文摘

背景。Microglia-associated神经炎症中起着至关重要的作用的起始和发展神经性疼痛(NeuP)。AdipoRon模拟产生的脂联素是一种抗炎效应在各种疾病通过脂联素受体1 (AdipoR1)信号机制。腺苷单磷酸盐激活蛋白激酶(AMPK)是一个下游AdipoR1的目标,和AdipoR1 / AMPK途径参与调节炎症。本研究旨在调查AdipoRon能否缓解NeuP通过抑制microglia-derived肿瘤坏死因子-α(TNF的表达α)通过AdipoR1 / AMPK途径。方法。老鼠体内,NeuP模型建立了通过神经损伤。冯·弗雷测试用于检测机械爪上AdipoRon撤军阈值的影响。免疫印迹检测执行AdipoRon TNF的表达——的影响αAdipoR1, AMPK, p-AMPK。免疫荧光观察执行AdipoRon在脊髓小胶质细胞的影响。在体外,脂多糖(LPS)被用来在BV2细胞诱导炎症反应。AdipoRon对细胞增殖的影响被CCK-8检测。qPCR被用来检查AdipoRon TNF的表达——的影响α和偏振标记。的影响,证实了AdipoRon AdipoR1 / AMPK途径免疫印迹。结果。腹腔内注射AdipoRon缓解机械痛觉过敏在SNI老鼠,和应用AdipoRon降低TNF的表达α和同侧脊髓小胶质细胞的数量。此外,AdipoRon AdipoR1的蛋白质水平降低,增加蛋白质的p-AMPK侧脊髓。在体外,AdipoRon抑制BV2细胞增殖和逆转LPS-induced TNF -α表达和极化不平衡。此外,AdipoRon逆转LPS-induced增加AdipoR1表达和降低p-AMPK BV2细胞中表达。结论。AdipoRon可能缓解NeuP通过减少microglia-derived TNF -α通过AdipoR1 / AMPK途径。

1。背景

神经性疼痛(NeuP)可以诱导的损伤或疾病引起的躯体感觉神经系统创伤、代谢紊乱、病毒感染、自身免疫性疾病,或化疗。这种疾病的特点是自发性疼痛,痛觉过敏,触诱发痛和普通人群的患病率为6.9% -10% (1,2]。慢性神经性疼痛是一种痛苦的病人和医疗体制和社会的负担,使得有必要解决病理机制(3]。越来越多的证据表明,神经炎症的起始和发展是一个关键因素NeuP [4]。和小胶质细胞在调节神经炎症(一个重要的角色5]。促炎的小胶质细胞(M1表型)表达标记如CD32和倾向于合成炎性物质促进神经炎症反应。相比之下,小胶质细胞产生抗炎(M2表型),特点是分子如CD206,产生抗炎物质抑制神经炎症的进展(6]。动物研究表明小胶质细胞达到促炎状态比抗炎州期间大鼠的脊髓慢性收缩的后期损伤,表明小胶质M1-M2极化的失衡在神经性疼痛(7]。因此,针对小胶质细胞可能是调节神经炎症治疗NeuP可行的策略。

脂联素,由脂肪细胞分泌的一种激素,抑制炎症的疾病通过脂联素受体1 (AdipoR1)信号机制8]。最近的研究表明,脂联素基因敲除的减少野生型老鼠的爪子提取阈值,而鞘内注射脂联素变弱的炎症引起的疼痛,如行为完全弗氏佐剂在老鼠9,10]。这些研究表明,脂联素可能参与调节疼痛。不幸的是,脂联素的生物学属性限制其临床应用(11]。AdipoRon是脂联素能够激活的模拟AdipoR1 [12]。大量研究证实,AdipoRon具有抗炎作用在各种疾病13- - - - - -15]。然而,AdipoRon对NeuP的影响还没有被研究。

