文摘
腰椎管狭窄症(LSS),可导致不可逆的神经损伤和功能障碍,特点是肥大和纤维化韧带flavum(低频)。然而,这种现象的潜在机制仍不清楚。在最近的研究中,Smurf1的影响,一种E3泛素连接酶,在促进低频的纤维化和氧化应激是调查,和它的底层机制探索。氧化应激和fibrosis-related标记的表达组织的评估腰椎狭窄(LSS)和腰椎间盘突出症(LDH)。接下来,排名前十的E3泛素连接酶的表达,从基因表达综合(GEO)获得数据集GSE113212, LDH和LSS评估,证实Smurf1表达明显调节LSS组。此外,Smurf1超表达促进低频细胞的纤维化和氧化应激。随后,NRF2,氧化应激的重要转录因子和纤维化,预测是Smurf1的目标。从力学上看,Smurf1直接与Nrf2和加速Nrf2泛素化和退化。总之,目前的研究表明,Smurf1促进低频的纤维化和氧化应激诱导的发展LSS通过促进Nrf2泛素化和退化。
1。介绍
腰椎狭窄(LSS)是最常见的脊柱疾病老年患者和关闭与腰痛、肢体麻木、和间歇性跛行1,2]。压缩的马尾和腰椎神经根往往导致下肢的感觉和运动功能障碍,从而导致严重残疾(3]。LSS发展归因于多种因素,包括椎间盘突出,一方面关节退行性变,肥大的韧带flavum (HLF) [4,5]。在以前的研究中,纤维化HLF被认为是主要的病理。组织学检查正常低频由大约20%胶原纤维和弹性纤维(80%4,6]。相反,HLF展览组织纤维化改变与增加胶原纤维和弹性纤维的损失。最近,几项研究已经报道的纤维化HLF在细胞和组织水平。然而,到目前为止,HLF纤维化的分子机制仍不清楚。
活性氧(ROS)生成导致氧化应激时超过抗氧化酶的能力,和过多的活性氧产量与衰老的疾病。(7,8]。强烈的炎症反应和重要器官的纤维化,包括心脏、肾脏、肺、肝脏,可以引起过多的活性氧。先前的研究澄清,过氧化氢酶表达减少HLF LSS患者的组织(9]。另一项研究报道,氧化应激介导老年性HLF通过促进纤维化炎症,并通过促进细胞凋亡MAPK-AKT通路(10]。综合来看,这些研究都证实,氧化stress-mediated低频纤维化LSS发展中扮演着重要的角色,然而在HLF发生氧化应激失调的具体原理尚不清楚。
先前的研究已经报道,泛素化导致了年龄相关性疾病。亨特等人报道,敌对的肌纤维大小和肌肉蛋白质质量控制由泛素连接酶控制UBR4衰老期间(11]。香港等人报道,前列腺素D2 / DP1轴抑制老年性Th1激活和随后的高血压反应在雄性老鼠通过增加NEDD4L-mediated T-bet泛素化降解[12]。此外,多个证据表明一个重要函数的泛素化调节氧化应激和纤维化。王等人报道,FBW7调节肺上皮干细胞衰老和纤维化通过调节端粒脱帽(13]。然而,监管机制发展的泛素化HLF仍不清楚。
核factor-erythroid两个相关因子2 (Nrf2)是一个重要的监管机构的抗氧化酶(14]。Nrf2调节细胞氧化还原平衡通过促进抗氧化防御组件的活动,包括血红素oxygenase-1 (HO-1)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(氧化酶),谷胱甘肽(15),失调Nrf2与各种氧化应激相关疾病有关,包括神经退行性疾病(16)、心血管疾病(17),肺部疾病(18),和癌症(19]。此外,Nrf2激活可以防止细胞衰老,而抑制Nrf2明显加速衰老细胞的激活(20.),这表明有一个抗衰老的影响。此外,Nrf2表达随着年龄和活动减少。在最近的研究中,Smurf1的表达,E3泛素连接酶被发现在LSS组明显增加,和Smurf1过度加速氧化应激和低频细胞的纤维化。此外,Smurf1促进ubiquitination-mediated Nrf2退化。
2。材料和方法
2.1。病人和样本收获
所有实验协议经伦理委员会批准的海军医科大学(2016 sl - 034 - 01)。韧带flavum样本收集来自27个病人(10个女性和17名男性)后腰椎减压手术去除低频组织从2021年6月到2021年12月(表1)。HLF集团15低频标本是从LSS低频肥大患者,对照组,12个标本收集从简单的腰椎间盘突出症患者和没有低频肥大。低频的厚度是量化方面联合水平t2加权磁共振成像(MRI)对所有27个病人使用图像存档和通信系统(PACS)的软件。脊柱外科医生的专家评估每个病人的价值的三倍,指定的低频厚度和平均价值。根据先前的研究,肥大的低频被定义为低频厚度> 4毫米(21,22]。广泛或与低频部分椎板切除术切除在所有患者进行手术。切除的韧带flavum在4°C生理盐水冲洗,然后马上派人去检查。
