文摘

客观的。缺血再灌注损伤通常发生在器官移植、冠心病、缺血性心脏病和其他疾病,这大大减少了临床疗效。这项研究检查了茜草属的有效性作为一个医学治疗缺血再灌注损伤。方法。茜草属的功效是评估通过测量心肌梗死大小、冠状动脉流出体积,心肌收缩速度,激活炎症因子,自噬因素,细胞凋亡因素,及相关通路基因在小鼠体内。结果。结果表明,茜草属治疗可以有效降低心肌梗死的面积和恢复动脉血流速度和在小鼠心肌收缩性。此外,茜草属治疗抑制炎性因子的表达,自噬因素,细胞凋亡因子在小鼠和减少心肌细胞损伤的程度。研究也表明,茜草属治疗可以减轻心肌缺血再灌注损伤小鼠和抑制炎症反应的发生通过抑制NF -的活性κB通路。结论。结果表明,茜草属有效对抗缺血再灌注损伤,因此显示潜在的临床药物治疗缺血再灌注损伤。

1。介绍

休克疗法的研究进展和应用动脉旁路移植术,溶栓治疗,心肺脑复苏,肢体再植,改善恢复缺血再灌注后的人体器官进行器官移植。尽管一些器官功能恢复再灌注后,有时,它会加重组织损伤。再灌注可导致组织细胞损伤甚至坏死,称为缺血再灌注(I / R)损伤(1]。缺血再灌注可引起许多疾病如冠心病和缺血性心脏病。缺血性心脏病死亡率高。恢复冠状动脉血液流动是一个重要的步骤在治疗缺血性心脏病,但是I / R损伤严重影响治疗的有效性。I / R损伤的有效预防和治疗的关键是改善缺血性心脏病患者的生活质量(2]。冠状动脉粥样硬化性斑块破裂可导致冠状动脉血栓形成,堵塞血管,和心肌梗死在严重的情况下3]。溶栓治疗或经皮冠状动脉治疗是一种有效的治疗。然而,恢复血液供应后心肌缺血的过程会导致reinjury,加重损伤,严重影响临床疗效。研究表明,心肌细胞缺血期间更容易损坏,而内皮细胞更容易损坏在再灌注(4]。长期缺血再灌注引起的细胞损伤可导致细胞凋亡、自噬、坏死(5- - - - - -7]。

茜草属等l(茜草属)是一个有着悠久历史的植物的药用使用红色染料,也被称为血茜草、血液看到悲伤,在安徽、江苏、河南、陕西、山东、和其他地方。其药用部分是干根(8]。主要的药用功能r .等包括冷却血止血、促进血液循环、消除血瘀。它也用于血热咳血,吐血,鼻出血、血尿、便血、瓦解和泄漏,经期、产后瘀滞腹痛,减少损伤,风湿等疾病。由于最近发现的醌类等化学成分,cyclohexeptides,多糖在印度茜草属的植物,它的药理作用是逐步扩大,现在包括止血和去除瘀,抗氧化,抗炎,抗肿瘤,免疫调节和神经活动。茜草属等也可以用来抑制巨噬细胞炎症和防止肾脏氧化损伤(8,9]。因此,心肌缺血再灌注的大鼠模型建立在这项研究中,然后,老鼠服用茜草属等探索的治疗效果茜草属等在缺血再灌注损伤。

2。材料和方法

2.1。建模和实验动物的治疗

茜草属等根材料从Wandong桥购买中草药市场的名称,贵州省,贵阳市的正被贵州大学的副教授长Qingde中医。根材料煮两次,两个沸腾的汤总和。合并后的汤被过滤,浓缩为1 g / mL,相当于原料,在4°C和存储供以后使用。这个实验已经琼海人民医院伦理委员会的批准(项目号:qh - 20201120 - 0012)。

32名健康成年SD大鼠随机分为虚假的集团(假的),模型组(模型),茜草属组(茜草属),和地尔硫卓集团(迪勒)。手术前七天,大鼠模型组和假组每天注射1毫升生理盐水,茜草属组大鼠在注射茜草提取物(0.5毫克/公斤)每一天,和迪勒组大鼠注射地尔硫卓每天(0.2毫克/公斤)。执行I / R模型在模型组,茜草属组,迪勒集团。

