文摘

阿尔茨海默病(AD)的特点是慢性神经炎症介导的神经胶质细胞的特异表达功能。心磷脂(CL)是磷脂通常局限于内线粒体膜;然而,在人类血清中发现,表明它可以存在于细胞外空间,这可能与附近的细胞。尽管CL已被证明调节小胶质细胞的几个函数toll样受体(TLR) 4-dependent方式,细胞外CL在星形胶质细胞的影响是未知的。除了他们的自我平衡的功能,星形胶质细胞参与大脑的神经免疫反应和表达TLR 4。因此,我们推测,细胞外CL(1)调节星形胶质细胞分泌的细胞因子和细胞毒素,以及他们吞噬活动,和(2)行为与星形胶质细胞相互作用TLR 4。我们证明了CL抑制脂多糖(LPS)诱导的分泌细胞毒素和表达胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)由人类U118毫克星形细胞。CL单独移植人类星形细胞的吞噬活性和初级小鼠星形胶质细胞。CL结合有限合伙人移植的分泌白介素(IL) 1β由星形细胞。此外,CL单独增加单核细胞的分泌化学引诱物蛋白(MCP) 1星形细胞,这是被TLR 4-specific拮抗剂tak - 242。我们证明了CL上调MCP-1分泌没有的自然载体蛋白,β2-glycoprotein 1,表明CL在大脑中可能具有生物活性的蛋白不存在。最后,我们表明,氯会使星形TLR - 4的表达,这意味着CL从事这种受体,激活已被证明导致其退化。总体而言,我们的研究扩展了CL调节的细胞类型的功能列表,并提供证据表明CL,或包含这个磷脂脂质体可以用来调节星形胶质细胞的特定神经免疫功能。

1。介绍

阿尔茨海默病(AD)是一种无法治愈的神经退行性疾病,临床表现为进行性认知功能减退和记忆障碍。这种疾病的特征是一种慢性神经炎症状态,驱动部分的功能失调nonneuronal胶质细胞(1]。星形胶质细胞是最丰富的一种胶质细胞在中枢神经系统(CNS)。他们支持大脑内稳态和神经元生存至关重要2,3]。此外,星形胶质细胞参与免疫反应的调节中枢神经系统,这个角色一直被认为仅仅小胶质细胞(4]。在广告的大脑,星形胶质细胞功能成为由于长期存在特异表达-淀粉样蛋白的聚集β肽和炎症介质浓度升高5]。等病理条件下稳态星形胶质细胞转变成活性状态,表现为神经胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)的过度表达和增强的分泌细胞因子和细胞毒素1,3,6- - - - - -8]。此外,反应性星形胶质细胞的吞噬能力一直在广告(据报道受损9]。特异表达星形函数导致周围的细胞和组织的损伤,导致了广泛的广告大脑神经元的死亡。因此,识别的分子可以减少这种被动状态星形胶质细胞可以促进新型疗法有效地减少神经炎症的发展广告。

心磷脂(CL)是线粒体磷脂主要坐落在哺乳动物细胞内线粒体膜。CL支持线粒体电子传递链的功能和参与线粒体功能失调和凋亡过程的退化10,11]。CL可以从内在到外在搬迁线粒体膜,它充当一个消除信号线粒体功能失调导致mitophagy和细胞凋亡11- - - - - -13]。此外,CL已经检测到血液中,它可以绑定到载体蛋白β2-glycoprotein 1 (14),这表明它的存在以外的细胞。尽管细胞外CL的起源仍然是未知的,它提出了CL可以释放到细胞外空间从受损或死亡的细胞,它可以与附近的细胞受体相互作用,包括星形胶质细胞(11,15- - - - - -17]。

toll样受体(TLR) 4已经涉及的分子目标CL (16,17]。TLR - 4属于模式识别受体结合的家庭有关的分子模式(抑制)或其分子模式(pamp),在先天免疫反应(扮演必不可少的角色18,19]。TLR 4-mediated炎症机制在神经退行性疾病,包括广告(18]。例如,TLR - 4触发特定的神经胶质细胞的激活信号通路上调基因的表达编码范围广泛的炎症介质,包括细胞因子白介素(IL) 1β、白介素、肿瘤坏死因子(TNF)α,干扰素(IFN)β,单核细胞化学引诱物蛋白- 1 (MCP),和干扰素-γ全身的蛋白质——(IP) 10 (20.- - - - - -22]。