2.2。生物信息学分析
的基因表达谱数据GSE113212从基因表达获得综合(GEO)数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/),国家生物技术信息中心(NCBI)。这个数据集是基于GPL17077平台,包含共有8个样本,包括4肥厚性韧带flavum样本老年人个人和4 non-hypertrophic年轻的个体样本。十大差异表达E3泛素连接酶从这个数据集得到调查监管HLF泛素化的发展。UbiBrowser (http://ubibrowser.ncpsb.org.cn/ubibrowser/),一个目标预测工具应用于预测的目标选择的泛素连接酶。
2.3。实时定量PCR (qPCR)
大约3立方米的韧带flavum组织在800年被均质μL的试剂盒。总RNA分离试剂盒试剂(美国英杰公司)根据制造商的指示,并进一步通过使用iScript cDNA反向转录合成装备(bio-rad)。实时PCR和分析进行了如前所述[23]。的褶皱变化由2 -目标基因进行了分析ΔΔCt方法和18岁是作为内部控制。
2.4。免疫印迹分析
西方墨点法进行了像以前23]。总之,组织从LSS和LDH患者的血清总蛋白提取通过使用一个商业工具(Solarbio BC3701,中国),以下主要使用抗体:anti-Collagen III(1: 500年,Abcam ab6301);Abcam anti-Collagen I(1: 1000年,ab138492);anti-a-SMA (0.5μg / ml, Abcam ab7817);anti-Smurf1(1: 1000年,Abcam ab57573);anti-Nrf2(1: 1000年,Abcam ab62352);anti-ubiquitin(1: 1000年,Abcam ab140601);Abcam anti-GAPDH(1: 5000年,ab9485)。
2.5。免疫组织化学(包含IHC)
为包含IHC LSS一直formalin-fixed和石蜡包埋的组织分为5 m连续切片。包含IHC执行。主要抗体:anti-Collagen我(1:1500年,Abcam ab138492);anti-Collagen III(1: 200年,Abcam ab6301);anti-a-SMA (0.05μg / ml, Abcam ab7817);Abcam anti-Smurf1(1: 1000年,ab57573)。
2.6。人类如果细胞隔离
韧带flavum细胞被孤立如前所述[21,24]。简而言之,如果组织被PBS洗3次,切成小块测量约0.5毫米3和0.2%的I型胶原酶消化一小时(Gibco),消化碎片被冲洗在DMEM (Gibco),补充10%的边后卫(美国Glpbio),和100 U /毫升青霉素。第三段后细胞用于实验。
2.7。活性氧(ROS)测定
ROS水平如果组织评估,组织活性氧(ROS)检测设备(Bestbio中国)根据指令。低频的ROS水平细胞被C11-BODIPY调查评估分析工具包(英杰公司)根据指令。1×104低频细胞被播种在96 -孔板培养30分钟和2μM C11-BODIPY探针,ROS的数量使用流式细胞分析仪测定。
2.8。MDA和谷胱甘肽含量
组织匀浆MDA与谷胱甘肽含量和细胞裂解分析脂质过氧化工具包(σ,MAK085)及谷胱甘肽分析工具包(σ,CS0260)按照标准协议。
2.9。转染
过度表现Smurf1,慢病毒生产Smurf1购买从GeneChem(上海,中国)和低频感染细胞根据指令。转染24小时后,转染后细胞出了额外的24小时,然后提取以下实验。
2.10。Co-Immunoprecipitation (co-IP)
细胞溶解后在NP-40溶菌作用解决方案中,如果细胞溶解产物被添加到免疫沉淀反应复杂,旋转在一夜之间被涂上后在4°C anti-Smurf1或anti-Nrf2抗体4小时。第二天,PBS用于冲洗蛋白质A / G珠三次。免疫沉淀反应复杂然后检查使用anti-Smurf1或anti-NRF2抗体在免疫印迹。
2.11。统计分析
从每个实验给出的数据 。SPSS 20.0统计分析。学生的 - - - - - -测试是用来评估两组之间的意义,以及超过两组是由单向方差分析其次是Tukey-Kramer多个比较测试用于确定数据超过两组。定义为统计上的显著差异 。