对心肌缺血再灌注模型的性能10),老鼠与戊巴比妥钠麻醉和固定在手术台上。气管插管进行老鼠,正压呼吸机是植入协助呼吸。左3 - 4肋空间开胸是为了打破心包暴露心脏。左前降枝冠状动脉的结扎使用外科领先。前降支结扎后30分钟,结扎线放松,再灌注进行1 h。虚假的操作组未受到前降支结扎,但另一个步骤是相同的。动脉血流和心肌收缩速率测量后操作。

2.2。冠状动脉血流检测

再灌注后右心房流出测量,观察冠状动脉血流(CF)率在5分钟,10分钟,再灌注后20分钟,30分钟。的流量 毫升/分钟的心率被选中。冠状动脉流出(CE)收集的最后测试。在实验中,心肌收缩性被蛙心夹记录。

2.3。氯化三苯基四唑(TTC)染色法是用于确定心肌梗死的面积

老鼠牺牲后,心脏组织迅速取出,心房和右心室前都要被挖出来,并存储在4°C PBS的解决方案。心脏组织被冻结在−20°C为30分钟。心脏组织被切割,部分被安置在前2% TTC解决方案和染色在黑暗中30分钟的37°C。染色后,心脏部分与中性甲醛固定剂固定24 h。心部分被拍到,危险区域,梗塞区,总面积ImageJ软件进行了分析。

2.4。ELISA测定的相关因素

肿瘤坏死因子-α酶联免疫试剂盒(Solarbio生命科学,北京)是用于检测TNF -α。收集到的老鼠血液在室温下放置2 h和离心机 上层清液之前20分钟。在那之后,血清TNF -α肿瘤坏死因子-浓度检测α装备,根据指令进行了检测步骤。il - 1β、il - 6、Caspase-3 Caspase-9、LC3-II ULK1,肌酸激酶(CK)、LDH、和ET-1被发现使用相应的工具,和上面的操作是一样的。

2.5。测定内皮细胞的功能标记

血清没有由硝酸还原酶含量。的硝酸血清被−80°C冰箱和解冻逐渐20°C (80°C−−4°C的房间温度在37°C水浴)。体积为0.1毫升双蒸水添加到空白组,100年0.1毫升μmol / L标准应用程序的解决方案是添加到标准管,0.1毫升测试样本添加到测试管,和0.2毫升试剂1和0.2毫升试剂2被添加到每个管,分别在混合瓶和孵化37°C 60分钟。体积为0.2毫升的试剂3和0.1毫升的试剂4以上被添加到每个管,他们完全vortex-mixed 30年代。管是离开站在室温下10分钟之前他们在3500转离心10分钟。颜色的上层清液被渲染。从每一个管,0.45毫升的上层清液,和0.6毫升显色剂添加(北京Baiolibo科技有限公司,SNM195)在混合在振动器之前,让他们在室温下10分钟。每个管的吸光度测量在550 nm波长对蒸馏水空白和0.5厘米直径。浓度计算如下:

号活动是由化学比色法。所示的测定方法是一氧化氮合酶测试箱的指令。总之,0.2毫升的双蒸水被添加到空白控制、0.1毫升双蒸水和0.1毫升测试样本添加到总NOS (tno)试管,和0.1毫升抑制剂和0.1毫升测试样本添加到伊诺试管。体积为0.2毫升的衬底缓冲区,10μL的触媒,和0.1毫升color-developing代理之前添加到上述管他们彻底混合振动器和孵化37°C,持续15分钟。透明代理(0.1毫升)和停止的解决方案(2毫升)被添加到上述每个管内容之前涨跌互现。每个管的吸光度测量与蒸馏水归零后,在波长530纳米和1厘米直径。 。

2.6。心肌组织学染色检查

心肌组织(0.1 g)每组小鼠的梗死面积在4%多聚甲醛固定超过2 h。固定的心肌组织是嵌入在石蜡和分段。切片在一夜之间被放置在烤箱60°C,沉浸在二甲苯透明,然后用一系列浓度梯度乙醇水化,并沉浸在自来水,确保充分水化。3 - 8分钟的片与哈里斯苏木精染色,用自来水洗净,分化与1%盐酸酒精几秒钟,用自来水冲洗,放在蒸馏水为5分钟。从蒸馏水,片浸在0.5%伊红染色增值税10分钟,用自来水冲洗几秒钟,并通过一系列浓度梯度乙醇脱水,二甲苯透明,和中性树脂密封。切片在显微镜下检查。