先前的研究已经证明了CL的调节能力TLR 4-dependent信号在不同的细胞类型。例如,CL-enriched脂质体促进吞噬作用和抑制细胞因子分泌的主要人类monocyte-derived巨噬细胞和小鼠macrophage-like RAW264.7细胞(16]。指针等。15]表明CL降低细胞毒性的人类THP-1 microglia-like细胞对人类SH-SY5Y神经元细胞。此外,这项研究表明CL降低TNF -的释放α干扰素-γ和脂多糖(LPS)刺激THP-1细胞。最近的一项研究表明,CL诱发MCP-1的分泌鼠BV-2和人类THP-1 microglia-like细胞TLR 4-dependent方式(17]。此外,CL移植的吞噬活动主要鼠小胶质细胞和THP-1 TLR 4-dependent microglia-like细胞的方式。CL以来与TLR 4所示在其他类型的细胞和星形胶质细胞表达细胞表面的TLR - 4 (16,17,23,24),细胞外地CL 5月发布与星形胶质细胞相互作用TLR 4。因为没有研究已经证明星形胶质细胞的免疫功能调节细胞外CL,我们研究了磷脂的影响在一些星形胶质细胞的功能参数,包括他们GFAP表达,吞噬活动,分泌细胞因子和细胞毒素。此外,我们测试了一个假设,调节细胞外CL对星形胶质细胞的影响是由TLR 4。

2。材料和方法

2.1。试剂

Bisbenzimide(赫斯特33258年),从牛心CL,细胞松弛素B,完成™迷你蛋白酶抑制剂的鸡尾酒,1,4-dithiothreitol(德勤),3 - (4 5-dimethyl-2-thiazoyl) 2, 5-diphenyl-2H-tetrazolium溴化(MTT)、N -乙二胺盐酸盐(1-naphthyl), N, N-dimethylformamide,有限合伙人大肠杆菌055:B5、poly-d-lysineσ104磷酸酶底物,TLR - 4拮抗剂tak - 242 (# 614316), fluoroshield 4 ,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)和钠脱氧胆酸盐是来自Sigma-Aldrich(奥克维尔,加拿大)。重组人干扰素-γ和il - 1β以及酶联免疫吸附试验(ELISA)对人类il - 1开发工具包β、MCP-1 IP-10,从PeproTech购买(Embrun,加拿大)。Anti-rabbit免疫球蛋白辣根过氧化物酶(合)与抗体(# 7074年代)和生物素化的蛋白质梯检测包(# 7727)购买来自新英格兰生物学实验室(美国马伊普斯维奇)。OptiLadder购买从应用生物材料(里士满,公元前,加拿大)。异硫氰酸荧光素(FITC)外部标记μm荧光聚苯乙烯乳胶珠子从刘海购买实验室(美国在渔民)。德克萨斯红fluorophore-conjugated MemBrite修复膜染色,CellBrite™解决555年和CellBrite™解决640人从Biotium购买(弗里蒙特、钙、美国)。反β肌动蛋白抗体I-19 (# sc - 1616 r)从SantaCruz购买生物技术(美国达拉斯,TX)。兔子anti-GFAP抗体(# Z0334)购买安捷伦(美国加利福尼亚州圣克拉拉)。山羊anti-rabbit免疫球蛋白CY5——或者CY3-labeled抗体(# 111-165-003)从杰克逊ImmunoResearch购买(西树林,宾夕法尼亚州,美国)。Anti-mouse突触后密度蛋白-95 (PSD)抗体(# ma1 - 045),鼠标anti-TLR 4抗体(# 5015348;克隆HTA125),和所有其他试剂购自费舍尔科学(渥太华,加拿大)。

2.2。细胞培养模型

人类U118 MG细胞从美国购买类型文化集合(写明ATCC马纳萨斯,弗吉尼亚州,美国)。他们拥有astroglioma形态,因而被用作星形胶质细胞模型。人类神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞捐赠的r·罗斯博士(福特汉姆大学生物科学系的布朗克斯,纽约,美国)。杜尔贝科修改鹰的培养基培养细胞营养混合物F-12火腿(DMEM-F12)补充牛犊牛血清(CBS) 10%,青霉素(100 U /毫升),链霉素(100μg / ml)、两性霉素B (t - 75 500 ng / ml)烧瓶37°C湿润5%孵化有限公司2和95%的空气氛围。

动物实验是通过英属哥伦比亚大学的动物保健委员会和执行委员会依照加拿大动物保健标准。C57BL / 6 ncrl老鼠收到查尔斯河实验室(蒙特利尔,魁北克,加拿大),保持在动物设施,安置在消毒,filter-topped笼子。是努力减少动物处理和使用。小鼠混合皮质细胞培养得到从产后第一天到四小狗如前所述25]。短暂,皮质没有脑膜收集在寒冷的汉克的平衡盐溶液(哈佛商学院)和使胰蛋白酶化(0.25%胰蛋白酶在hbs) 37°C为20分钟。DNase我添加到暂停15分钟。暂停在400 g离心5分钟,和上层的丢弃。大力丸是resuspended获得单细胞悬液中含10%胎牛血清的DMEM(的边后卫)和青霉素和链霉素。细胞转移到poly-D-lysine涂布t - 75瓶,在37°C,孵化有限公司5%2,和媒体改变了每两到三天。在八天体外,t - 75瓶180 rpm 60分钟发生了动摇分离小胶质细胞。包含小胶质细胞被丢弃的媒体,新媒体补充道。t - 75瓶然后动摇在240 rpm 6 h少突细胞前体细胞分离。媒体被移除,t - 75瓶洗两次与温暖的PBS,和新媒体被添加到星形胶质细胞层。星形胶质细胞的文化是维持在37°C, 5%的公司2,与媒体改变了每两到三天。