3所示。结果
3.1。在低频组织纤维化和氧化应激调节HLF病人
澄清的主要原因是HLF LSS,韧带的厚度flavum通过MRI评估。图1(一)表明,低频的厚度明显增加HLF病人。与此同时,先前的研究已经证实,低频纤维化的病理进展的重要性LSS。因此,胶原蛋白的表达我,胶原蛋白三世αsma是评估中存在和免疫印迹HLF和LDH的低频组织。我们发现,胶原蛋白的表达我,胶原蛋白三世αsma是HLF组显著增加(数据1 (b)和1 (c))。此外,结果进一步证实了包含IHC染色(图1 (d))。鉴于氧化应激调节老年性HLF通过促进纤维化,氧化应激标志物表达HLF组ELISA测定。数据2(一个)和2 (b)表明,MDA含量和活性氧水平HLF组显著增加,而谷胱甘肽含量和SOD活性明显降低HLF组。这些数据表明,氧化应激和韧带flavum纤维化在HLF显著增加。
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3.2。Smurf1是调节低频组织从HLF病人
调查发展的泛素化LSS的规定,前十(RNF67、HERC6 RNF218, SMURF1, NEDL2, WWP1, HERC4, SMURF2, RNF218,和RNF58)差异表达E3泛素连接酶从GSE113212获得,和这10个基因的表达在HLF评估和LDH患者使用中存在。数据3(一个)和3 (b)显示的mRNA水平RNF218 Smurf1 HLF患者明显增加。鉴于Smurf1 mRNA表达最调节HLF组,Smurf1蛋白表达被西方墨点法和包含IHC进一步证实了。类似于存在的结果,西方墨点法和包含IHC数据显示的表达式Smurf1在HLF显著增加患者与LDH患者相比(数字3 (c)和3 (d)),这表明Smurf1可能导致HLF的发展。
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3.3。Smurf1促进低频细胞的纤维化和氧化应激
调查是否Smurf1至关重要的纤维化和氧化应激HLF, Smurf1 pcDNA-Smurf1表达的有力,效率是由存在决定和免疫印迹(数字4(一)和4 (b))。我们下一个验证的功能Smurf1纤维化和低频细胞的氧化应激。正如预期的那样,胶原蛋白,胶原蛋白三世αsma表达显著增加了Smurf1(数据4 (c)和4 (d)),这表明Smurf1提升低频细胞的纤维化。同样,如果细胞的氧化应激调节了Smurf1就是明证的upregulation MDA含量和活性氧水平(图4 (e)谷胱甘肽的差别),对这些内容和SOD(图4 (f))。总之,这些数据表明Smurf1促进低频细胞的纤维化和氧化应激。
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3.4。Smurf1促进低频细胞的纤维化和氧化应激通过促进Nrf2的泛素化和退化
先前的研究发现,Smurf1促进氧化应激,调节肾脏纤维化的polyubiquitination Nrf2 [25]。鉴于Nrf2是一个重要的转录抑制氧化应激和纤维化,我们推测Smurf1可能促进低频的纤维化和氧化应激细胞通过调节Nrf2。为此,UbiBrowser应用于预测的目标Smurf1和Nrf2(基因名称:NFE2L2)被发现的潜在目标Smurf1(补充图1)。接下来,Nrf2的表达分析在低频组织HLF和LDH的存在和免疫印迹。如数据所示5(一个)和5 (b),没有显著差异的mRNA水平之间Nrf2 LDH组和HLF集团,而Nrf2的蛋白质水平显著增加在HLF组与LDH组。同样,Smurf1超表达没有影响NRF2 mRNA但减少NRF2蛋白表达(数字5 (c)和5 (d)),这表明Nrf2表达式是由Smurf1-mediated退化。
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互惠co-immunoprecipitation分析进行进一步确认Nrf2地位Smurf1的衬底。如图6(一)、积极Nrf2信号中检测出的蛋白质复合体推倒anti-Smurf1抗体。同样,积极Smurf1信号也发现的蛋白质复合体推倒anti-Nrf2抗体,表明Nrf2 Smurf1的直接目标。此外,蛋白质的稳定性Nrf2由环己酰亚胺试验验证(CHX)低频细胞有或没有Smurf1超表达。图6 (b)表明Nrf2蛋白质稳定性显著降低在Smurf1超表达细胞。接下来,分析了泛素化的Nrf2 CO-IP anti-Nrf2抗体和随后的免疫印迹anti-ubiquitin抗体。图6 (c)表明Smurf1-OE显著增加Nrf2的泛素化低频细胞。综上所述,我们的数据表明,Smurf1直接与Nrf2和加速其泛素化和退化。
