佳合作脑脊液生物标志物的研究。我们建议使用表格2和3作为脑脊液生物标志物的清单脑脊液生物标志物的研究和建议未来的研究考虑这些问题。在基于探索生物标志物的研究中,应该考虑所有这些项目在启动前仔细研究。一些程序可能不可能在日常临床实践(例如,在一小时内处理),但不严格要求为特定的研究问题就足够了。因此,详细记录这些问题是至关重要的,以方便检索适当的样品由具体的研究目标。表示之前,程序退出和CSF(表存储2)广泛适用于任何神经系统疾病。
除了方法论问题,伦理批准是一个至关重要的国际或国家中心之间的合作的先决条件。签署知情同意应包括一份声明(国际)之间的样品交换中心是被允许的。此外,将临床实践的生物标志物,可能需要一个专利和工业合作伙伴的参与可能是需要的,大规模生产的基础设施,质量控制程序,达到尽可能多的实验室。大规模验证研究,当然也需要患者样本,它将是明智的考虑这种可能性的生物形成,如果道德法律允许和选项被认为是重要的,显示患者信息产业合作的可能性和同意。
最后,研究人员应该愿意分享他们的样品和信息整体的利益,也就是说,获得可靠的生物标志物可用于病人护理和治疗。
2。生物标志物研究指南脑脊液生物原理和细节
2.1。CSF组(表的程序2)
(一)收集程序:
第一项撤军至少12毫升的体积
脑脊液体积会影响生物标记物的浓度。大多数分子和细胞数量有rostrocaudal浓度梯度(6,7]。如果一个体积小,CSF将反映腰椎硬膜囊的构成,而大量可能反映了吻侧脊髓甚至心室CSF。因此,如果样品中生物标志物浓度2毫升的穿刺相比,在穿刺15毫升,这可能导致错误的结果。也为生物收集脑脊液的不同部分(例如,穿刺的初始和最终卷)可能会引入误差。因此,标准的CSF量应收集在腰椎穿刺,第一个2毫升可用于基本的CSF分析(26项),剩余的样本应该集中在旋转和整除。至少,这个过程必须被记录下来。收集脑脊液的体积与postlumbar穿刺头痛的风险不相关(8,9]。第二项的位置穿刺:椎体L3-L5
通常,诊断通过腰椎穿刺脑脊液。因为增加的蛋白质浓度梯度脑室腰椎脑脊液(10),CSF撤军的网站必须被记录下来。当CSF是从其他地方如宫颈水池或从侧脑室(例如,脑室引流),这应该是记录。3项去除血腥的脑脊液样本
创伤性挖掘造成血液污染的CSF发生在大约14 - 20%的标准腰椎穿刺(11]。对于高血清浓度的生物标记物,如凝血因子,血液污染会导致假阳性结果。此外,血液蛋白质导致抑制matrix-assisted激光解吸/电离质谱法(MALDI-TOF / MS)脑脊液蛋白质组学模式。然而,这种抑制血液蛋白质是高度切除后血细胞减少了离心前初始冻结(12,13]。红细胞计数的记录是至关重要的为这些测量选择适当脑脊液样本。脑脊液样本的红细胞数超过500 /μL不应该用于生物标记研究。第四项使用防止损伤的针(Sprotte或Whitacre针)
没有证据表明腰椎穿刺针的类型影响生物标志物浓度。然而,防止损伤的针被病人最好的容忍,并且降低风险postlumbar穿刺头痛,这是大约12%的大小- G针相比,约70%大小16 - 19 G针(14,15]。第五项使用聚丙烯集合管
有一些报告显示,集合管的类型影响生物标志物的结果,例如,总tau蛋白质和淀粉样蛋白β肽(16]。因此,标准化是很重要的。我们建议使用聚丙烯管,低蛋白结合的潜力,为收集脑脊液。不应该使用添加剂。玻璃管应避免,由于安全原因人员。当使用多个管,总量应该混合后离心分离,以避免梯度的影响。6项撤军的时间的一天
生物标志物的影响昼夜节律,支取(很重要17]。因为它通常很难实现标准化的撤军时间在日常临床实践中,文档必须选择适当的样本以减少这个变量的影响。项目7和8血清、血浆和DNA与脑脊液样本
收集匹配是很重要的血清和/或血浆样本评价脑脊液生物标志物因为标记在血液的浓度通常影响,CSF (18]。此外,血清/血浆对研究鞘内起源至关重要的生物标志物和中枢神经系统特异性。此外,中枢神经系统的存在血清/血浆标志物可能有助于疾病监测。真空管使用EDTA(干格式)优先于那些使用柠檬酸(解决方案)因为如果管含有柠檬酸的标准体积填充不完全,最后生物标志物浓度稀释不均匀地比其他样本。根据生物标记的类型和方法的研究,我们建议收集血清和血浆(19];对于一些方法,等离子体是优于血清,反之亦然。血清/血浆样品不应使红细胞溶解。我们建议使用真空系统进行抽血,因为止血带使用与其他混杂因素在preanalytic阶段包括止血带时间和姿势20.]。此外,供应商应遵循的指示,如混合。