腺苷单磷酸盐激活蛋白激酶(AMPK)下游AdipoR1的目标,在生理过程中扮演着重要的角色,如葡萄糖代谢,脂质代谢和蛋白质合成。激活AMPK AdipoR1促进转换的磷酸化AMPK (p-AMPK) [16,17]。研究表明AdipoR1 / AMPK途径异常在糖尿病肾病等疾病和脑内出血,针对这个途径和治疗已确认是有效的(18,19]。重组CTRP9改善神经功能,减少脑水肿,减轻脑出血后的炎症通过AdipoR1 / AMPK途径(20.]。AdipoRon改善认知功能障碍的阿尔茨海默病小鼠模型激活AdipoR1 / AMPK途径[21]。然而,目前尚不清楚AdipoRon可以针对AdipoR1 / AMPK途径对NeuP产生有益的影响。

在这项研究中,我们旨在调查AdipoRon能否缓解NeuP和抑制microglia-associated TNF -α表达和探索的角色AdipoR1 / AMPK途径AdipoRon的镇痛效应。

2。材料和方法

2.1。动物

雄性C57BL / 6 J小鼠(6 - 8周)从珠海最好购买生物科技有限公司有限公司(珠海,中国)。动物们每笼在控制温度保持在5 - 6 ( °C)和每个周期(偏暗从7:00点到7:00点)与免费的食物和水。被包含在之前实验中,这些动物有至少四天来适应环境。所有实验动物伦理委员会批准南方医科大学珠江医院的1月26日,2021(批准文号:laec - 2020 - 153 - fs)。每一个努力了实验动物的数量和痛苦降到最低。

2.2。神经性疼痛模型

NeuP模型被幸免诱导神经损伤(SNI)在小鼠如前所述22,23]。简而言之,腹腔内注射的小鼠麻醉(i.p。)三溴乙醇(400毫克/公斤)。然后,5毫米的切口是在一个大腿暴露坐骨神经及其三个分支。接下来,胫骨和腓骨神经结扎和切断,和腓肠神经保留。最后,肌肉和皮肤被关闭在序列。虚假的手术控制,老鼠接受同样的操作除了神经结扎和神经横断。

2.3。药物

AdipoRon购买从MedChemExpress(美国)和溶解在混合溶剂(二甲亚砜、聚乙二醇300、渐变- 80和盐水混合的比例1:4:0.5:4.5)。手术后,老鼠被随机分为四组:虚假的集团,SNI集团SNI +汽车集团和SNI + AdipoRon组。老鼠在SNI + AdipoRon组被给予AdipoRon腹腔内注射在50毫克/公斤每24小时总共五注射。和老鼠在SNI +汽车组腹腔注射volume-matched溶剂作为控制。

2.4。冯·弗雷测试

冯·弗雷测试被用来确定机械爪戒断小鼠阈值。单独的老鼠被放置在测试笼子金属网层和允许适应周围环境测试之前至少30分钟。冯·弗雷细丝的0.04,0.07,0.16,0.4,0.6,1.0,1.4,2.0,和4.0 g应用于皮肤在外侧的唯一爪子为5秒。响应被认为是积极的,如果老鼠表现出任何nocifensive行为。所有的测试开始于0.6 g。如果发生了积极回应,相邻小灯丝下次使用,如果发生了消极反应,邻大灯丝下次使用。有一个30秒的间隔刺激。收集测试一直持续到四个反应后的第一反应变化。对于数据处理,上下读者使用软件(24]。最后的结果转换为50%的爪子退出门槛佩恩表的编制者(50%)比较使用Dixon的上下方法(25]。

2.5。免疫印迹

蛋白质提取的L4-L6段侧脊髓,分离与sds - page凝胶(10%和12%),然后转移到聚偏二氟乙烯膜。阻止非特异性结合位点的5%脱脂奶后解决方案2 h在室温条件下,膜的主要抗体孵育anti-AdipoR1(1: 1000年,Abcam ab126611) anti-AMPK (Proteintech 1: 1500年,66536 - 1 - ig), anti-p-AMPK(1: 1000年,细胞信号技术,# 2535),anti-TNF -α(1:1000年,Sangon生物技术,d221347 - 0025), anti-GAPDH (Proteintech 1: 10000年,60004 - 1 - ig),和反β肌动蛋白(1:2000,Abcam ab8227) 12 - 16 h在4°C。然后,膜与相应的二次孵化抗体(1:5000年,Solarbio)在室温下为1.5 h。的信号密度主要抗体是与ImageJ可视化成像系统和量化。

