文摘

背景。脓毒症死亡率和发病率是加重急性肺损伤(ALI)和急性呼吸窘迫综合征。已发表的研究发现,hyperoside(忧郁)抗炎,在许多疾病的治疗效果。然而,忧郁的治疗是否能减弱sepsis-induced阿里仍然是模糊的。方法。在这项研究中,一个盲肠的结扎和穿刺(CLP)全身脓毒症小鼠模型构建。鼠标肺收获和评估使用蛋白质组学、免疫组织化学、免疫荧光、酶联免疫吸附试验促炎细胞因子。人肺微血管内皮细胞(HLMVECs)和脂多糖诱导(有限合伙人)在体外模型。结果。结果表明,忧郁的治疗减毒sepsis-induced阿里通过增加存活率,降低炎症因子表达和肺组织细胞凋亡。同时,忧郁预处理CLP-induced小鼠肺组织中血管生成的恢复。蛋白质组学检测表明,Atg13 HYP-mediated防范sepsis-induced阿里中发挥了至关重要的作用。的在体外实验显示,忧郁的治疗减毒LPS-induced HLMVEC Atg13-mediated调节自噬的影响。抑制自噬或沉默Atg13逆转对sepsis-induced阿里忧郁的保护作用。结论。综上所述,我们得出这样的结论:忧郁减毒sepsis-induced阿里通过调节自噬和抑制炎症。

1。介绍

脓毒症是世界范围的一个主要卫生负担,因为它是最难以承受的住院条件之一,也因为它是全球死亡率的主要原因(1,2]。它已成为一个主要临床急性肺损伤(ALI)的诱发因素,综合症包括多个急性呼吸衰竭疾病(3,4]。在阿里的发展引起的败血症,炎症和凋亡通路的upregulation破坏肺泡上皮细胞,上皮通透性增加,并导致水肿液的涌入到肺泡空间(5,6]。许多研究发现,炎症因子表达破坏血管的完整性,表明其参与血管损伤(7,8]。然而,它的作用和在炎症性肺损伤的作用机制尚未阐明。

Hyperoside(忧郁)(槲皮素3 -o- - - - - -β-d-galactopyranoside)是类黄酮糖苷提取杜鹃brachycarpum与抗炎作用[9,10]。先前的研究发现,通过核忧郁缓解过敏性气道炎症因子erythroid-related因子2 (Nrf2)途径激活11,12]。然而,忧郁是否能减弱sepsis-induced肺血管损伤仍不清楚。

在这方面,我们发现忧郁的治疗减毒sepsis-induced阿里。机械的研究发现忧郁治疗恢复血管内皮细胞通过调节Atg13-mediated自噬的功能。这项研究表明忧郁的治疗疗效和机制通过Atg13-mediated自噬在sepsis-induced阿里。

2。材料和方法

2.1。脓毒症动物模型

实验盲肠的结扎和穿刺(CLP)建立了脓毒症小鼠模型,如前所述[13]。简而言之,BALB / c小鼠被吸入异氟烷麻醉,然后22码的树桩被刺破一次针挤出少量粪便。盲肠被回正常腹腔位置,和腹部被关闭。之后,0.3毫升的生理盐水于皮下注射液体复苏。Sham-operated控制老鼠接受了相同的没有结扎手术或穿刺。老鼠被放置回笼子里,提供食物和水随意。我们每天监控死亡率为7天。的小鼠腹腔接种浓度的忧郁40毫克/公斤体重1小时前CLP检查忧郁的影响。对自噬调控,3-methyladenine (3-MA),一个自噬抑制剂,是腹腔内注射的浓度15毫克/公斤体重CLP前1小时,如前所述[14]。

2.2。细胞培养

人肺微血管内皮细胞(HLMVECs)(美国CA细胞应用Inc .)在EBM-2培养(包含内皮生长因子、CC3162 Lonza,医学博士,美国)补充5%的边后卫(美国CA Gibco) 37°C, 5%的公司₂每3 - 5天,95%的湿度和通道。P4-P7细胞用于实验的下一个阶段。脂多糖(LPS)(美国密苏里州Sigma-Aldrich;10μg / mL)治疗是应用于HLMVECs 1天在体外模型。然后,50μM忧郁或3毫米3-MA被用来研究自噬忧郁的监管作用。Atg13沉默(si-Atg13: 5′-AAGUCCCUUCUUGCUAUAACUAGTTCUAGUUAUAGCAAGAAGGGACUUTT-3′),核与Atg13被用来使转染到HLMVECs使用Lipofectamine 2000试剂(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)。转染后48小时,HLMVECs细胞收获用于后续实验。