最后,收集DNA扩展的可能性研究表型和基因型个体。协议用于存储和处理的DNA可以在补充文件(E-Appendix 1)。
(B)处理的存储:
9项存储在室温下直到旋转和整除
CSF,没有数据支持有偏爱离开样品在室温下或在4°C到处理。血清/血浆预处理温度更重要。为了避免血小板激活(21),血清/血浆样品离心前应在室温下保存。因此,在室温下处理血清/血浆和CSF,包括旋转期间及之后,适合大多数的研究。相对很少有系统的研究在这个问题上执行。我们建议探索性研究来定义温度对特定的生物标志物的影响。10项标准化纺丝条件
我们建议坚持标准化旋转的400 g协议在室温下10分钟当脆弱的细胞需要保存细胞的RNA隔离,和其他在2000 g。对于血清/血浆,我们提出以2000克为旋转在室温下10分钟。标准化的纺丝温度和速度可能会对一些重要生物标志物,虽然没有研究解决这些具体preanalytical CSF的变量。血浆和血清处理温度是至关重要的为特定的生物标记物(22]。离心后,上清液必须立即整除和存储。如果不这么做,处理时间应记录。11项标准化之间的时滞,旋转和冻结
preanalytical变量的影响的研究MALDI-TOF / MS蛋白质组学(蛋白质/肽< 20 kD)表明,采样和存储之间的时间更重要比CSF特定血清蛋白质或多肽,(12,13,23]。CSF,观察到两小时内处理不会导致出土文物的结果(12,13]。血清,观察到小处理时间(~ 10 - 30分钟)的差异会导致蛋白质变化的概要文件(19]。一些生物标记,如抗体或特定的细胞因子,采样和存储条件(不是很敏感24]。出于实际的原因,并针对30 - 60分钟的标准血清凝血时间,我们建议1.5小时的时间延迟(±30分钟)两个矩阵。当CSF细胞保存,尽快处理建议是细胞数量迅速下降。然而,在大部分的中心,在一小时内处理体液样本不是常见的做法。因此,文档需要支取和存储以选择统一的样品。对于新发现的生物标记物,这些preanalytical变量应该评估。12项使用的小型聚丙烯管整除
由于同样的理由CSF撤军(5项),我们建议聚丙烯管应该用于整除和存储。此外,瓶与螺钉帽应该用于安全的密封。该管尺寸是0.25,0.5,1毫升。项目13整除
冻结/解冻周期会影响生物标志物浓度(25]。例如,一次性冻结脑脊液样本可能导致一个高度重要的淀粉样蛋白的损失β(1-42),这是进一步降低20%后三个解冻周期(26,27]。相比之下,不影响脑脊液蛋白质组配置文件通过MALDI-TOF /女士曾被观察到四冻结/解冻周期后(13]。
原则上,应避免重复冻结/解冻样本,数据可用于解决这个问题只有少数生物标志物和响应冻结/解冻周期的新生物标志物尚不清楚。因此,分裂合并样本在多个小整除最佳,和可能的冻结/解冻周期应该被记录下来。项目14卷整除的0.2,0.5,1毫升
小整除卷优化避免冻结/解冻,避免浪费CSF。管应填满75%内,防止冷冻干燥管,这将影响生物标记物的浓度,虽然这可能只是一个问题如果不密封的密封低温管。这个问题还没有被正式研究并不是指在相关标准操作规程(28]。15项编码和Freezing-Proof标签的使用
独特的代码是必要的跟踪样品和对临床数据。理想情况下应该使用条形码来便于搜索,帮助眩目的分析,和保护病人的隐私。它是重要center-unique代码,跟踪数据回顾。标签必须是耐水和霜(−80°C)。
(C)存储和管理样品(表2,下部):
项16冰点−80°C
蛋白质可能不是稳定在−20°C多年。在一项研究中,存储的影响脑脊液在20°C和−−在半胱氨酸蛋白酶抑制物C 80°C,一个丰富的脑脊液蛋白,研究。乳沟这种蛋白质发生在所有样本存储在−20°C而不是样品储存在−80°C (29日]。除了半胱氨酸蛋白酶抑制物C截断,低分子量多肽剖面的变化由于脑脊液样本存储在−20°C三个月似乎是最小的(12,13]。脑脊液寡克隆条带可能恢复经过几年的存储−20°C表示高稳定的免疫球蛋白。然而,self-defrosting冰柜不能使用。没有显示数据存储的好处在液氮脑脊液和血清。因为这是昂贵而不实用的脑脊液生物,还没有基础建议储存在液氮。
综上所述,我们建议样品储存在−80°C,确保长期稳定的生物标记。17项的位置样本