2.3。分泌的il - 1β,IP-10 MCP-1 U118 MG星形细胞和细胞毒素

U118 MG星形细胞被镀在24-well盘子的浓度 细胞在一毫升/毫升DMEM-F12含有抗生素和哥伦比亚广播公司(CBS)的5%。一个用于每个实验条件。实验进行的无血清条件下,哥伦比亚广播公司(CBS)被替换下场与B-27补充维生素A(费舍尔科学)。细胞培养24小时,允许他们的坚持。CL在等离子体浓度相似水平检测从禁食人类(0.5 -20μg / ml) (14)或其汽车解决方案(1%乙醇)添加到培养基,后跟一个15分钟的潜伏期。U118 MG星形细胞处理有限合伙人(400 ng / ml), il - 1β加干扰素-γ(400 U /毫升,20 pg / ml,分别),或者他们的车辆(PBS)的解决方案。没有汽车的解决方案(PBS或1%乙醇)有显著影响的可行性U118 MG星形细胞。在一个子集的实验中,前30分钟的CL, 10μM tak - 242添加到U118 MG星形胶质细胞的培养基。MCP-1浓度、IP-10和il - 1β在上层清液测定48 h后使用PeproTech ELISA开发工具根据制造商的指示。

研究CL由星形胶质细胞分泌的细胞毒素的影响,400年μl收集U118毫克星形细胞上清液转移到独立的井包含SH-SY5Y神经元细胞被镀24小时前的浓度 细胞在400 /毫升μl DMEM-F12含有抗生素和哥伦比亚广播公司(CBS)的5%。72 h孵化后,神经细胞生存能力MTT试验测定。的可行性U118 MG星形细胞MTT试验也评估结束时48 h与CL潜伏期,刺激,或tak - 242。

2.4。评估细胞生存能力

细胞生存能力是MTT试验监测,测量了减少肝癌的不溶性紫色甲瓒产品可行的细胞(26,27]。细胞培养与MTT(0.5毫克/毫升)37°C h公司5%2孵化器。结果甲瓒晶体溶解了添加SDS的体积20% (w / v) / N, N-dimethylformamide (50% v / v)解决方案相同的培养基中,然后孵化板块3 h。光密度测量在570 nm使用FLUOstarω标。

2.5。突触体的制备

原油synaptosomal分数得到成人的大脑C57BL / 6 ncrl野生型小鼠(如前所述)(28]。简单地说,一个组织研磨机是用来使类同一个大脑裂解缓冲(pH值7.5)包含0.32蔗糖,5毫米玫瑰,蛋白酶抑制剂鸡尾酒(罗氏,米西索加、加拿大)。匀浆在1000 g离心10分钟,在4°C。上层清液的收集和离心10分钟在12000 g,在4°C。包含原油突触体的颗粒在PBS resuspended,储存在-80°C。的存在突触标记psd - 95在synaptosomal准备演示了用免疫印迹。突触体是沾CellBrite®640年修复555或修复。彩色synaptosomal准备在PBS一夜之间被透析4°C,以消除剩余的染料的准备。

2.6。吞噬人类U118 MG星形细胞的活动,主要小鼠星形胶质细胞

吞噬活动评估与少量修改(如前所述29日]。人类U118 MG星形细胞在poly-D-lysine-coated镀,四腔培养皿的密度 细胞在500 /毫升μl DMEM-F12含有抗生素和哥伦比亚广播公司(CBS)的5%。小鼠星形胶质细胞板的密度 细胞在DMEM /毫升含有抗生素,10%的边后卫。48小时后,CL (20μg / ml)或其车辆的解决方案是添加到细胞培养。48小时孵化后,与500年文化传媒所取代μl新鲜的媒体。10μl(稀释突触体悬架(1:5股票)或1μ米直径外部FITC-labeled乳胶珠子(10:1珠细胞比率)补充道,和细胞培养是培养2或一个h,分别在37°C。后两个洗一毫升PBS, U118 MG星形细胞单一栽培可视化通过增加300人μl一μg / ml德克萨斯红膜染色五分钟紧随其后的是一个洗涤步骤一毫升PBS。在成像之前,bisbenzimide(两个μg / ml)核染色在500年被添加到所有井μl PBS。主要包含少量的小胶质细胞星形胶质细胞文化以来,GFAP免疫染色进行可视化星形胶质细胞。星形胶质细胞培养与4%多聚甲醛固定在PBS和permeabilized使用0.1% Triton x - 100。与PBS细胞被洗了两次,一个阻塞的解决方案包含2.5% BSA和0.02% Triton x - 100添加了一小时在室温下。细胞被孵化的anti-GFAP抗体(1:2000稀释)一夜之间在4°C在同一个阻塞的解决方案。星形胶质细胞被洗了三次PBS和孵化与山羊anti-rabbit CY5——或者CY3-labeled抗体(1:1000稀释)在溶液中含有2.5% BSA和1%山羊血清h在室温下。细胞被洗PBS和沾bisbenzimide前成像。蔡司AxioObserver细胞成像。与禅宗Z1宽视野显微镜数字化的图像采集软件(版本2.0)量化荧光的激发/发射bisbenzimide 365/445 nm, 474/537 nm的荧光珠,620/670 nm CY5, 545/605 nm CY3, 585/615 nm德克萨斯红膜染色,555/605 nm CellBrite®555年修复。荧光强度是计算总纠正细胞荧光(CTCF)。 The engulfment of fluorescent beads and synaptosomes was confirmed with a Leica TCS SPE-II confocal microscope (Leica Microsystems; Concord, ON, Canada). Images shown were generated by the accompanying LAS X software (version 3.5.5)