2.3。酶联免疫吸附试验(ELISA)溶性炎性细胞因子

炎症因子的表达il - 6、il - 1β和肿瘤坏死因子-α在血清或HLMVEC细胞上清液检测利用ELISA试剂盒(Sen-Xiong公司中国上海)。协议后,上层清液保持在-80°C测量前,和运行标准和样品一式三份。OD_450年被减去背景,计算并绘制标准曲线。

2.4。细胞凋亡检测

一个膜联蛋白V/碘化propidium(π)染色工具包(美国马Abcam)是用于细胞凋亡检测。细胞(1×10³/ 96年)被播种-孔板24小时。此后,细胞使胰蛋白酶化,用磷酸盐,resuspended绑定缓冲,沾膜联蛋白V-fluorescein异硫氰酸酯和π在黑暗中在室温下15分钟。凋亡率由2000年NovoCyte流式细胞分析仪(安捷伦、钙、美国)。

2.5。RNA隔离和实时聚合酶链反应(PCR)

总RNA与试剂盒获得试剂(表达载体、钙、美国),其次是使用TransScript一体化的互补脱氧核糖核酸合成第一链cDNA合成SuperMix (Transgen生物技术,北京)。使用Bio-Rad PCR进行PCR仪(美国CA Bio-Rad) 2 x Taq PCR反应混合液(Solarbio,北京)后,制造商的协议。褶皱的变化相对量化方法计算了2^−△△Ct的方法。PCR引物在表相连1。

2.6。小管形成分析

在体外新血管形成在纤维蛋白测量矩阵。治疗后,serum-starved HLMVECs内皮的基础培养基被播种到Matrigel-coated板(10⁵细胞/到6井)(美国新泽西州BD生物科学)和孵化12小时的37°C。管状结构形成于基底膜基质被相衬显微镜观察和拍照,和新成立的管子的长度在10个随机选择的字段/测量。

2.7。免疫组织化学和免疫荧光分析

肺组织样本在10%福尔马林溶液固定,嵌入在石蜡,分段在5μm。部分是沾末端转移酶的dUTP缺口末端标记(TUNEL)组织学评价。部分研究了使用一个Axiophot光学显微镜(蔡司、从、德国)。CD31检测,部分被固定在10%福尔马林溶液和CD31染色。用荧光显微镜检查的部分(尼康、东京、日本)和数码相机拍摄。

2.8。统计分析

连续变量表示通过±标准差。我们用单向方差分析比较使用GraphPad棱镜(GraphPad、钙、美国)。一个P值≤0.05表示一个统计上的显著差异。

3所示。结果

3.1。忧郁的治疗减毒Sepsis-Induced阿里

CLP后我们监视老鼠生存有或没有忧郁(40毫克/公斤)为7天(图检查对感染性忧郁影响死亡率1(一))。根据kaplan meier生存曲线,结果表明,小鼠CLP-induced脓毒症7天后没有生存。然而,忧郁预处理提高了生存率(图1 (b))。ELISA检测(3天后CLP)显示,炎症因子il - 1的表达β肿瘤坏死因子-α中电控股集团,il - 6显著增加。然而,忧郁预处理降低CLP-induced炎性因子的表达(图1 (c)- - - - - -1 (e))。免疫组织化学分析TUNEL检测表明,细胞凋亡与CLP-induced脓毒症小鼠肺组织增加。然而,忧郁预处理组的凋亡率降低(数字1 (f)和1 (g))。为CD31免疫荧光染色(CLP) 3天后显示微血管内皮细胞与CLP-induced脓毒症小鼠肺组织被摧毁。然而,血管生成增加忧郁预处理组(数字1 (h)和1(我))。

3.2。Atg13 HYP-Mediated防范Sepsis-Induced阿里中发挥了重要作用

蛋白质组学分析表明,忧郁治疗导致的异常表达蛋白在小鼠肺组织sepsis-induced阿里,包括Atg13表达忧郁治疗组(图2(一个))。KEGG通路富集分析还发现自噬途径丰富(图2 (b))。RT-qPCR检测表明,忧郁治疗Atg13和LC3表达增加(数据2 (c)和2 (d))。这表明Atg13发挥了重要作用HYP-mediated保护sepsis-induced阿里通过激活自噬。

3.3。忧郁的治疗减毒LPS-Induced HLMVEC Atg13-Mediated调节自噬的影响

HLMVECs用于在体外模型与10μg / mL有限合伙人治疗1天揭示Atg13-mediated自噬是否发挥了重要作用。RT-qPCR检测的结果表明,忧郁治疗基于感应Atg13和LC3表达增加了有限合伙人(数字3(一个)和3 (b))。然而,沉默的Atg13 Atg13和LC3的表达下降。自噬抑制剂3-MA治疗显著降低LC3表达式但不能抑制Atg13表达式。这表明Atg13发挥了重要作用在HYP-mediated保护sepsis-induced阿里通过激活自噬。