使容易跟踪和快速迁移样本,存储信息应该包括冰箱位置,冰箱识别、冰箱内和样品位置。项目18和19:监测冰柜和分裂的样本
冰箱应该报警控制和一个示例救援计划和记录。所有的冰箱冰柜必须注册在一个日志文件。理想情况下,每日温度日志应该对所有冰柜可用。整除的样本应该分布在不同的冰柜,虽然不是绝对需要如果良好的监测。空,空备用冰箱应该是可用的。在使用前20项:交通条件和解冻
运输冷冻样品应该进行干冰,应满足运输和体积最小的3天。最好,样品周一发起传输同一周内到达。一旦样品已经到达,准备实验,过度融化温度(如37°C)是要避免的,以防止蛋白降解。此外,搅拌不足可以导致解冻梯度形成盐和蛋白质样品。
(D)患者信息数据库的要求:
项目21 -基本的人口统计资料,如年龄和性别
信息时代在抽样需要允许可比性与参考价值,因为许多蛋白质显示年龄相关性变化,例如,白蛋白或免疫球蛋白(30.]。理想情况下,出生日期和抽样记录日期。性别必须提供由于标记变化受激素的影响。23项种族
参考范围的生物标志物可以影响基因状态(31日]。例如,最近的一项研究发现一个非洲裔美国人免疫球蛋白g指数高于白种人,不相关的社会经济地位(32]。种族和民族的标准可以通过国家卫生研究院的网站(33]。24项治疗抽样和前一年的抽样
众所周知,常用药物治疗MS,包括免疫调节药物和使用甲基强的松龙治疗或预防复发,会影响生物标志物的表达(34,35]。其他的治疗方法可能同样影响动病人的生物标志物的结果。因此,类型和治疗期间应详细记录,最好是开始前至少一年CSF集合。项目25禁食,感染和怀孕
其他相关生理变量,可以影响脑脊液和血液分析物的水平应该被记录包括与非禁食,禁食怀孕,和潜在的神经疾病如感染(20.]。26项基本CSF分析(蛋白质、细胞计数、红细胞等)
使分层的患者根据其脑脊液结果和评估的适用性进行进一步分析样品,基本的CSF分析的结果应该被记录下来。首先,CSF概要文件为排除其他疾病的服务。此外,定量免疫标记可能发生的变化取决于疾病阶段,复发的活动,和药物治疗。炎症过程可能影响blood-CSF屏障功能,从而生物标志物浓度(18]。
寡克隆免疫球蛋白g带的存在(OGB)在动截然不同于女士,女士OGBs是持久的,而他们在动(瞬态36,37]。例如,OGBs于399年发现的411 MS患者(97%)和永远不会消失。11在动校正,OGBs被发现在三个病人(27%)和总消失了。寡克隆免疫球蛋白g带的敏感性强烈依赖于所使用的方法。我们强烈建议等电点聚焦染色其次是免疫印迹和免疫球蛋白(38,39]。最好是,所有常规诊断程序的方法,包括寡克隆条带,应该记录。27项CSF英文数据库中的数据
数据库的屏幕上的面具可以以当地语言,但潜在的文件需要用英语。强烈建议使用商用程序,如果没有一个共同的数据库BioMS-eu等网络。数据库也应遵循标准化的国际单位。
3所示。结束语
表中提供的列表2可以作为一个简单的清单CSF生物任何中枢神经系统疾病,适用在安装的过程中,也作为记录清单样本特征。预计这些标准化将为大型生物标志物研究铺平道路和富有成果的合作。在最初的论文中,我们提出指导方针结果措施包括女士生物标志物研究[5]。动校正、标准化结果的措施仍然是必要的。最终,这些努力到达验证生物标志物检测诊断、预后和治疗中枢神经系统疾病和潜在的阐明相关疾病的机制。
确认
BioMS-eu会议的其他参与者在伦敦,2007年3月,是承认他们的贡献的讨论导致这条指导原则:h . Abderrahim s Al-Izki d·贝克,r .银行、y Ben-Schloma, a . Berthele a . Bertolotto r·法雷尔j . Furby r . Gani f . Gilli s Gnanapavan b·戈麦斯·格列柯,e . Hauben e . Havrdova t·海顿,e . Iacobaeus贾比尔,n .贾法里美国杰克逊,r·卡普尔·g·基尔,灭世狂舞,a . Konieczny a . Kroksveen诉Lampasona, r·林德伯格a·洛克哈特陆c, c·马焦雷m . Mauritzio a . Millonig h . Parkes t . Plitz d . Sadovnik萨拉,r·萨克森k .主要k·史密斯,s . Suessmith·汤普森·h·l·维纳,b·威尔逊·d·赖特,j . Zajicek和p . Zaratin。