2.7。免疫印迹GFAP U118毫克细胞溶解产物

镀U118 MG星形细胞和治疗如前所述2。3。48 h后,收集细胞上清液,细胞被洗一次PBS和细胞溶解radioimmunoprecipitation分析缓冲区(里帕缓冲:150毫米氯化钠,50毫米三,特里同x - 100 1%, 0.5%钠脱氧胆酸盐,0.1%十二烷基硫酸钠(SDS), 1 x完成™迷你蛋白酶抑制剂的鸡尾酒,pH值8.0)。蛋白质在细胞溶解产物的浓度测量使用皮尔斯™bicinchoninic酸(BCA)蛋白质化验(费舍尔科学)。蛋白质样品被稀释在缓冲区里帕等于浓度(100μg / ml),稀释在同等体积的Laemmli缓冲区(0.125米三,0.1德勤,20%甘油、4% SDS, 0.004%溴酚蓝),在90°C和加热四分钟。2μg蛋白质被加载到12%的聚丙烯酰胺凝胶。在硝化纤维膜电泳后,蛋白质被转移。疣状膜被封锁后执行5%的脱脂奶粉Tris-buffered盐水- (TBS)渐变(150毫米氯化钠,10毫米三,0.2% Tween-20, pH值8.0)。隔夜孵化在4°C兔子anti-GFAP抗体(1:1000稀释),兔抗β肌动蛋白抗体(1:1000稀释)稀释在w / v脱脂奶粉5% TBS-Tween随后暴露在anti-rabbit HRP-linked抗体(1:1000稀释)为一个h和SuperSignal™西方Pico +增强化学发光试剂(ECL)五分钟。应用蛋白质可视化使用Fluorchem®FC2 AlphaView Q 3.2.2.0凝胶图像系统采集软件(美国细胞生物科学,圣克拉拉,CA)。ImageJ 1.53凝胶分析功能的软件(美国国立卫生研究所)是用来量化数据。

2.8。表达式的TLR - 4 U118 MG星形细胞

表达式的TLR - 4 U118 MG星形细胞测量如前所述[27]。细胞被镀在96 -孔板 细胞在250 /毫升μl DMEM-F12含有抗生素和哥伦比亚广播公司的5%,紧随其后的是一个24小时的潜伏期,允许他们的坚持。两个井用于每个实验条件。CL (20μg / ml)或其车辆的解决方案是添加到培养基,其次是有限合伙人15分钟以后。48小时的潜伏期后,上层清液被移除,细胞被固定空气干燥30分钟。板块在室温下孵化与3% BSA在PBS 2 h,洗了三次与PBS和孵化单克隆抗体反TLR - 4(1: 100稀释)在3% BSA在PBS h。盘子洗了三次PBS和孵化与山羊anti-mouse免疫球蛋白碱性phosphatase-conjugated抗体(1:3000稀释)在3% BSA在PBS h。与PBS洗涤三次后,在0.1毫克/毫升的磷酸酶底物二乙醇胺缓冲(pH值9.8)被添加到细胞培养。光密度测量在405 nm 2 h后使用FLUOstarω标。光密度信号在每个被归一化蛋白质浓度在同一测量由BCA化验。

2.9。数据分析

数据分析使用(1)学生的 测试或(2)随机区组设计的方差分析(方差分析),其次是Dunnett或图基的因果检验。,被定义为独立的实验分析在不同的日子里进行。数据了 (SEM)。建立了统计学意义 。

3所示。结果

3.1。CL减少人类U118 MG Astrocyte-Like细胞介导细胞毒性对SH-SY5Y神经元细胞

炎症介质释放的反应性星形胶质细胞可以在周围的神经元毒性作用导致广告的大脑神经退化观察(30.]。一项研究表明CL减少microglia-like细胞向神经细胞的细胞毒性15];因此,我们调查这个磷脂是否能减少星形细胞的细胞毒素的释放。图1说明了减少的可行性SH-SY5Y上层清液中细胞孵化U118 MG与LPS刺激星形细胞(图1(一))或干扰素-γ+ il - 1β(图1 (c))相比,神经元细胞暴露于上层清液从如果星形细胞(图1 (e))。CL添加在20μg / ml之前与LPS刺激U118 MG星形细胞逆转他们的上层清液的细胞毒性效应(图1(一))。这种抑制作用的CL并非由于减少的可行性U118 MG星形细胞(图1 (b))。CL也没有增加的可行性SH-SY5Y细胞暴露于上层清液从如果U118 MG细胞(图1 (e))。CL不抑制细胞毒性的干扰素-γ+ il - 1β刺激U118毫克星形细胞向SH-SY5Y神经细胞(图1 (c)),不影响干扰素的可行性γ+ il - 1β刺激U118 MG星形细胞(图1 (d))。CL小但LPS-stimulated可行性的重要积极作用,如果U118 MG细胞(数字1 (b)和1(f))。