2.6。免疫荧光

老鼠深麻醉的L4-L6段脊髓后收集transcardial与生理盐水灌注4%多聚甲醛紧随其后。组织固定在4%多聚甲醛在4°C 12 h和脱水30%蔗糖在4°C 3 - 4天。然后,15-micrometer-thick部分脊髓样本准备使用低温恒温器。与10%牛血清白蛋白和0.3%阻塞后特里同x - 100在磷酸盐2 h在室温下,部分是孵化主要抗体AdipoR1(1: 1000年,Abcam ab126611) Iba-1(和光,1:800年,kouichi 011 - 27991), GFAP(1: 300年,细胞信号技术,# 3670),和NeuN(微孔1:800年,MAB377)在4°C - h。洗后,部分被孵化与相应的二次抗体(1:500年,bios)在室温为1.5 h。荧光染色结果使用尼康显微镜观察和拍照。和使用ImageJ脊髓小胶质细胞的数量计算。

2.7。细胞培养

BV2细胞,老鼠小神经胶质细胞系,培养在high-glucose含10%胎牛血清的DMEM青霉素、链霉素和1% 5%的股份有限公司₂孵化器。BV2细胞被刺激与脂多糖(LPS)的浓度100 ng / ml或AdipoRon 50浓度μ米24 h。

2.8。细胞计数Kit-8 (CCK-8)

AdipoRon在BV2细胞的增殖的影响被CCK-8化验。BV2细胞被镀96 -孔板和对待AdipoRon 50浓度μ米24 h。后来,CCK-8的解决方案是添加到96孔板和孵化1 - 3 h。细胞的增殖是由测量OD值在450 nm。

2.9。实时定量PCR (qPCR)

从BV2细胞总RNA分离使用试剂盒(准确的生物学、中国)和量化NanoDrop分光光度计(美国热费希尔科学)。然后,信使rna reverse-transcribed进cDNA使用Evo M-MLV逆转录工具包(准确的生物学、中国)。和每个目标基因由ABI qPCR量化系统(美国)热费希尔科学使用SYBR绿色PCR大师(准确的生物学、中国)。以下引物被使用:TNF -α(感觉底漆:5 - - - - - -柠檬酸CTG呕吐有条件现金转移支付注册会计师ATG TC-3 ;反义底漆:5 - - - - - -TCT GTG gg亚美大陆煤层气有限公司GCT GTG CA-3 ),CD32(意义上底漆:5 - - - - - -gg GCC太极拳ATC TGG三大行动 ;反义底漆:5 - - - - - -GTG GTT CTG GTA ATC ATG CTC TG-3 ),CD206(意义上底漆:5 - - - - - -CTC TGT柠檬酸GCT攻击力GGA CGC-3 ;反义底漆:5 - - - - - -GCT TC-3 CGG AAT TTC TGG得到柠檬酸 ),和GAPDH(意义上底漆:5 - - - - - -gg TCG GTG TGA ACG手枪TTG-3 ;反义底漆:5 - - - - - -TGT AGA CCA TGT AGT TGA GGT CA-3 )。GAPDH是用作控制。结果规范化GAPDH和使用比较CT方法计算。

2.10。统计分析

所有数据在本研究中被表示为 。日期进行分析,比较,GraphPad Prism 7.0软件的可视化。用单向方差分析比较多个组进行。行为分数分析双向重复测量方差分析。图基的多重比较被用作事后分析。值小于0.05被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。AdipoRon减轻机械痛觉过敏在SNI老鼠

核实NeuP模型的有效性,冯·弗雷测试之前和之后执行手术获得佩恩表的编制者50%。SNI组,佩恩表的编制者显著降低身体的同侧的50%相比,术后第三天佩恩表的编制者对侧的50%,但是虚假的组中没有这样的区别。同时,佩恩表的编制者身体的同侧的50% SNI组相比显著降低手术后同侧的虚假的佩恩表的编制者50%组(图1(一))。这些结果表明,NeuP模型成功建立在这项研究中。