ELISA检测炎症因子TNF的表达——推断α,il - 1β,il - 6在HLMVEC培养LPS-induced组显著增加。然而,忧郁治疗抑制LPS-induced炎性因子表达。或者自噬抑制恢复差别Atg13对这些炎症因子表达(图3 (c)- - - - - -3 (e))。

流仪分析膜联蛋白V / PI染色显示,忧郁治疗抑制LPS-induced HLMVEC细胞凋亡。Atg13或抑制自噬的差别,对这些HLMVEC凋亡(数据恢复3 (f)和3 (g))。的在体外管形成HLMVECs表明LPS处理减少血管生成分化的能力。忧郁的治疗恢复血管生成LPS-induced条件下分化能力。Atg13或差别,对这些基因的抑制自噬了忧郁的保护作用HLMVEC函数在有限合伙人的条件下(数字3 (h)和3(我))。

3.4。抑制自噬逆转对Sepsis-Induced阿里忧郁的保护作用

ELISA检测推断,炎症因子il - 1的表达β肿瘤坏死因子-α和血清中il - 6忧郁预处理后的CLP组明显减少。然而,3-MA治疗恢复CLP-induced炎性因子的表达(图4(一)- - - - - -4 (c))。免疫组织化学分析TUNEL检测表明,在小鼠肺组织细胞凋亡的减少CLP-induced忧郁预处理后脓毒症。然而,细胞凋亡是3-MA恢复治疗组(数字4 (d)和4 (e))。为CD31免疫荧光染色显示微血管内皮细胞在小鼠肺组织恢复CLP-induced忧郁预处理后脓毒症。然而,血管生成减少3-MA治疗组(数字4 (f)和4 (g))。

4所示。讨论

脓毒症是一种常见的和潜在的致命的系统性疾病,通常导致无法控制炎症、组织损伤,和多器官功能衰竭。脓毒症及其并发症的主要原因是重症监护病房患者的死亡率(15,16]。过度的炎症和严重的肺上皮细胞凋亡被认为是潜在的机制sepsis-induced阿里(17,18]。在我们的研究中,我们发现忧郁的治疗减毒sepsis-induced阿里通过增加小鼠的生存。研究还发现,忧郁治疗抑制炎性细胞因子的表达和肺上皮细胞凋亡。先前的研究还证实,忧郁有抗炎效应(19,20.]。

在这项研究中,蛋白质组学检测表明,Atg13表达增加了小鼠的肺组织中忧郁治疗组。在目前的研究中,我们系统地研究了个体的重要性ATG13 ULK1复杂地层交互网站,招聘网站自噬小体的形成,和自噬诱导21,22]。本研究的数据的差别还发现,对这些Atg13抑制autophagy-related蛋白LC3表达式。Atg13沉默3-MA治疗类似的效果,而逆转对sepsis-induced阿里忧郁的保护作用。在体外实验证实,忧郁治疗抑制HLMVEC Atg13-mediated调节自噬的影响。结果还发现,忧郁治疗抑制LPS-induced炎性因子表达和HLMVEC细胞凋亡。同时,忧郁的治疗恢复了管形成HLMVECs的能力。的在活的有机体内实验进一步证实,忧郁的治疗可以抑制自噬激活sepsis-induced阿里。自噬抑制了忧郁的保护作用与sepsis-induced阿里。先前的研究还表明,忧郁减毒怀孕损失通过激活自噬和抑制炎症在老鼠模型中(23]。研究还发现,脓毒症的主要原因是产妇发病率、病死率高的并导致重大围产期的损失。妊娠和产褥期生理变化使孕妇更容易对早期诊断脓毒症,也构成了挑战,因为重叠的临床特征和实验室值(24]。系统性炎症,以高敏c反应蛋白,也被假设在不孕症中发挥作用和围产期损失(25]。因此,抑制炎症由脓毒症具有重要的临床意义。

先前的研究已经证实了忧郁的炎症HT22 Wnt /细胞通过上调SIRT1的活动β连环蛋白和声波刺猬通路(10]。研究还发现,忧郁变弱OVA-induced过敏性气道炎症通过激活Nrf2 [12]。但监管机制HYP-attenuated sepsis-induced炎症还不清楚,需要进一步的澄清。

总之,我们建议忧郁减毒sepsis-induced阿里通过调节Atg13-mediated自噬和抑制炎症。然而,具体的监管机制需要进一步验证。本研究的结果可以帮助推测忧郁的治疗价值。

数据可用性

生成的数据集和分析在目前的研究可从相应的作者在合理的请求。

伦理批准

这种动物实验是通过上海光华医院中西医综合医院(SZY20210326)。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

本研究支持的未来中医药科技发展计划项目(2022)(没有。wl - yjxys - 2022005 k),特别支持项目的创新团队在上海长宁区疫情预防控制(2020)。