2.7。激活NF -κB Pathway-Related因素是世行发现的

心脏细胞质和核蛋白质提取使用细胞质/核蛋白质提取工具。鼠心肌的一部分被清洗和预冷PBS包含1‰PMSF之前添加了一个细胞裂解缓冲和均质。均质化后,内容被转移到超声波的EP管,放在冰10分钟,和混合。沉淀和上层清液的离心分离 在4°C 7分钟。胞质蛋白的上层清液收集离心 在4°C 15分钟和存储−80°C,供以后使用。上层清液只是吹,放在冰2分钟,离心机 在4°C丢弃上层清液前7分钟,增加150人μL裸体存储缓冲区,并把它上下颠倒几次,除去沉淀。增加了体积的1/10的裸体裂解缓冲前吹,摇晃它在900 - 1200转4°C 15分钟和离心法 在4°C 5分钟。浮在表面的拍摄和存储在−80°C。蛋白质被孤立的sds - page凝胶电泳(聚丙烯酰胺)。大量的20μ克蛋白质样品被转移到硝基电影100 V 1 h和密封在37°C 1 h添加了一个主要的抗体和孵化之前一夜之间在4°C。TBST洗了 分钟前二次抗体(1:1000/1:2000)是补充道,在室温下1 h。TBST又洗了 分钟。西方墨点法用于观察、图像分析是用来确定吸光度( )每个乐队定量分析的价值。

2.8。统计分析

GraphPad Prism 8.0 (GraphPad软件公司,拉霍亚、钙、美国)是用于统计分析。所有结果都表示为 。世行结果条和ImageJ光密度值进行分析的软件处理系统。实验小组评估了之间的区别 - - - - - -测试或单向方差分析和意义 - - - - - -测试(LSD)。 被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。治疗可以有效降低心肌损伤和恢复CF和心肌收缩速率

小鼠的心肌梗死面积可以量化TTC染色。如图1(一),模型组小鼠的心肌梗死面积明显大于在虚假的小组,并在治疗后显著降低的迪勒集团和茜草属组。他染色是用来检查心肌结构的完整性和损伤的程度。如图1 (b)、虚假的操作组、心肌膜是完整,肌原纤维的平衡,和相邻的肌原纤维是连续的。模型组,心脏缺血是由于冠状动脉结扎,导致大量的炎症细胞,心肌细胞肿胀和变形,心肌坏死、消失的横向条纹。茜草属组的心肌结构和迪勒集团更完整的比虚假的操作组。心肌缺血再灌注引起的心肌微血管组织损伤和阻塞的冠状动脉血管,导致孤立的冠状动脉的血流量明显下降,如图1 (c)。快速的CF模型组降低,心中所想,迪勒干预显著改善了下降趋势。如图1 (d)的左心室收缩功能模型组明显低于在虚假的集团,而心中所想,迪勒干预有效地恢复心肌收缩性。

3.2。茜草属的治疗可以有效地抑制炎症和防止过度自噬和凋亡心肌细胞

再灌注损伤的炎症因素是重要原因。肿瘤坏死因子的表达式α,il - 1β,il - 6模型组炎症因素和迪勒组显著增加,而空出来的炎性因子水平组和迪勒组明显降低(图2(一个))。细胞凋亡在I / R损伤也是一个重要的过程。细胞凋亡因子的表达水平Caspase-3和Caspase-9在模型组显著增加(图2 (b))。Caspase-3和Caspase-9更多的表达水平下调迪勒,结果就是组比模型组。在大多数情况下,自噬帮助细胞更好地生存,而过度自噬会导致细胞死亡。模型中的自噬因素LC3-II组明显高于虚假的组中,迪勒和自噬因素和茜草属组明显低于模型组,显著高于假组(图2 (c))。

3.3。茜草属的植物能有效保护内皮细胞和心肌细胞治疗心肌I / R损伤

内皮功能障碍是一个重要的标志,I / R损伤的基础。LDH和CK心脏细胞的功能标记,而不,号,和ET-1内皮细胞的功能标记,它可以反映细胞功能的完整性。模型组LDH表达显著增加,而没有显著改变茜草属组和迪勒集团(图3(一个))。CK模型组显著降低,而没有显著改变迪勒集团和茜草属组(图3 (b))。模型组中没有表达显著降低,而没有表达茜草属组和迪勒集团(图并没有显著变化3 (c))。模型组NOS表达显著降低,但无显著改变观察茜草属组,迪勒集团(图3 (d))。ET-1水平模型组显著下降而茜草属组没有明显改变,而迪勒组明显降低(图3 (e))。