然后,在SNI AdipoRon小鼠的影响根据时间轴图检查1 (b)。行为结果显示同侧的50%大幅反弹佩恩表的编制者在SNI + AdipoRon组后5天12 SNI佩恩表的编制者身体的同侧的50%相比SNI +汽车集团(图1 (c))。这些数据表明,AdipoRon能够减轻机械痛觉过敏在SNI老鼠。

3.2。AdipoRon下调肿瘤坏死因子-α和脊髓小胶质细胞数量的SNI老鼠

Microglia-associated NeuP的存在是一个重要的病理原因。因此,我们获得的脊髓组织在手术后7天进行测试。免疫印迹结果表明TNF的蛋白质水平α在同侧脊髓在SNI组相比显著增加虚假的组。同时,免疫荧光显示,小胶质细胞的数量显著增加侧脊髓背角(SDH)的SNI组与虚假的组。AdipoRon的应用后,TNF -的蛋白质水平α在同侧脊髓SNI + AdipoRon组显著低于在SNI +汽车集团,而同侧SDH中的小胶质细胞数量也显著降低(数字2(一个)- - - - - -2 (d))。总的来说,这些结果表明,AdipoRon会使小神经胶质细胞的数量和肿瘤坏死因子的蛋白质水平αSNI侧脊髓的老鼠。

3.3。通过AdipoR1 AdipoRon减轻机械痛觉过敏/ AMPK途径

探索机制AdipoRon antinociceptive和抗炎效果,首先,我们研究了SDH AdipoR1的细胞定位。我们发现AdipoR1主要是局部的小胶质细胞和神经元(图3(一个))。

接下来,用免疫印迹检测AdipoR1 / AMPK途径的表达在同侧脊髓手术后7天。如数据所示3 (b)- - - - - -3 (d)虚假的集团,而AdipoR1的蛋白表达增加,但p-AMPK的表达,AdipoR1下游分子,抑制侧脊髓的SNI组。AdipoRon治疗后,AdipoR1的蛋白表达显著降低,p-AMPK的蛋白表达显著增加的同侧脊髓SNI + AdipoRon集团相比SNI +汽车集团。在一起,这些数据表明,AdipoRon antinociceptive和抗炎作用可能与AdipoR1 / AMPK途径有关。

3.4。AdipoRon抑制肿瘤坏死因子-α表达式通过调节BV2细胞的增殖和极化

BV2细胞被用来进一步研究在microglia-associated AdipoRon炎症的影响。应用LPS诱导的炎症反应BV2细胞。确定刺激浓度,BV2细胞治疗100 ng / ml, 500 ng / ml,和1000 ng / ml的有限合伙人24 h,分别。qPCR结果表明TNF - LPS浓度显著提高α信使rna水平(图4(一))。因此,100 ng / ml被用来刺激浓度在后续实验。

AdipoRon的影响BV2细胞检查根据图的时间4 (b)。首先,我们研究了不同浓度的影响AdipoRon BV2细胞增殖。CCK-8的结果表明,50 450海里的OD值μM组相比显著降低0μM组(图4 (c))。这些结果表明,AdipoRon显著抑制BV2细胞的增殖50浓度μm .接下来,我们观察到的影响这个浓度的AdipoRon LPS-induced TNF -α在BV2细胞信使rna表达。如图4 (d)与LPS组相比,TNF -的mRNA的表达αAdipoRon组明显减少。此外,我们还研究了影响AdipoRon BV2细胞的极化。qPCR结果表明CD32的mRNA表达明显增加,而CD206的mRNA表达明显降低了LPS组相比,天真。应用AdipoRon逆转CD32 mRNA表达的增加引起的有限合伙人(数字4 (e)和4 (f))。上述结果表明,AdipoRon可能抑制LPS-induced TNF -α言论影响BV2细胞的增殖和极化。