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4所示。讨论
腰椎管狭窄症(LSS)是最常见的脊柱疾病之一在老年患者中,特点是HLF。先前的研究表明,氧化应激和纤维化的进展HLF [4]。然而,这种现象的潜在机制仍不清楚。在目前的研究中,我们表明,Smurf1促进氧化应激和纤维化的韧带flavum通过促进Nrf2泛素化降解,就是明证:(1)在低频组织纤维化和氧化应激调节HLF病人;(2)Smurf1调节低频组织免受HLF患者;(3)Smurf1促进低频细胞的纤维化和氧化应激;(4)Smurf1促进低频细胞的纤维化和氧化应激通过促进Nrf2的泛素化和退化。纤维化已确定作为一个关键的发展过程HLF [4]。众所周知,氧化应激是体内疾病的一个重要因素,通常会导致许多疾病的发病机制通过调节组织纤维化(10]。穆罕默德等人报道,necroptosis-mediated炎症会导致肝脏的纤维化和加速老化小鼠模型中增加氧化应激(26]。检验员等人证明损失的细胞氧化还原内稳态加速profibrotic myofibroblast表型,导致持续的纤维化与年龄增长有关的(27]。王等人表明,氧化应激,FBW7调节细胞衰老和组织纤维化通过端粒脱帽(13]。同样,壮族等人发现,氧化应激介导老年性HLF通过促进纤维化通过激活MAPK和AKT通路(10]。与之前的研究一致,我们也发现,氧化应激和纤维化明显增加HLF患者与LDH控制。然而,氧化应激和纤维化的监管机制失调HLF仍不清楚。
先前的研究表明,蛋白质泛素化是一个重要的监管转译后的修改控制氧化应激和纤维化(28]。在当前的研究中,我们提供机械的见解,Smurf1参与的发展HLF通过调节氧化应激和纤维化Nrf2泛素化。首先,我们的数据表明,Smurf1调节HLF病人,和超表达Smurf1提拔的氧化应激和纤维化韧带flavum细胞。与我们的研究结果一致,其他研究也澄清,Smurf1促进多个fibrosis-related疾病的发展。七等人报道,mir - 129 - 5 - p Smurf1和压抑的PTEN的泛素化,从而改善心肌纤维化和氧化应激的老鼠(瑞士法郎29日]。陈等人证明connexin32 kindey纤维化改善糖尿病小鼠的加速polyubiquitination和退化Nox4通过抑制Smurf1表达式(30.]。第二,我们的数据表明,Nrf2 Smurf1的目标,和Smurf1促进Nrf2泛素化和退化。越来越多的研究表明,Nrf2是一个重要的负调节氧化应激和纤维化。摩氏等人证明了激活患者Nrf2纳什与炎症的年级,和体内的数据表明,Nrf2激活在慢性肝病保护减轻纤维发生和进展的肝细胞癌(31日]。马伦等人报道,KLF2 upregulation深刻减轻纤维化和氧化应激通过活化HSC部分Nrf2 [32]。此外,泛素化和proteasome-mediated Nrf2退化已被记录。刘等人报道,BDH2加速的泛素化降解Nrf2和增加活性氧的积累33]。陈等人报道,IKK促进Nrf2的泛素化,进一步促进氧化stress-mediated肾脏的损伤与肥胖相关的肾病(34]。在这里,我们表明,Smurf1促进Nrf2的泛素化和退化,因此,促进氧化应激和低频的纤维化。
5。结论
在目前的研究中,我们明确低频纤维化和氧化应激的调节机制,揭示特定的E3泛素连接酶,Smurf1 HLF的发展。
数据可用性
原始数据用来支持研究结果在本文给出的数据。
伦理批准
所有实验协议经伦理委员会批准的海军医科大学(2016 sl - 034 - 01)。
同意
所有受试者签署知情同意。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
陈Yifei顾、金泉胡和王同样都贡献给了工作。
确认
这项研究支持由中国国家自然科学基金(81902235、81902235和81902235)和上海帆船项目[19 yf1447600]。
补充材料
Nrf2(基因名称:NFE2L2)被发现使用UbiBrowser Smurf1的潜在目标。(补充材料)