3.4。茜草属的植物能有效抑制NF -的激活κB通路

激活的NF -κB通路可以激活炎症反应(11,12),这个通路的激活可以由检测P65的水平,P-P65,我κ英航,》κ英航在细胞核和细胞。P-P65和导出的水平κBa模型组显著增加,蛋白质的表达P-P65和导出κ英航心中所想,迪勒组显著降低比模型组(图4(一))。NF -κ模型组B通路被激活而NF -的活动κ茜草属的植物治疗后B通路抑制。

4所示。讨论

I / R损伤的主要机制包括氧化应激损伤、细胞内钙超载,剧烈的生理pH值的变化,炎症反应,线粒体渗透性转换孔开放。在缺血再灌注的开始,有一个强烈的氧化应激反应,介导多种机制导致心肌细胞损伤和死亡。然而,临床上抗氧化缺陷已经处理混合的结果,这可能是部分原因是抗氧化剂进入细胞的能力。特定的抗氧化剂针对线粒体可能更有效13]。当发生心肌缺血时,细胞内钙超载的开始。钙超载导致线粒体功能障碍,由钙离子和许多酶被激活,促使心肌纤维的过度收缩。此外,钙超载还可以促进线粒体渗透性转换孔开放。在心肌缺血再灌注损伤的临床实践中,钙拮抗剂的使用并没有取得理想的效果(14]。近年来,连续突破了在单向线粒体转运蛋白的研究,这些研究将查找特定抑制剂对心肌再灌注损伤15]。线粒体膜通透性转换孔的非选择性通道是线粒体内膜,和开放的内膜导致线粒体膜的去极化和氧化磷酸化,进一步导致ATP损失和细胞死亡16]。急性心肌缺血时,细胞内的pH值低于7.0;再灌注期间,生理pH值迅速恢复由于洗脱乳酸,导致心肌细胞的过度挛缩和诱导心肌细胞死亡。因此,在心肌再灌注,药物可以用来抑制Na + - h +交易所或减缓心肌再灌注过程中避免致命的心肌再灌注损伤(17]。在这项研究中,我们对老鼠0.5毫克/公斤茜草提取物静脉注射;在先前的研究类似,剂量的100 - 400毫克/公斤(口头)的提取是有效的和无毒的18]。虽然在这项研究中使用的剂量更少,结果是类似于先前的研究在他们心中所想,没有显示显著治疗效果的药物毒性。

微循环损伤是一个最重要的I / R损伤的病理机制19,20.]。内皮细胞是心脏微循环的基础。I / R损伤可导致内皮细胞损伤、水肿、充血,炎性细胞浸润。此外,内皮细胞功能障碍会导致基本没有合成减少,血管张力增加。增加超氧化物阴离子的形成,导致氧化应激损伤和加重I / R损伤。内皮细胞的自噬可以提高细胞活性和生存能力。自噬激活血管内皮细胞是罕见的在正常生理过程和发生在病理血管内皮细胞的适应性反应21]。实验证实,I / R损伤可以促进核转录因子的激活KB-P65和调节自噬通过Beclin1,最终加重内皮细胞损伤(22]。此外,自噬还参与调节内皮细胞的其他重要的功能,如没有生产和释放以及血管生成和止血和血栓形成23]。

许多方法已经被用于预防和治疗缺血再灌注损伤。缺血预处理可以有效地减小心肌梗死的诱导短期不致命的缺血再灌注之前长期缺血的发生多次激活身体的保护机制(24]。在此基础上,缺血耐受诱导的生物活性物质。为临床应用这种方法是可行的;它也是可预测的,可控的,安全,容易进行。研究表明,治疗tanshinone花絮”被发现有一个antimyocardial I / R损伤效应(25]。此外,相关研究表明,ORF拾荒者可以显著提高收缩期心肌速率,心脏功能,再灌注心律失常,心脏骤停和临时26]。临床研究表明,别嘌呤醇可以减少峰值肌钙蛋白在急性st段抬高心肌梗死患者PCI。此外,不良心血管事件的发生率与对照组相比下降了13%在接下来的一个月后(27]。

5。结论

总之,茜草能有效减少心肌梗死的大小;抑制炎症、自噬和凋亡;和保护心肌细胞的结构和功能完整性和内皮细胞缺血再灌注损伤的治疗。然而,茜草属的机制调节NF -κB活动仍不清楚。进一步的实验应该旨在探索目标的调节NF -κB的活动。

数据可用性

和/或使用的数据集分析在当前研究可从相应的作者在合理的请求。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。