3.5。AdipoRon抑制肿瘤坏死因子-α通过AdipoR1 BV2细胞表达/ AMPK途径

我们检查了AdipoR1 / AMPK途径BV2细胞,发现与天真组相比,AdipoR1的蛋白表达的蛋白表达增加,p-AMPK降低LPS组。与AdipoRon预处理后,AdipoR1的蛋白表达显著降低,而p-AMPK的蛋白表达显著增加相比LPS组(数字5(一个)- - - - - -5 (d))。这些结果是一致的与观察到的动物。因此,这些数据暗示AdipoRon可以抑制肿瘤坏死因子-α通过AdipoR1 BV2细胞表达/ AMPK途径。

4所示。讨论

在这项研究中,我们探索的影响AdipoRon NeuP。我们雇了一个幸免神经损伤模型来模拟机械痛小鼠和LPS诱导炎症反应用于BV2细胞。我们的研究结果表明,AdipoRon能够减轻机械痛觉过敏和抑制脊髓肿瘤坏死因子-α表达式在SNI老鼠,这些影响可能是通过调节小胶质细胞的增殖和极化。此外,我们的研究结果还表明,AdipoR1 / AMPK途径可能参与调节AdipoRon小胶质细胞。因此,这项工作将提供新的药物选择和干预治疗NeuP目标。

小神经胶质细胞,先天免疫细胞的中枢神经系统,参与神经炎症的规定(26]。近年来,越来越多的证据表明小胶质细胞中扮演重要角色的病理NeuP [27]。Microgliosis和小胶质细胞的激活发生神经损伤后,显化的扩散和释放生物活性介质,以促进疼痛信号(28]。在我们的研究中,小胶质细胞的数量和TNF的表达α增加在SNI后脊髓。此外,体外实验显示,高表达的肿瘤坏死因子-αLPS刺激后在BV2细胞。这些结果是一致的普遍观点,参与NeuP microglia-mediated神经炎症(29日]。重要的是,应用程序AdipoRon抑制小胶质细胞的数量的增加和TNF的表达造成的SNI或有限合伙人。以前,一个类似的抑制作用在阿尔茨海默氏症。Iba-1染色强度和il - 1的水平β和肿瘤坏死因子-α明显减少了老鼠的大脑中5×时尚AdipoRon治疗后(30.]。这些结果表明,AdipoRon能够抑制炎症通过减少小神经胶质细胞的数量。另外,我们观察到显著增加CD32 mRNA(促炎细胞的标记)和显著减少CD206 mRNA(抗炎细胞的标记)BV2细胞与LPS刺激后。小胶质细胞有双重角色存在的规定(31日]。有越来越多的证据表明,调节小胶质极化恢复proinflammation之间的平衡和抗炎更有利于恢复NeuP阻塞小胶质激活或消除小胶质细胞。激活G protein-coupled受体减少疼痛,如行为通过上调il - 10 /脑内啡通路在脊髓小胶质细胞,但这种影响是被二甲胺四环素,小胶质激活抑制剂(32]。在我们的研究中,CD32的mRNA水平显著降低AdipoRon预处理后,在mRNA水平CD206也略有增加。在先前的研究中,通过促进AdipoRon降低颅内出血造成的损害的M2-type极化小胶质细胞(19]。这些数据表明,AdipoRon抑制了炎症反应的调节小胶质细胞的极化。当然,极化的概念有其局限性在这个阶段,和小胶质细胞可能有更多样化的表型。然而,使用这个概念在这个工作可以帮助我们更好地理解的角色AdipoRon microglia-associated监管的炎症。

AdipoRon是一种小分子AdipoR受体激动剂。最近的研究表明,AdipoRon施加adiponectin-like影响疾病如糖尿病和肥胖和补偿脂联素在临床应用的局限性33]。敲除脂联素引起的疼痛,如在正常小鼠行为,同时定期游泳运动缓解neuromaic伤害感受的老鼠伴随着增加脂联素水平(9,34]。这些结果表明脂联素和疼痛调制之间的联系。在这项研究中,机械爪SNI后戒断小鼠阈值显著降低,但腹腔内注射AdipoRon主持这一现象在一段时间内。和AdipoRon抑制TNF的表达α在SNI老鼠和BV2细胞。肿瘤坏死因子-α是一个至关重要的促炎细胞因子从急性疼痛转变为慢性疼痛。在肝脏,AdipoRon减碳tetrachloride-induced肝损伤通过抑制促炎细胞因子的表达和激活肝星状细胞(14]。在心脏,AdipoRon宽慰心肺bypass-induced心脏炎症和功能障碍通过抑制TLR4 / TNF -α信号在心肌细胞(13]。因此,这些结果表明,AdipoRon减轻机械痛觉过敏在SNI老鼠通过抑制肿瘤坏死因子-α表达式在脊髓。