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图1
人类U118毫克的氯对细胞毒性的影响对人类SH-SY5Y星形细胞神经元细胞。CL单独或其浓度增加车辆的解决方案是添加到U118 MG星形细胞培养(e, f),或添加了CL 15分钟之前曝光的星形细胞有限合伙人(400 ng / ml) (a, b)或干扰素-的组合γ(400 U /毫升)+ il - 1β(20 pg / ml) (c, d)。48 h后,U118 MG细胞上清液转移到SH-SY5Y神经元细胞培养,和星形细胞的生存能力(b, d, f) MTT试验测定。72 h后接触U118 MG星形细胞上清液,SH-SY5Y可行性(a, c, e)用MTT试验测量。所有的数据(提交 )在这个图归一化对细胞生存能力值(显示为虚线)从U118毫克细胞暴露在CL溶剂(乙醇1%)(b, d, f)或SH-SY5Y上层清液中细胞孵化U118 MG星形细胞暴露在CL溶剂(a, c, e)。 和 根据Dunnett因果检验。 和 值单向方差分析显示随机块。
3.2。CL移植人类U118毫克的吞噬活动主要星形细胞和小鼠星形胶质细胞

自CL是移植人类和鼠小胶质细胞的吞噬活性(15,17),我们评估如果这磷脂对星形胶质细胞可能有类似的影响。细胞处理汽车解决方案相比,CL单独调节荧光乳胶颗粒的吞噬U118 MG星形细胞(图2(一个))和原发性鼠星形胶质细胞(图2 (b))。此外,吞噬作用的成年小鼠脑源性突触体小鼠星形胶质细胞也调节了CL(图2 (c))。吞没的珠子和突触体GFAP-positive主要星形胶质细胞是证实了共焦显微镜(数字2 (d)和2 (e))。

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图2
CL的吞噬活动的影响U118 MG星形细胞(a)和原发性鼠星形胶质细胞(b, c), CL (20μg / ml)或其车辆的解决方案是添加到U118 MG细胞或原代小鼠星形胶质细胞培养48 h,其次是孵化与荧光乳胶珠子(a, b)或突触体(c),随机选择99 - 369细胞的荧光强度( )提出了从四个独立实验在不同的日子里进行修正总细胞荧光。细胞的选择和分析,荧光蒙蔽的方式进行。 和 根据未配对的学生的 - - - - - -测试。代表共焦图像确认FITC-labeled乳胶的吸收珠子(d)和CellBrite™解决640 -标记突触体(e) GFAP-positive主要显示小鼠星形胶质细胞;酒吧规模代表25μm。
3.3。CL增加会使LPS-Induced GFAP的表达,结合有限合伙人,移植il - 1的分泌β由U118 MG星形细胞

在慢性神经炎症,星形胶质细胞变得被动。星形胶质细胞的表型和功能状态的特征是一个调节中间丝蛋白(GFAP的表达31日]。我们调查是否CL防止upregulation GFAP蛋白水平U118 MG星形细胞接触后有限合伙人或干扰素-γ+ il - 1β作为强有力的免疫刺激作用,通过不同的受体与不同的信号通路。数据3(一个)和3 (c)证明,有限合伙人仅由U118 MG星形细胞调节GFAP的表达相比,如果细胞和细胞治疗CL。的CL显著地抑制这种LPS-induced GFAP表达增加(图3(一个))。

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图3
CL GFAP的表达的影响(a)和il - 1的分泌β(b)由人类U118 MG星形细胞。CL (20μg / ml)或其车辆的解决方案是添加到U118 MG细胞培养前15分钟接触有限合伙人(400 ng / ml)或汽车解决方案。48小时后,免疫印迹进行使用细胞溶解产物(a),和il - 1β在细胞上清液浓度测量的ELISA (b)。数据( )表示为折叠蛋白质含量的变化与控制细胞生长介质只暴露并归一化β肌动蛋白(a)。提出了ELISA检测极限的虚线(b)。 和 根据图基的因果检验。 和 值单向方差分析显示随机块。代表乐队应用GFAP和β肌动蛋白从每个治疗组(c)所示。Uncropped免疫印迹图像作为补充图提供1。

CL,抑制LPS-induced upregulation GFAP牵连TLR - 4作为可能的星形细胞外CL的目标。激活TLR - 4可以上调il - 1的分泌β由人类星形胶质细胞(22]。我们假设CL作用于TLR - 4会影响il - 1的分泌β由U118 MG星形细胞。图3 (b)表明虽然CL独自没有诱导il - 1的分泌βU118 MG星形细胞,其结合有限合伙人造成重大upregulation il - 1β分泌相比,如果细胞以及细胞与LPS刺激。