AdipoRs,主要包括AdipoR1和AdipoR2,调解脂联素的不同的功能35]。之前的研究表明,脂联素的抗炎效应主要是通过AdipoR1施加。脂联素能够抑制促炎细胞因子的释放βO-treated BV2细胞转染后被取消的AdipoR1 siRNA但不是AdipoR2核(36]。AdipoR1是不同的在不同的疾病的表达水平(18,19]。在我们的研究中,脊柱的表达AdipoR1增加SNI后7天。这可能是一个补偿增加与脂联素水平下降在神经损伤后的神经系统。一项研究表明,脂联素表达下调的基因敲除在正常小鼠疼痛的阈值,和脊髓AdipoR1的表达增加部分坐骨神经结扎后7天(9]。此外,在阿尔茨海默病小鼠模型,脑脊液中脂联素水平降低,而大脑AdipoR1的表达增加(30.]。AdipoR1 AMPK的上游分子促进AMPK p-AMPK[转换12]。在我们的研究中,脊髓p-AMPK / AMPK的比值显著降低SNI后7天。抑制p-AMPK表达式与NeuP的发生有关。在大鼠慢性压缩性的损伤,疼痛的敏感性的增加伴随着减少脊柱p-AMPK表达式(37]。这些结果表明,在NeuP AdipoR1 / AMPK途径是改变。AdipoRon可以穿过血脑屏障(30.]。AdipoRon治疗后,我们观察到减少脊柱AdipoR1表达和增加脊柱p-AMPK表达SNI老鼠,伴随着机械伤害感受的改善。此外,免疫荧光结果显示AdipoR1在脊髓小胶质细胞表达。然后,我们也观察到类似的效应BV2 AdipoRon AdipoR1 / AMPK途径的细胞。这些结果表明,AdipoRon的有利影响NeuP可能与AdipoR1 / AMPK途径。

目前的研究仍存在一些局限。(1)免疫荧光显示AdipoR1局部脊髓小胶质细胞和神经元。有人建议,AdipoR1参与多巴胺神经元活动的监管和发射率。然而,AdipoR1在脊髓神经元的作用尚未在本研究探讨。(2)我们集中在抗炎AdipoRon SNI老鼠,但我们没有调查其他属性,如抑制胰岛素抵抗或促进自噬和AdipoR2是否参与。(3)我们没有执行一个可拆卸的进一步验证AdipoR1的角色。(4)避免雌性动物的发情周期的影响结果,雄性动物被选为实验对象。是否有性别差异的镇痛效应AdipoRon并不在这个研究调查。还需要进一步的研究来探索AdipoRon的镇痛机制。

5。结论

一般来说,我们的研究表明,AdipoRon机械痛觉过敏,抑制脊髓肿瘤坏死因子-变弱α表达在SNI老鼠,这些影响可能是通过调节小胶质细胞的增殖和极化。此外,我们的研究结果还表明,AdipoR1 / AMPK途径可能参与调节AdipoRon在小胶质细胞(图6)。尽管AdipoRon的镇痛机制仍有待进一步的研究,我们的研究结果提供了一种可能的治疗选择缓解NeuP通过抑制神经炎症。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

信息披露

预印本曾被发表(黔方舟子et al ., 2022)。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突,关于这篇文章的出版。

作者的贡献

钱方和杰李同样这项工作。

确认

这项工作得到了国家自然科学基金(82172526和82172526),广东基础研究和应用基础研究的基础上,中国(2021 a1515011042和2021 a1515010135)和项目广东省中医药管理局、中国(20201066)。