3.4。CL会使TLR 4表达U118 MG星形细胞

Myd88-independent信号与TLR - 4是诱发内吞作用,进而导致退化的受体(32,33];因此,我们测量的表达由U118 TLR - 4毫克星形细胞接触后CL。图4(一)表明TLR 4水平明显下降U118 MG细胞暴露于细胞外CL相比对待汽车解决方案。然而,与细胞外CL预处理没有进一步下调TLR - 4的表达LPS-stimulated U118 MG星形细胞(图4 (b))。

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图4
CL TLR - 4的表达的效果,如果(a)和LPS-stimulated人类U118 MG星形细胞(b)。CL (20μg / ml)或其车辆的解决方案是添加到U118 MG星形细胞培养前15分钟接触有限合伙人(400 ng / ml)或其汽车解决方案。48小时后,TLR - 4蛋白水平测定免疫染色。产生的化学发光信号归一化蛋白质浓度在每一个。数据( )提出了归一化的比率从未经处理的控制细胞化学发光信号。 根据学生的配对 - - - - - -测试。
3.5。CL诱导的分泌由人类U118 MCP-1 MG星形细胞血清介质

MCP-1和IP-10分泌,连同其他促炎细胞因子il - 1等β、il - 6和TNF -α后,星形胶质细胞的激活TLR - 4 (20.- - - - - -22]。他们也调节在广告脑组织和脑脊液,分别为(34,35]。我们假设CL上调MCP-1的分泌和IP-10以来人类星形细胞相似的效果已经被报道为人类microglia-like细胞也表达TLR - 4 (17]。图5(一个)表明CL单独调节分泌的MCP-1 U118 MG星形细胞。此外,虽然不重要,有一个趋势减少MCP-1分泌CL时添加到LPS-stimulated U118 MG星形细胞(图5 (b))。对干扰素- CL没有影响γ+ il - 1β全身的分泌MCP-1或U118 MG星形细胞的生存能力在所有条件下的实验数据5 (c)和5 (d))。CL独自没有影响的分泌IP-10 U118 MG星形细胞(数据没有显示)。初步获得的数据多元分析表明暴露U118 MG细胞单独CL 48 h也可能导致低水平的il - 1的分泌β、il - 6和TNF -α;然而,这些影响是不显著的有限数量的观察(数据未显示);因此,后续实验集中在分泌的MCP-1 U118 MG细胞。

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图5
CL的效果对人类U118 MG星形细胞MCP-1分泌(a) - (c)和血清介质的可行性(d)。CL或其浓度增加车辆的解决方案是添加到U118 MG星形细胞培养(a, d),或添加了CL前15分钟接触有限合伙人(400 ng / ml) (b)或干扰素-的组合γ(400 U /毫升)+ il - 1β(20 pg / ml) (c), 48 h后MCP-1浓度在细胞上清液由ELISA测定,和U118毫克的可行性星形细胞MTT试验测定。数据了 。细胞生存能力得到的归一化值(d) U118 MG文化不暴露于氯或其汽车解决方案。 根据Dunnett因果检验。 和 值单向方差分析显示随机块。提出了ELISA检测极限的虚线。
3.6。在无血清条件下CL调节MCP-1分泌

调查是否CL的载体蛋白,存在于血清中,包括哥伦比亚广播公司(14CL),需要调节星形胶质细胞免疫功能,我们评估的影响CL MCP-1分泌U118 MG星形细胞在无血清条件。CL单独调节分泌的MCP-1 U118 MG星形细胞(图6(一))。此外,CL显著降低MCP-1的分泌LPS-stimulated U118 MG星形细胞(图6 (b)),但没有影响MCP-1分泌的干扰素-γ+ il - 1β刺激U118 MG星形细胞(图6 (c))。在上述三个实验条件做了CL减少U118 MG星形细胞的生存能力(数据没有显示)。

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(c)
图6
CL的效果对人类U118 MG星形细胞在无血清培养基MCP-1分泌。CL或其浓度增加车辆的解决方案是添加到U118 MG星形细胞培养(a),或添加了CL前15分钟接触有限合伙人(400 ng / ml) (b)、干扰素-的组合γ(400 U /毫升)+ il - 1β(20 pg / ml) (c), 48 h后MCP-1的浓度在细胞上清液由ELISA测定。数据了 。 和 根据Dunnett因果检验。 和 值单向方差分析显示随机块。提出了ELISA检测极限的虚线。
3.7。CL诱导的分泌由人类U118 MCP-1毫克TLR 4-Dependent星形细胞的方式

与nonastrocytic硅片和体外研究细胞与TLR - 4受体结合的细胞外CL (16,17,24]。上面的数据显示CL LPS-stimulated细胞的选择性抑制作用U118毫克TLR - 4表达的差别,对这些细胞暴露于氯表示之间的交互这磷脂和星形TLR 4。直接证实了这一点,我们调查是否CL-induced MCP-1分泌物的分泌U118 MG星形细胞被TLR 4-specific拮抗剂抑制tak - 242。类似于上述实验,CL单独调节的分泌MCP-1 U118 MG星形细胞在两种血清(图7(一))和血清(图7 (b))中。这些效应的抑制了CL tak - 242(数字7(一)和7 (b))。tak - 242的没有显著影响MCP-1 U118 MG星形细胞分泌。tak - 242单独或结合CL并不影响U118 MG星形细胞的可行性根据MTT测定血清(图所示7 (c))和血清(图7 (d))中。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
(d)
(d)
图7
TLR 4-specific拮抗剂tak - 242的作用在CL-induced分泌MCP-1由人类U118 MG星形细胞和血清的可行性(a、c)和血清(b, d)媒体。tak - 242 (10μ米)被添加到U118 MG星形细胞暴露在CL之前30分钟。48小时后,MCP-1的浓度在细胞上清液由ELISA测定,和U118毫克的可行性星形细胞MTT试验测定。数据了 。细胞生存能力(c, d)是归一化值获得U118 MG文化不暴露在CL, tak - 242,或他们的汽车解决方案。 和 根据图基的因果检验。 和 值单向方差分析显示随机块。提出了ELISA检测极限的虚线。

4所示。讨论

除了建立了细胞内的角色作为一个线粒体膜磷脂、CL作为生物活性分子在细胞间隙,它可以调节免疫细胞的功能,包括外围的巨噬细胞和小胶质细胞在中枢神经系统15- - - - - -17,24]。我们的研究首次表明,细胞外CL调节星形胶质细胞的免疫功能,选择一种中枢神经系统细胞也参与调节神经免疫反应。我们证明了CL上调吞噬活动的主要鼠星形胶质细胞和复杂的调节影响人类病患GFAP表达和吞噬细胞的激活状态评估的活动以及他们的分泌细胞因子和细胞毒素。关于复杂的CL在星形胶质细胞的免疫调节作用,这种磷脂(1)会使分泌的细胞毒素和MCP-1 LPS-stimulated人类U118 MG星形细胞,(2)移植吞噬人类星形细胞的活动,主要小鼠星形胶质细胞,(3)防止upregulation LPS-stimulated GFAP的细胞,和(4)诱导分泌的细胞因子MCP-1和il - 1β,但不是IP-10。我们的研究也引起星形胶质细胞TLR - 4作为细胞外CL分子的目标之一。

类似于小胶质细胞、星形胶质细胞分泌细胞因子和细胞毒素免疫刺激,以及显示吞噬活动(36,37]。我们的观察,CL抑制分泌的细胞毒素LPS-activated U118 MG星形细胞类似于先前的研究显示,由人类THP-1 CL减少细胞毒素的分泌单核细胞的细胞作为模型的小胶质细胞(15,17]。细胞毒素的调节分泌U118 MG星形细胞可以归因于从稳态反应过渡状态(审查,看3])。我们的数据显示调节GFAP表达U118 MG在LPS刺激星形细胞支持这一假说。自分泌细胞外CL抑制细胞毒素和MCP-1和块upregulations GFAP当添加有限合伙人之前,这种磷脂可能防止星形胶质细胞的过渡从稳态反应状态,可在中枢神经系统神经炎症条件下产生有益的影响。

胶质细胞吞噬活动是至关重要的神经炎症的决议,和吞噬作用特异表达促进神经退化5,9,38- - - - - -40]。小胶质细胞是中枢神经系统的吞噬细胞建立和监管的吞噬活动是有据可查(审查,看41]);同时,很少有人了解分子调节星形胶质细胞吞噬活动,尽管他们吞噬颗粒的能力成为有目共睹的(42,43]。我们观察到CL上调U118 MG星形细胞的吞噬功能和主要鼠星形胶质细胞表明磷脂的另一个有益的功能。这phagocytosis-inducing CL对星形胶质细胞的影响类似于之前报道upregulation CL和吞噬作用的脂质体含有CL在小胶质细胞和RAW264.7小鼠巨噬细胞,分别为(15- - - - - -17]。在这些先前的研究,吞噬活动评估通过测量吞没的乳胶珠子或CL-containing脂质体,我们还证明CL吞没移植的小鼠大脑突触体小鼠原发性星形胶质细胞,表明这个观察生理相关和不相关工件乳胶颗粒的吞噬作用。

正如上面提到的,细胞外CL已经被证明能够调节细胞因子的分泌小胶质细胞和巨噬细胞外围。我们延长细胞类型的列表,CL影响通过展示这种磷脂诱发MCP-1和il - 1的分泌β由U118 MG星形细胞。我们的观察,结合CL和有限合伙人需要重大upregulation il - 1β由人类星形细胞分泌符合Dozio和桑切斯的研究22]只观察到引起LPS的适度增长由人类原发性星形胶质细胞分泌的细胞因子。虽然CL本身已经证明移植释放IP-10由人类THP-1单核细胞的细胞(17),这个不诱导细胞因子的分泌U118 MG星形细胞。因此,CL对炎性细胞因子分泌的影响似乎特异性(44,45]。此外,CL展品immune-modulating效应细胞的激活依赖的方式。例如,我们的研究表明CL减少MCP-1的分泌immune-stimulated星形细胞。然而,当管理如果细胞,CL诱导细胞因子的分泌。同样,微分CL对免疫刺激的影响,如果巨噬细胞和小胶质细胞已报告之前MCP-1和IP-10 [15,24]。

大部分的实验研究中使用细胞培养介质,包括哥伦比亚广播公司。血清含有氯的自然载体蛋白,β2-glycoprotein 1(也称为载脂蛋白H),这可能需要对某些生理功能的细胞外CL (14]。因此,我们调查了CL在这项研究中观察到的影响是否依赖血清在媒体的存在,当我们不会期待这个血浆蛋白在细胞外空间的脑实质。我们证明CL的分泌的影响由U118 MCP-1 MG星形细胞不依赖于哥伦比亚广播公司(CBS)的存在,表明免疫调节效应的CL不需要这个特定的载体蛋白的存在。我们的观察是类似于先前的研究证明TLR - 4受体激动剂有限合伙人不需要载体蛋白出现在哥伦比亚广播公司(CBS)诱导从IC-21小鼠巨噬细胞分泌的细胞因子46]。然而,我们所知,载体蛋白尚未评估的必要性之前的任何细胞外CL的影响。

TLR - 4的角色之一,星形胶质细胞上的受体介导细胞外的影响CL支持以下我们的观察:(1)CL抑制分泌的细胞毒素和MCP-1星形胶质细胞与TLR - 4配体LPS刺激,但不是干扰素-的组合γ+ il - 1β作用于不同的受体,(2)CL结合LPS诱导的分泌il - 1β,与TLR - 4激活(22),(3)CL本身会使星形胶质细胞TLR - 4表达,和(4)CL-induced分泌MCP-1被TLR 4-specific拮抗剂tak - 242。这些观察结果支持先前的研究中,TLR - 4已经证明调解细胞外CL对小胶质细胞的影响,巨噬细胞和单核细胞的细胞。淘汰赛的TLR - 4来源于小鼠巨噬细胞的骨破坏CL-induced增加TNF -α分泌(24]。此外,文策尔et al。17]证明TLR 4介导CL-induced MCP-1由主要鼠小胶质细胞和分泌THP-1单核细胞的细胞,以及他们吞噬活动。类似于我们的观察,CL减少TLR - 4的表达,但马里内利et al。47]证明toll样受体激动剂,包括强大的TLR - 4受体激动剂LPS,调节TLR - 4的表达小胶质细胞和星形胶质细胞在一定程度上。综上所述,我们的数据可能表明CL抑制LPS的影响通过减少星形胶质细胞表达的TLR - 4分子的数量,这是一种现象,其他TLR - 4受体激动剂如1 z105 1 z88 [48]。即使有强有力的证据表明TLR - 4 CL星形胶质细胞上的分子目标以及其他类型的细胞,有可能抑制效果的CL LPS-induced释放MCP-1由星形细胞和细胞毒素是由其他机制。例如,CL可以调节的生产小分子核糖核酸抑制TLR - 4激活下游信号事件,进而减少细胞因子分泌(审查,看49])。

总体而言,或研究表明,细胞外CL可能有益免疫调节对星形胶质细胞的影响通过抑制他们的过渡到一个被动的状态,减少分泌细胞毒素并选择炎症介质,并上调吞噬活动。这些影响被使用培养的星形细胞和观察,因此,需要体内之前确认CL可以被视为一种biotherapeutic剂治疗神经炎症疾病,比如广告。这尤其重要,因为众所周知,星形胶质细胞表现出不同的表型和功能反应的小胶质细胞(50]。

5。结论

先前的研究已经表明CL调节细胞因子的分泌和免疫细胞吞噬活性,包括外围巨噬细胞和小胶质细胞15- - - - - -17]。我们的研究扩展了的细胞类型列表CL与通过揭示这种磷脂调节选择星形胶质细胞的免疫功能,而这活动是介导的,至少部分,TLR 4。重要的是,我们的数据表明,细胞外CL行为即使没有它的自然载体蛋白,β2-glycoprotein 1,表明CL在大脑中可能具有生物活性的蛋白质在生理条件下不存在。CL和CL-containing脂质体已经被认为是可能的药物治疗炎症性疾病的外围组织以及中枢神经系统(15- - - - - -17]。我们的研究支持这种治疗策略通过识别星形胶质细胞的潜力作为一个关键的细胞类型有益影响细胞外CL。

数据可用性

的数据支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

世界e·默里和泰勒j .文策尔贡献了同样的工作。

确认

我们感谢p·巴克博士的实验室使用的荧光显微镜数字化和c·理查兹与图像分析寻求帮助。这项研究是杰克布朗和家族的赠款支持阿尔茨海默氏症研究基金会、加拿大自然科学和工程研究委员会,和不列颠哥伦比亚的欧垦那根大学的校园。

补充材料

补充图1:代表免疫印迹显示CL和GFAP的表达的影响β肌动蛋白由人类U118 MG星形细胞。(补充材料)